川芎嗪對體外培養(yǎng)的胎鼠神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化的影響*

陳士金，陳 冬，史鈺芳，劉 軍，韓 嵩，李 偉

（1.湖北宜昌市第二人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，宜昌443000；2.武警遼寧省總隊(duì)訓(xùn)練基地衛(wèi)生隊(duì)，沈陽110034）

神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs）是一類具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞，可以分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞以及少突膠質(zhì)細(xì)胞等神經(jīng)細(xì)胞［1］。腦卒中后，局灶缺血可在一定程度上激活神經(jīng)發(fā)生，但激活的NSCs的數(shù)量以及向神經(jīng)元分化率較低，遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到神經(jīng)修復(fù)的目的。因此，通過藥物增強(qiáng)神經(jīng)發(fā)生成為治療腦卒中的途徑之一。

近年研究顯示，許多中藥單體能增加神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量并誘導(dǎo)其向神經(jīng)細(xì)胞定向分化［2］。中藥提取物川芎嗪（tetramethylpyrazine，TMP）為活血化瘀藥，藥理作用廣泛，其神經(jīng)保護(hù)作用備受關(guān)注［3］，臨床上廣泛用于心腦血管疾病，尤其是腦卒中的防治。有研究顯示，TMP可以顯著增加腦卒中患側(cè)大腦神經(jīng)元陽性細(xì)胞數(shù)，具有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用［4］。TMP的神經(jīng)保護(hù)作用是否與內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生有關(guān)，以及TMP促神經(jīng)分化的分子機(jī)制尚不清楚。研究TMP與神經(jīng)發(fā)生的關(guān)系及其影響NSCs分化的分子機(jī)制，可為篩選有效中藥單體干細(xì)胞誘導(dǎo)劑及臨床神經(jīng)損傷治療提供理論依據(jù)。本文觀察TMP對NSCs增殖與分化的影響，初步探討TMP使NSCs定向分化的機(jī)制，以期為NSCs臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

采用孕14 d SD雌性大鼠，購自北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號：SCXK-（軍）2012-0004。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM／F12（1∶1）培養(yǎng)基（Gibco公司）；堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、B27添加劑以及表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）均購自 Invitrogen公司；神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）、抗巢蛋白（nestin）抗體和抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）抗體均購自Abcam公司；熒光標(biāo)記二抗（Invitrogen公司）；內(nèi)參抗體β-actin、辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗、β-巰基乙醇、胰蛋白酶以及二甲亞砜均購自碧云天生物技術(shù)公司；PVDF膜（Millpore公司）；TMP購自哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)有限公司。

1.3 大鼠NSCs體外分離培養(yǎng)

孕14 d的SD雌性大鼠，乙醚吸入麻醉后，浸入75%酒精消毒，打開腹腔取出胎鼠。用彎鑷?yán)_胎鼠腦區(qū)視野，小心暴露并取出大腦皮層，PBS緩沖液洗2次，剔除腦表面的軟膜及血管，置于裝有DMEM／F12（1∶1）基礎(chǔ)培養(yǎng)液的無菌培養(yǎng)皿中，所有操作均在冰上進(jìn)行。用眼科剪將大腦皮層剪碎，反復(fù)吹打過200目篩網(wǎng)，制備單細(xì)胞懸液，離心后加入胰蛋白酶液（終濃度0.25%）進(jìn)行消化，吹打制備細(xì)胞懸液。接種密度為2×106cells／ml，加入完全培養(yǎng)基（DMEM／F12、20 ng／ml bFGF、20 ng／ml EGF、2%B27），置37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3～4 d后半量換液。NSCs培養(yǎng)12 h呈單個懸浮圓形細(xì)胞；培養(yǎng)3 d后可見部分懸浮生長的細(xì)胞球；培養(yǎng)7 d后細(xì)胞球逐漸增大，形成約上百個細(xì)胞組成的細(xì)胞球。

