HMGB2啟動子報告基因載體的構(gòu)建、活性驗(yàn)證及與其結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測

王飛， 馮奇， 秦杰， 李婉， 盧春

(南京醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)系， 江蘇 南京 211166)

高遷移率族蛋白(high mobility group，HMG)于1973年被發(fā)現(xiàn)，因其特殊的溶解性和在SDS-PAGE中的高遷移率而得名。HMG蛋白是含量僅次于組蛋白的染色質(zhì)蛋白，分布在細(xì)胞核內(nèi)，主要行使調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的功能；此外，它還參與轉(zhuǎn)錄、染色質(zhì)重組和DNA修復(fù)等細(xì)胞生物學(xué)過程[1-2]。HMG蛋白根據(jù)其同源性可進(jìn)一步分為HMGA、HMGB、HMGN 3個家族[3]，其中HMGB家族的HMGB1和HMGB2具有很高的同源性。研究顯示，HMGB1蛋白參與調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能及炎癥反應(yīng)，促進(jìn)多種腫瘤形成與血管生成[4-5]。近來研究發(fā)現(xiàn)HMGB2在乳腺癌、惡性膠質(zhì)瘤和肝癌[6]等多種腫瘤中呈高表達(dá)，且在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用[7-9]。啟動子是具有調(diào)節(jié)功能的DNA序列，位于基因5′端上游，具有可以與反式作用因子結(jié)合的順式作用元件結(jié)構(gòu)。啟動子就像“開關(guān)”，能夠活化RNA聚合酶并使之與模板DNA準(zhǔn)確結(jié)合，起始轉(zhuǎn)錄，其本身并不影響基因的表達(dá)，而是通過與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合而控制基因轉(zhuǎn)錄起始[10-14]。

本研究擬構(gòu)建含有HMGB2啟動子序列的熒光素酶報告基因重組質(zhì)粒，并對其進(jìn)行功能活性鑒定。同時，通過軟件分析預(yù)測可能與HMGB2啟動子序列結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，為進(jìn)一步研究調(diào)控HMGB2基因轉(zhuǎn)錄活性的轉(zhuǎn)錄因子提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒和細(xì)胞

pGL3-Basic、pCMV6-Entry-C-Flag、pCMV6-Entry-C-Flag-p53和海腎熒光素酶報告質(zhì)粒pRL-TK為本實(shí)驗(yàn)室保存。本實(shí)驗(yàn)所使用的細(xì)胞包括人胚腎上皮細(xì)胞(293T細(xì)胞)和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)，分別培養(yǎng)在含有10%和20%血清(美國Gibco公司)的DMEM(美國Gibco公司)中；培養(yǎng)基中含10 μg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素，所有細(xì)胞均培養(yǎng)在37 ℃、5%CO2條件下的恒溫培養(yǎng)箱中。

1.2 試劑

本實(shí)驗(yàn)所用的PCR引物由南京擎科生物科技有限公司合成；PCR高保真酶(Fanta酶)購自南京諾唯贊科技有限公司；血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒及感受態(tài)大腸埃希菌DH5α購自北京天根生化科技有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒及凝膠純化試劑盒(美國Omega公司)；限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和KpnⅠ(日本TaKaRa公司)；T4DNA連接酶(美國Thermo Scientific公司)；質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000(美國Invitrogen公司)；Dual-Glo Luciferase Assay System(美國Promega公司)；p53抗體(美國Santa Cruz公司)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG購自南京巴傲得生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 全基因組DNA的提取 提取HUVECs的全基因組DNA作為HMGB2啟動子區(qū)域序列PCR擴(kuò)增的模板。首先，選取匯合度為80%的HUVECs，經(jīng)胰酶消化后，用含有20%血清的完全DMEM終止消化，室溫800×g離心5 min，棄上清液；PBS重懸后再次離心棄上清液，根據(jù)血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒說明書提取HUVECs基因組DNA。

1.3.2 PCR擴(kuò)增HMGB2啟動子序列 在NCBI Genbank數(shù)據(jù)庫中查詢HMGB2啟動子序列，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物。上游引物：5′-CGGGGTACCACCAAAGAGCATAGTCTTAACATGTGCCAA-3′(下劃線部分為保護(hù)性堿基，斜體部分為KpnⅠ限制性核酸內(nèi)切酶識別序列)，下游引物：5′-CCGCTCGAGCC-CCAAATGCCGCTCGC-3′(下劃線部分為保護(hù)性堿基，斜體部分為XhoⅠ限制性核酸內(nèi)切酶識別序列)。以提取的HUVECs全基因組DNA為模版，PCR擴(kuò)增HMGB2啟動子序列，通過1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物條帶在正確的位置后，進(jìn)行切膠回收純化。

