mTIGIT-mLumin跨膜融合蛋白慢病毒載體和真核表達(dá)載體的構(gòu)建及體外的穩(wěn)定表達(dá)

王晶哲， 王小鈴， 王娟， 楊鑫鑫， 閆美娜， 李欣悅， 王薈， 劉霞， 邵啟祥

(江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

T細(xì)胞免疫球蛋白和免疫受體酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif，ITIM)結(jié)構(gòu)域蛋白(T cell Ig and ITIM domin，TIGIT)是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的具有免疫抑制作用的共刺激分子，是NK和T細(xì)胞共有的抑制性受體[1]；其是由244個(gè)氨基酸殘基組成的Ⅰ型跨膜蛋白，含有一個(gè)IgV樣結(jié)構(gòu)域的胞外段、一個(gè)跨膜區(qū)及一個(gè)含ITIM的胞內(nèi)段[2]。TIGIT能夠與CD226競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合脊髓灰質(zhì)炎病毒受體(poliovirus receptor，PVR，即CD155)從而抑制T細(xì)胞的活化，TIGIT與PVR結(jié)合的親和力遠(yuǎn)高于CD226。PVR主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞表面[3-4]。TIGIT與樹突狀細(xì)胞表面的PVR結(jié)合后促進(jìn)IL-10表達(dá)，抑制IL-12(p40)表達(dá)[5]。研究表明，TIGIT與自身免疫性腦脊髓炎(EAE)等多種自身免疫性疾病有關(guān)[6]。研究發(fā)現(xiàn)PD-1/PDL-1/2抗體治療會(huì)出現(xiàn)耐藥，而耐藥的主要原因是腫瘤微環(huán)境表達(dá)大量的TIGIT等負(fù)向調(diào)節(jié)分子[7-8]，因此深入闡明TIGIT等分子的生物學(xué)功能，研發(fā)其阻斷型抗體進(jìn)行臨床腫瘤治療就顯得尤為迫切。

mLumin是華中科技大學(xué)武漢國(guó)家光電實(shí)驗(yàn)室(籌)駱清銘和張智紅教授通過(guò)基因重組構(gòu)建的一種新型的紅色熒光蛋白，發(fā)射波長(zhǎng)為621 nm[9]。mLumin的組織穿透能力強(qiáng)，并且光譜串?dāng)_比較小[10]，所以是一種良好的熒光蛋白?？乖砦粚?duì)抗體的制備具有重要意義，本研究擬建立一個(gè)能夠用于蛋白質(zhì)在細(xì)胞膜表面表達(dá)的通用載體，為此我們選擇TIGIT作為靶分子，構(gòu)建其胞外序列、跨膜區(qū)和mLumin表達(dá)載體，為后期篩選陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞、流式細(xì)胞術(shù)分選目標(biāo)細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)C57BL/6小鼠，6～8周，雄性，本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：No.201708296。

1.1.2 主要試劑和儀器 人腎上皮HEK-293T細(xì)胞為我院許文榮教授惠贈(zèng)；非洲綠猴腎成纖維Cos7細(xì)胞由我院錢海老師惠贈(zèng)，細(xì)胞培養(yǎng)于37 ℃，5% CO2和含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中。plenti-puro慢病毒質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室杜鳳移老師贈(zèng)送；pcDNA3.1-mLumin紅色熒光蛋白質(zhì)粒由華中科技大學(xué)武漢光電國(guó)家實(shí)驗(yàn)室張智紅教授惠贈(zèng)。PrimeSTAR DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶(HindⅢ，BamHⅠ，XbaⅠ，XhoⅠ)、T4DNA連接酶、DL2000 DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物和Trizol為TaKaRa公司產(chǎn)品；PCR引物、DNA膠回收試劑盒和DNA純化試劑盒購(gòu)自上海生工生物技術(shù)有限公司；LipfectamineTM2000 (Invitrogen公司)；S1000TMThermal Cycler PCR儀(Bio-Rad公司)；恒溫培養(yǎng)搖床QYC-211(上海福馬實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；熒光倒置顯微鏡(德國(guó)Zeiss公司)；TCS SP5Ⅱ共聚焦顯微鏡(德國(guó)Leica公司)。