1.4 大鼠NSCs克隆球的免疫熒光鑒定

NSCs培養(yǎng)5～7 d，形成大量神經(jīng)克隆球，選取第三代細(xì)胞，接種于多聚賴氨酸預(yù)處理的蓋玻片上，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日，0.01 mol／L PBS緩沖液沖洗蓋玻片3次，滴加4%甲醛固定30min。然后進(jìn)行Nestin免疫熒光染色。詳細(xì)步驟如下：0.01 mol／L PBS緩沖液洗片 3次，每次 5 min；滴加 0.5%Triton X-100破膜 15～20 min，0.01 mol／L PBS緩沖液洗片 3次，每次 5 min；滴加 5%BSA封閉 20 min，0.01 mol／L PBS緩沖液沖洗片 3次，每次5min；滴加抗 Nestin抗體（1：400），置4℃冰箱中孵育過夜；次日，0.01 mol／L PBS緩沖液洗片 3次，每次5min；滴加熒光標(biāo)記的二抗，37℃溫箱避光孵育 1.5 h，0.01mol／L PBS洗片 3次，每次 5min；4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚（DAPI）染色 10 min，0.01 mol／L PBS緩沖液洗片3次，每次5 min；抗熒光淬滅封片劑封片，倒置熒光顯微鏡觀察并采集圖像。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組及處理

實(shí)驗(yàn)分為4組，對照組、β-巰基乙醇陽性對照組、TMP組和TMP+EGTA組。對照組給予等體積的TMP溶液溶劑，β-巰基乙醇組加入終濃度為1 mmol／Lβ-巰基乙醇的培養(yǎng)液；TMP組加入終濃度為2.4mg／ml的 TMP誘導(dǎo)液；TMP+EGTA組加入終濃度為5mmol／LEGTA（細(xì)胞外Ca2+螯合劑）的TMP誘導(dǎo)液。

1.6 BrdU法檢測川芎嗪對NSCs增殖的影響

將NSCs以密度2×105cells／ml接種于多聚賴氨酸包被的6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，各組給予不同處理，然后在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入BrdU（終濃度10μmol／L），連續(xù)觀察12 h。棄去全部培養(yǎng)液，4%多聚甲醛室溫下固定30 min，行免疫熒光染色。在顯微鏡下（10×10），各組隨機(jī)計數(shù)5個視野下的BrdU陽性細(xì)胞數(shù)，BrdU陽性細(xì)胞率＝（5個視野）陽性細(xì)胞總數(shù)／（5個視野）活細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.7 MTT法檢測川芎嗪對NSCs增殖的影響

培養(yǎng)的NSCs經(jīng)胰酶消化后，以2×105cells／ml密度接種于96孔板，每孔100μl培養(yǎng)48 h后，各組給予不同處理后再培養(yǎng)24 h。每孔加入0.5%MTT溶液100μl，37℃孵育4 h。每孔加入二甲亞砜，37℃溫箱孵育12 h，用酶標(biāo)儀檢測560 nm波長處各孔吸光度值。

1.8 蛋白免疫印跡法檢測川芎嗪對NSCs分化的影響

取第3代培養(yǎng)的NSCs，胰酶消化并制備單細(xì)胞懸液，以3×105cells／ml的密度接種于培養(yǎng)板上。細(xì)胞融合度達(dá)80%后，各組繼續(xù)培養(yǎng)12 h。取對數(shù)生長期的NSCs，加入RIPA裂解液后超聲裂解，離心收集上清。BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，在上清中加入Loading buffer后變性。于濃度12%的SDS-PAGE凝膠中電泳，每組上樣量15μg。電泳后將蛋白轉(zhuǎn)印于硝酸纖維素膜上，2%脫脂奶粉封閉60 min，加一抗（抗NSE抗體，1∶800稀釋）于4℃孵育過夜。次日，加HRP標(biāo)記的二抗室溫?fù)u床孵育2 h。滴加ECL發(fā)光液在凝膠成像系統(tǒng)中顯影。以GAPDH作為內(nèi)參。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

計量資料數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 NSCs的形態(tài)學(xué)觀察

培養(yǎng)2 d后，可見部分懸浮生長的NSCs形成“神經(jīng)克隆球”（圖1A）；3 d后克隆球增多增大，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，呈橢圓形，胞體透亮，折光性強(qiáng)（圖1B，C）。

Fig.1 Neural stem cells isolated from cerebral cortex of rat embryos，cultured in DMEM／F12 containing 20 ng／mlbFGF，20 ng／ml EGF and 2%B27

2.2 NSCs的免疫熒光鑒定

原代培養(yǎng)的NSCs呈橢圓形，胞體透亮，周邊結(jié)構(gòu)致密，界線清晰。傳代細(xì)胞克隆球，行神經(jīng)干特異性抗原巢蛋白（Nestin）檢測，結(jié)果顯示培養(yǎng)的NSCs特異性標(biāo)記物Nestin陽性（圖2，見彩圖頁Ⅳ）。