1.3.3 pGL3-HMGB2-promoter質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 將上述切膠回收產(chǎn)物和pGL3-Basic質(zhì)粒分別用KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分離、切膠回收純化和T4連接酶連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸埃希菌DH5α，涂布于具有氨芐西林抗性的LB平板，37 ℃培養(yǎng)過夜。次日，隨機(jī)挑選單克隆菌落于LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)、大量擴(kuò)增并提取質(zhì)粒。將提取的重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，同時，測定核酸序列，并利用APE軟件比對測序結(jié)果。

1.3.4 蟲熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)檢測p53對HMGB2啟動子活性的影響 將293T細(xì)胞接種在48孔板中，次日，使用LipofectamineTM2000將pGL3-HMGB2-promoter重組質(zhì)粒、pGL3-Basic空載體分別與pCMV6-Entry-C-Flag-p53、pCMV6-Entry-C-Flag以及內(nèi)參pRL-TK質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞，pCMV6-Entry-C-Flag-p53質(zhì)粒與空載質(zhì)粒pCMV6-Entry-C-Flag以及pGL3-HMGB2-promoter重組質(zhì)粒與其空載質(zhì)粒pGL3-Basic的質(zhì)量比為4 ∶1。24 h后，根據(jù)Dual-Glo Luciferase Assay System試劑盒說明書檢測相應(yīng)組別的熒光素酶活性，每組相對熒光素酶活性的值等于每組中每個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的蟲熒光素酶與海腎熒光素酶檢測值比值的平均值。

1.3.5 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測p53蛋白的表達(dá) 收集“1.3.4”中重組質(zhì)粒pGL3-HMGB2-promoter分別共轉(zhuǎn)染pCMV6-Entry-C-Flag-p53和pCMV6-Entry-C-Flag的293T細(xì)胞，提取總蛋白，取100 μg樣品進(jìn)行SDS-PAGE并轉(zhuǎn)膜；經(jīng)5%脫脂牛奶封閉1 h后，將PVDF膜孵育在p53和內(nèi)參GAPDH的一抗中(稀釋比為1 ∶500)，4 ℃孵育過夜。次日，TBST洗膜3次，每次5 min。用相應(yīng)的二抗37 ℃孵育1 h后(稀釋比為1 ∶10 000)；TBST洗膜3次，每次5 min，于化學(xué)發(fā)光儀下顯影。

1.3.6 與HMGB2啟動子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測 將HMGB2啟動子序列輸入在線軟件PROMO(http:∥alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB=TF_8.3)中，根據(jù)網(wǎng)站提示進(jìn)行操作，輸出可以與HMGB2啟動子序列結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 pGL3-HMGB2-promoter重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

通過查詢NCBI數(shù)據(jù)庫以及相關(guān)資料，獲得HMGB2啟動子的范圍，為HMGB2 mRNA轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-1 379 bp到下游+292 bp的位置。根據(jù)該序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，以HUVECs全基因組DNA為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，擴(kuò)增片段約1 684 bp，與目標(biāo)DNA長度一致(圖1)。

M：DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物；1：HMGB2基因啟動子擴(kuò)增產(chǎn)物

對pGL3-HMGB2-promoter重組質(zhì)粒進(jìn)行KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，結(jié)果可見2條特異性片段，分別約為4 817 bp(載體片段)和1 684 bp(HMGB2啟動子片段，圖2a)。重組質(zhì)粒測序比對結(jié)果顯示，插入的HMGB2啟動子序列與理論序列一致(圖2b)，表明pGL3-HMGB2-promoter重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

M：DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物；1：重組質(zhì)粒pGL3-HMGB2-promoter雙酶切產(chǎn)物;A: 重組質(zhì)粒pGL3-HMGB2-promoter的雙酶切鑒定；B: 重組質(zhì)粒部分測序結(jié)果

2.2 pGL3-HMGB2-promoter重組質(zhì)?；钚缘尿?yàn)證

蟲熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，pGL3-HMGB2-promoter報告質(zhì)粒的活性明顯高于pGL3-Basic對照組(t=4.587，P<0.01，圖3)，表明pGL3-HMGB2-promoter質(zhì)粒具有轉(zhuǎn)錄活性。

a：P<0.01，與pGL3-Basic比較

2.3 p53對HMGB2啟動子活性的影響

免疫印跡結(jié)果證實(shí)，pGL3-HAGB2-promoter+pCMV6-Entry-C-Flag-p53共轉(zhuǎn)染組成功過表達(dá)p53；蟲熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)p53的pGL3-HAGB2-promoter+pCMV6-Entry-C-Flag-p53共轉(zhuǎn)染組重組質(zhì)粒的蟲熒光素酶活性明顯低于pGL3-HMGB2-promoter+pCMV6-Entry-C-Flag共轉(zhuǎn)染組(圖4)。由此進(jìn)一步說明本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的pGL3-HMGB2-promoter報告質(zhì)粒具有轉(zhuǎn)錄活性。