1.2 方法

1.2.1 plenti-puro-mTIGIT-mLumin和pcDNA-mTIGIT-mLumin載體的構(gòu)建與鑒定

1.2.1.1 mTIGIT胞外段、跨膜區(qū)和mLumin基因序列特異性引物設(shè)計(jì) 檢索NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)和Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)(http:∥www.uniprot.org/)，獲得小鼠mTIGIT胞外段及跨膜區(qū)的cDNA序列。搜索數(shù)據(jù)庫(kù)查找mLumin序列。按照序列設(shè)計(jì)引物后在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)上進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)載體上可用的限制性內(nèi)切酶加于引物兩端并選擇特定的保護(hù)性堿基。

因?yàn)閜lenti-puro和pcDNA3.1的載體不同，根據(jù)載體酶切位點(diǎn)的不同設(shè)計(jì)2對(duì)mTIGIT特異性引物和mLumin特異性引物。合成的引物序列見表1(表中下劃線表示酶切位點(diǎn))。

1.2.1.2 小鼠脾臟細(xì)胞RNA的提取 采用CO2麻醉處死C57BL/6小鼠，無(wú)菌眼科鑷剪取脾；用無(wú)菌 PBS沖洗后剪碎，并輕輕吹打，200目篩網(wǎng)過(guò)濾；PBS洗2次，棄上清液；加入紅細(xì)胞裂解液作用8 min；4 ℃，1 500 r/min離心5 min，PBS洗滌2次，棄上清液；加入1 mL Trizol裂解細(xì)胞，按照說(shuō)明書提取總RNA。

1.2.1.3 mTIGIT和mLumin序列的擴(kuò)增、純化和回收 取脾細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用PCR技術(shù)獲得目的序列并回收。mLumin序列經(jīng)PCR擴(kuò)增后進(jìn)行膠回收。

表1 mTIGIT基因和mLumin基因的PCR引物

1.2.1.4 目的基因與載體進(jìn)行酶切、連接、轉(zhuǎn)化、篩選 將獲得的mLumin序列與對(duì)應(yīng)的載體用限制性核酸內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切；經(jīng)T4連接酶連接后轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)擴(kuò)增；搖床37 ℃振蕩12～16 h，提取質(zhì)粒；再以提取的質(zhì)粒為載體與mTIGIT序列進(jìn)行雙酶切；再次連接之后轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)擴(kuò)增，提取質(zhì)粒；將提取的質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定和測(cè)序鑒定，利用PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析對(duì)比。

1.2.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞及熒光鑒定

1.2.2.1 熒光顯微鏡檢測(cè)plenti-puro-mTIGIT-mLumin重組質(zhì)粒 將重組質(zhì)粒與pspax、pMD2.0G(3 ∶2 ∶1)用無(wú)血清DMEM共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞8～12 h，然后換成10%胎牛血清DMEM完全培養(yǎng)基，分別收取24 h和48 h的病毒上清液；再將病毒與含血清培養(yǎng)基按1 ∶1的比例加入新的HEK-293T細(xì)胞，感染24～48 h，用熒光顯微鏡檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)。

1.2.2.2 共聚焦顯微鏡檢測(cè)pcDNA3.1-mTIGIT-mLumin重組質(zhì)粒 pcDNA3.1-mTIGIT-mLumin重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Cos7細(xì)胞(方法同“1.2.2.1”)，48 h之后加入G418至1 mg/mL，篩選獲取陽(yáng)性克隆，并在共聚焦顯微鏡下觀察融合蛋白的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 mTIGIT和mLumin基因的克隆

針對(duì)plenti-puro載體設(shè)計(jì)mTIGIT和mLumin的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為689 bp和751 bp，酶切位點(diǎn)分別為HindⅢ、BamHⅠ和XbaⅠ。針對(duì)pcDNA3.1載體的產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為689 bp和746 bp，酶切位點(diǎn)分別為BamHⅠ，XhoⅠ和XbaⅠ。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示，出現(xiàn)的目的條帶位置與預(yù)期一致。表明PCR擴(kuò)增的基因克隆正確，見圖1。

M：DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物；N：空白對(duì)照；T：mTIGIT擴(kuò)增產(chǎn)物；L：mLumin擴(kuò)增產(chǎn)物；A：mTIGIT(plenti-puro載體)；B：mLumin(plenti-puro載體)；C：mTIGIT(pcDNA3.1載體)；D：mLumin(pcDNA3.1載體)

2.2 plenti-puro-mTIGIT-mLumin和pcDNA3.1-mTIGIT-mLumin質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

2.2.1 plenti-puro-mTIGIT質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定以及測(cè)序結(jié)果對(duì)比分析，plenti-puro-mTIGIT-mLumin質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖2)。