2.3 川芎嗪對NSCs增殖的影響

取第3代NSCs，細(xì)胞培養(yǎng)液加入BrdU（終濃度10μmol／L），連續(xù)觀察12 h，結(jié)果顯示在濃度2.4mg／ml TMP誘導(dǎo)液的作用下，NSCs增殖的數(shù)量明顯增加（表1）。同樣取第3代培養(yǎng)的NSCs，MTT法檢測TMP對NSCs增殖的影響，結(jié)果顯示在濃度2.4 mg／ml TMP誘導(dǎo)液的作用下，NSCs增殖的數(shù)量明顯增加（表1）。與對照組和β-巰基乙醇組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.4 川芎嗪對NSCs的分化的影響

2.4.1 川芎嗪對NSCs向神經(jīng)元分化的影響 取第3代NSCs作蛋白免疫印跡檢測。結(jié)果顯示，在2.4 mg／ml TMP誘導(dǎo)液作用下，有一小部分NSCs分化為神經(jīng)元（0.4707±0.2100），與對照組（0.0565±0.0205）相比，在含 5 mmol／L EGTA（細(xì)胞外 Ca2+螯合劑）的TMP誘導(dǎo)液培養(yǎng)12 h后，神經(jīng)元分化率明顯提高（0.8608±0.7085，圖 3）。

Tab.1 Effect of tetramethylpyrazine on NSCs proliferation（，n＝3）

Tab.1 Effect of tetramethylpyrazine on NSCs proliferation（，n＝3）

BME：β-mercaptoethanol；TMP：Tetramethylphrazine；EGTA：Ethylene glycol tetraacetic acid**P＜0.01 vs control group；＃＃P＜0.01 vs BME group

Group BrdU MTT Control group 0.81±0.09 0.80±0.15 BME group 1.31±0.96＃＃ 1.18±0.87＃＃TMP group 1.93±0.23** 1.62±0.14**TMP+EGTA group 1.97±0.53 1.69±0.12

Fig.3 The result ofWestern blot showed that compared with the other three groups，neuronal differentiation rate of tetramethylpyrazine+EGTA group was the highest

2.4.2 川芎嗪對NSCs向星型膠質(zhì)細(xì)胞分化的影響

取第3代NSCs作蛋白免疫印跡檢測。結(jié)果顯示，與對照組（0.8459±0.0858）相比，在 2.4 mg／ml TMP誘導(dǎo)液作用下，僅部分NSCs分化為星型膠質(zhì)細(xì)胞（0.4647±0.0637），而用含 5 mmol／L EGTA的 TMP誘導(dǎo)液培養(yǎng)12 h后，向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化比率明顯降低（0.1368±0.0264，圖 4）。

Fig.4 The result ofWestern blot showed that compared with the other three groups，astrocytes differentiation rate of TMP+EGTA group was the lowest

3 討論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的修復(fù)與再生一直是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。近年來，采用干細(xì)胞療法進(jìn)行神經(jīng)損傷修復(fù)越來越受到重視。NSCs具有向神經(jīng)細(xì)胞分化的潛能，是干細(xì)胞療法重要的種子細(xì)胞［5］。有研究顯示，成年哺乳類動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)存在神經(jīng)發(fā)生。目前認(rèn)為，側(cè)腦室室下區(qū)（subventricular zone，SVZ）和海馬齒狀回顆粒下層（subgranular zone，SGZ）是腦內(nèi)主要的 NSCs池［6］，嚙齒類動物局灶性腦缺血的大腦SVZ、SGZ區(qū)和梗塞周圍區(qū)出現(xiàn)新生的神經(jīng)細(xì)胞。Tanaka［7］等向腦缺血沙鼠模型的海馬齒狀回內(nèi)注射增強(qiáng)型綠色熒光蛋白，以標(biāo)記處于分裂期的神經(jīng)細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腦缺血早期新生神經(jīng)細(xì)胞主要存在于顆粒細(xì)胞層下區(qū)，腦缺血30 d時新生細(xì)胞大多數(shù)最終遷移至顆粒細(xì)胞層，分化為成熟神經(jīng)元。這表明，機(jī)體自身具有通過激活神經(jīng)發(fā)生進(jìn)行神經(jīng)修復(fù)的功能。但這種修復(fù)能力是有限的，還不足以有效恢復(fù)神經(jīng)功能。因此，最大限度促進(jìn)腦缺血后內(nèi)源性NSCs的增殖和分化，以替代丟失和損傷的神經(jīng)元，對促進(jìn)腦缺血損傷神經(jīng)功能的恢復(fù)具有重要作用。