2.4 與HMGB2啟動子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測

運(yùn)用在線軟件PROMO對HMGB2啟動子區(qū)域(-1 379 bp～+292 bp)進(jìn)行分析，預(yù)測出72個可能與HMGB2啟動子序列結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，其中TFIID[16]、LEF-1[17-18]、POU2F2(Oct-2)[19]、NFI/CTF[20]、FOXP3[21]、STAT4[22]等與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)(表1)。這些轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測為我們進(jìn)一步探索調(diào)控HMBG2表達(dá)的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

表1 HMGB2啟動子轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的部分預(yù)測結(jié)果

1：pCMV6-Entry-C-Flag; 2:pCMV6-Entry-C-Flag-p53

3 討論

先前的研究發(fā)現(xiàn)，HMGB2可與雌激素受體結(jié)合，競爭性抑制內(nèi)分泌治療藥物對乳腺癌的治療作用，促進(jìn)乳腺癌的發(fā)展[9]。另外，HMGB2可以通過調(diào)控p53的表達(dá)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的生存、侵襲能力以及對化療藥物的拮抗作用，從而促進(jìn)骨肉瘤、惡性膠質(zhì)瘤的發(fā)生與發(fā)展[23-24]。另有研究表明，HMGB2可以促進(jìn)Oct4的小泛素相關(guān)修飾物(SUMO)化，從而抑制其被磷酸化降解，進(jìn)一步激活A(yù)KT通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡[25]。

本研究擴(kuò)增了HMGB2啟動子所在區(qū)域的DNA片段，成功構(gòu)建了含有HMGB2啟動子序列的熒光素酶報告基因重組質(zhì)粒。p53可通過結(jié)合HMGB2啟動子區(qū)抑制其轉(zhuǎn)錄[15]，本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的pGL3-HMGB2-promoter報告質(zhì)?；钚阅軌虮籶53抑制，與之一致。該質(zhì)粒的構(gòu)建有助于尋找能夠與HMGB2啟動子結(jié)合并促進(jìn)HMGB2表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而闡明HMGB2參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程的具體分子機(jī)制。

通過在線軟件PROMO對HMGB2啟動子序列進(jìn)行分析預(yù)測，獲得72個可能作用于HMGB2的轉(zhuǎn)錄因子，其中p53已被報道可以轉(zhuǎn)錄調(diào)控HMGB2[15]。另外，預(yù)測結(jié)果中的許多轉(zhuǎn)錄因子可以與HMGB2直接結(jié)合，或者受HMGB2調(diào)控從而影響其行使轉(zhuǎn)錄功能。例如，HMGB2可以促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子TFⅡD-TFⅡA與其調(diào)控的目的基因的啟動子區(qū)結(jié)合從而促進(jìn)下游基因的轉(zhuǎn)錄[26]。HMGB2可以促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子Lef-1的表達(dá)及其與β-catenin復(fù)合物的形成，進(jìn)而誘導(dǎo)下游基因的表達(dá)[17-18]。HMGB2還可以通過促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子Oct2的表達(dá)，抑制正常B淋巴細(xì)胞的分化、維持B淋巴瘤細(xì)胞的存活導(dǎo)致B淋巴瘤的發(fā)生[19, 27]。這些轉(zhuǎn)錄因子是否能夠調(diào)控HMGB2轉(zhuǎn)錄，目前尚不清楚。我們下一步將以這些可能作用于HMGB2啟動子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子為基礎(chǔ)，探究其在HMGB2轉(zhuǎn)錄過程中的作用，從而有助于闡明HMGB2參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制。

[ 1 ] Thomas JO, Travers AA.HMG1 and 2, and related ‘a(chǎn)rchitectural’ DNA-binding proteins[J]. Trends Biochem Sci, 2001, 26(3): 167-174.

[ 2 ] Reeves R. Nuclear functions of the HMG proteins[J]. Biochim Biophys Acta, 2010, 1799(1/2): 3-14.

[ 3 ] Bustin M,Reeves R.High-mobility-group chromosomal proteins:architectural components that facilitate chromatin function[J]. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol, 1996, 54: 35-100.

[ 4 ] Bianchi ME, Manfredi AA. High-mobility group box 1(HMGB1) protein at the crossroads between innate and adaptive immunity[J]. Immunol Rev, 2007, 220: 35-46.

[ 5 ] Scaffidi P, Misteli T, Bianchi ME. Release of chromatin protein HMGB1 by necrotic cells triggers inflammation[J]. Nature, 2002, 418(6894): 191-195.