2.2.2 pcDNA3.1-mTIGIT-mLumin質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(cè)和測(cè)序結(jié)果比對(duì)分析，證實(shí)pcDNA3.1-mTIGIT-mLumin質(zhì)粒構(gòu)建成功。見圖3。

2.3 兩種載體均能很好地表達(dá)于目的細(xì)胞胞膜

目的基因mTIGIT-mLumin融合蛋白定位于細(xì)胞膜表面，而只攜帶mLumin基因的質(zhì)粒其蛋白則表達(dá)于整個(gè)細(xì)胞(為了可以與陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行對(duì)比，圖片拍于未用puromycin篩選前)。見圖4。

利用熒光顯微鏡和共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察，確認(rèn)mTIGIT-mLumin融合蛋白成功表達(dá)于Cos7細(xì)胞表面。見圖5。

M：DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物；P：載體酶切產(chǎn)物；T-L：mTIGIT-mLumin融合基因；A：plenti-puro載體的雙酶切產(chǎn)物電泳圖；B：mTIGIT-mLumin融合基因陽(yáng)性質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果；C：mTIGIT-mLumin融合基因陽(yáng)性質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果；D：測(cè)序結(jié)果

M：DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物；P：載體酶切產(chǎn)物；T-L：mTIGIT-mLumin融合基因；A：pcDNA3.1載體的雙酶切電泳圖；B：mTIGIT-mLumin融合基因陽(yáng)性質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果

圖4 對(duì)照質(zhì)粒及plenti-puro-mTIGIT-mLumin質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞結(jié)果(200×)

3 討論

近來(lái)CAR-T和PD-1/PDL-1抗體的免疫生物治療取得了突破性進(jìn)展，淋巴瘤治療總體有效率達(dá)到50%～60%[1-2]。但在治療中出現(xiàn)了耐PD-1/PDL-1抗體的現(xiàn)象，通過(guò)深入研究發(fā)現(xiàn)這些患者的腫瘤微環(huán)境表達(dá)大量的TIGIT、LAG3和TIM3等[8]。TIGIT主要表達(dá)于NK和T細(xì)胞，其抑制NK細(xì)胞毒作用，引起T細(xì)胞的耗竭和增強(qiáng)Treg的功能[11-12]。研究證明抑制TIGIT有利于促進(jìn)抗腫瘤免疫治療[11,13]。共同阻斷PD-1和TIGIT時(shí)，能明顯恢復(fù)其抗腫瘤的CD8+T細(xì)胞的活性[14]。

圖5 重組質(zhì)粒融合蛋白的表達(dá)

以往抗體的制備除了采用天然抗原外，還采用基因工程蛋白作為抗原的主要來(lái)源，而抗體的產(chǎn)生與抗原的功能性表位密切相關(guān)。目前基因工程表達(dá)的蛋白多來(lái)源于原核的工程菌，缺乏糖基化，而糖基化對(duì)抗原決定簇的性質(zhì)影響很大，故導(dǎo)致許多表位的缺失。即使采用畢赤酵母等進(jìn)行表達(dá)，其添加的寡糖只有甘露糖殘基，而動(dòng)物和人等高等真核生物的寡糖組成有N-乙酰氨基半乳糖、半乳糖和唾液酸等。此外，在對(duì)糖基化蛋白選擇上，畢赤酵母與高等真核生物也有很多不同，有些蛋白在天然宿主中并不會(huì)被糖基化，但畢赤酵母卻能使這些蛋白糖基化。而有些蛋白在天然宿主中被糖基化，但在畢赤酵母中其絲氨酸和蘇氨酸未糖基化，因此其表達(dá)的抗原特異性也與原宿主蛋白有很大的差異。再者即使是原宿主來(lái)源蛋白，如果經(jīng)過(guò)變性處理，特別是甲醛等處理，容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)間基團(tuán)的交聯(lián)，隨著空間結(jié)構(gòu)的改變其抗原特異性也部分發(fā)生改變。本研究建立了以mLumin熒光蛋白為指示系統(tǒng)的跨細(xì)胞膜蛋白表達(dá)載體，既可以表達(dá)蛋白，又可指示蛋白質(zhì)是否能表達(dá)于細(xì)胞膜表面，還有利于采用流式細(xì)胞術(shù)分選。此外，該表達(dá)系統(tǒng)能高效表達(dá)TIGIT跨膜區(qū)及胞外段蛋白，mLumin熒光蛋白起到了很好的指示效果。

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