體外誘導(dǎo)NSCs增殖并向神經(jīng)細(xì)胞分化的最終目的在于應(yīng)用，以前研究工作主要以化學(xué)制劑如β-巰基乙醇等作為誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)生成的神經(jīng)元樣細(xì)胞體外存活時間短且不能用于人體。中藥因其來源廣、副作用小等優(yōu)點(diǎn)，對NSCs生長及分化無毒。因此，利用中藥有效成分作為干細(xì)胞分化的誘導(dǎo)因子具有獨(dú)特的優(yōu)勢和應(yīng)用潛力。有報道，采用中藥或其有效成分聯(lián)合干細(xì)胞移植，如補(bǔ)陽還五湯和人參皂苷Rg1聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植，治療腦缺血有顯著效果［8］。還有文獻(xiàn)報道，黃芩苷能促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化。因此，以中藥有效成分作為干細(xì)胞定向分化的誘導(dǎo)因子，具有明顯的優(yōu)勢和應(yīng)用潛力。

TMP化學(xué)名為四甲基吡嗪，是從中藥提取物川芎的生物堿中分離得到的有效單體，具有活血化瘀、抗炎、抗氧化、抗凋亡以及改善微循環(huán)等作用。目前，臨床上廣泛用于閉塞性腦血管疾病如腦供血不全及腦栓塞等疾病的治療，其確切作用途徑尚不清楚。有研究顯示，TMP可以降低缺血／再灌注大鼠血腦屏障的通透性［9］，TMP還可以促進(jìn)缺血大鼠內(nèi)源性NSCs增殖。Xiao等［10］采用腦缺血模型大鼠，發(fā)現(xiàn)腦缺血可誘導(dǎo)大腦SVZ區(qū)BrdU陽性細(xì)胞增多，TMP處理可使SVZ區(qū)BrdU陽性細(xì)胞數(shù)增多，尤其缺血后7 d BrdU陽性細(xì)胞數(shù)增多達(dá)到頂峰。還有研究顯示，TMP可誘導(dǎo)鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞。但TMP在NSCs分化過程中是否起作用及其機(jī)制尚不清楚。本研究以NSCs為研究對象，以TMP作為NSCs定向分化的誘導(dǎo)劑，從分子水平初步探討TMP對NSCs向神經(jīng)細(xì)胞定向分化的影響，以期為篩選更加有效的誘導(dǎo)NSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化的中藥單體誘導(dǎo)劑，TPM聯(lián)合NSCs治療缺血性腦血管病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究BrdU法和MTT法結(jié)果均顯示，TMP誘導(dǎo)后 NSCs增殖的數(shù)量明顯增多。Western blot結(jié)果也顯示，TMP誘導(dǎo)后可見神經(jīng)元特異性蛋白NSE表達(dá)。因此，TMP不僅可促進(jìn)NSCs增殖，而且還能促進(jìn)其分化為神經(jīng)元。

TMP是一種新型的鈣離子拮抗劑［11］，具有改善學(xué)習(xí)記憶障礙、促使骨髓重建造血等功能。Ca2+信號是細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)生物學(xué)信號的重要方式之一，細(xì)胞外Ca2+水平變化是實(shí)現(xiàn)細(xì)胞Ca2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵因素［12］。神經(jīng)細(xì)胞的生長、分化與Ca2+信號有密切關(guān)系［13，14］。EGTA是一種細(xì)胞外 Ca2+螯合劑，本研究使用EGTA阻斷細(xì)胞外Ca2+通道后，與TMP誘導(dǎo)組比較，細(xì)胞NSE蛋白的表達(dá)水平顯著增高，提示細(xì)胞外Ca2+的減少可促進(jìn)TMP誘導(dǎo)NSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化，Ca2+信號在TMP誘導(dǎo)NSCs向神經(jīng)細(xì)胞定向分化過程中起重要作用。

研究NSCs定向分化的最終目的是將誘導(dǎo)生成的“神經(jīng)細(xì)胞”用于體內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞替代治療。但誘導(dǎo)生成的細(xì)胞是否具有神經(jīng)細(xì)胞的功能尚缺少神經(jīng)電生理學(xué)方面的證據(jù)，而且多數(shù)誘導(dǎo)生成的神經(jīng)元樣細(xì)胞體外存活時間短，妨礙了神經(jīng)細(xì)胞移植的有效性。因此，對誘導(dǎo)生成的神經(jīng)元樣細(xì)胞的體外培養(yǎng)環(huán)境還需要更深入的探索。

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