[ 6 ] Kwon JH, Kim J, Park JY, et al. Overexpression of high-mobility group box 2 is associated with tumor aggressiveness and prognosis of hepatocellular carcinoma[J]. Clin Cancer Res, 2010, 16(22): 5511-5521.

[ 7 ] Zhao XL, Lin Y, Jiang J, et al. High-mobility group box 1 released by autophagic cancer-associated fibroblasts maintains the stemness of luminal breast cancer cells[J]. J Pathol, 2017, 243(3): 376-389.

[ 8 ] Taniguchi N, Caramés B, Hsu E, et al. Expression patterns and function of chromatin protein HMGB2 during mesenchymal stem cell differentiation[J]. J Biol Chem, 2011, 286(48): 41489-41498.

[ 9 ] Redmond AM, Byrne C, Bane FT, et al. Genomic interaction between ER and HMGB2 identifies DDX18 as a novel driver of endocrine resistance in breast cancer cells[J]. Oncogene, 2015, 34(29): 3871-3880.

[10] McGhee JD, Krause MW. Transcription factors and transcriptional regulation[M]. Riddle DL, Blumenthal T, Meyer BJ, et al.C.elegansⅡ. 2nd. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1997:117-184.

[11] Trinklein ND, Aldred SJ, Saldanha AJ, et al. Identification and functional analysis of human transcriptional promoters[J]. Genome Res, 2003, 13(2): 308-312.

[12] Davuluri RV, Grosse I, Zhang MQ. Computational identification of promoters and first exons in the human genome[J]. Nat Genet, 2001, 29(4): 412-417.

[13] Down TA, Hubbard TJ. Computational detection and location of transcription start sites in mammalian genomic DNA[J]. Genome Res, 2002, 12(3): 458-561.

[14] Ohler U, Niemann H. Identification and analysis of eukaryotic promoters: recent computational approaches[J]. Trends Genet, 2001, 17(2): 56-60.

[15] Shin YJ, Kim MS, Kim MS, et al. High-mobility group box 2 (HMGB2) modulates radioresponse and is downregulated by p53 in colorectal cancer cell[J]. Cancer Biol Ther, 2013, 14(3): 213-221.

[16] Coleman RA, Qiao Z, Singh SK, et al. p53 dynamically directs TFⅡD assembly on target gene promoters[J]. Mol Cell Biol, 2017, 37(13): pii:e00085-17.

[17] Taniguchi N, Kawakami Y, Maruyama I, et al. HMGB proteins and arthritis[J]. Hum Cell, 2018, 31(1): 1-9.

[18] Taniguchi N, Caramés B, Kawakami Y, et al. Chromatin protein HMGB2 regulates articular cartilage surface maintenance via β-catenin pathway[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2009, 106(39): 16817-16822.

[19] Hodson DJ, Shaffer AL, Xiao W, et al. Regulation of normal B-cell differentiation and malignant B-cell survival by OCT2[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2016, 113(14): E2039-E2046.

[20] Quesnelle KM, Grandis JR. Dual kinase inhibition of EGFR and HER2 overcomes resistance to cetuximab in a novelinvivomodel of acquired cetuximab resistance[J]. Clin Cancer Res, 2011, 17(18): 5935-5944.

[21] Yang S, Liu Y, Li MY, et al. FOXP3 promotes tumor growth and metastasis by activating Wnt/β-catenin signaling pathway and EMT in non-small cell lung cancer[J]. Mol Cancer, 2017, 16(1): 124.

[22] Zhao L, Ji G, Le X, et al. An integrated analysis identifies STAT4 as a key regulator of ovarian cancer metastasis[J]. Oncogene, 2017, 36(24): 3384-3396.

[23] Wu ZB, Cai L, Lin SJ, et al. High-mobility group box 2 is associated with prognosis of glioblastoma by promoting cell viability, invasion, and chemotherapeutic resistance[J]. Neuro Oncol, 2013, 15(9): 1264-1275.

[24] Stros M, Ozaki T, Bacikova A, et al. HMGB1 and HMGB2 cell-specifically down-regulate the p53- and p73-dependent sequence-specific transactivation from the human Bax gene promoter[J]. J Biol Chem, 2002, 277(9): 7157-7164.

[25] Campbell PA, Rudnicki MA. Oct4 interaction with Hmgb2 regulates Akt signaling and pluripotency[J]. Stem Cells, 2013, 31(6): 1107-1120.

[26] Shykind BM, Kim J, Sharp PA. Activation of the TFIID-TFIIA complex with HMG-2[J]. Genes Dev, 1995, 9(11): 1354-1365.

[27] Zwilling S, K?nig H, Wirth T. High mobility group protein 2 functionally interacts with the POU domains of octamer transcription factors[J]. EMBO J, 1995, 14(6): 1198-1208.