阿特拉津高靈敏酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法的建立*

李曉麗，王婷婷，劉 凱，寧保安，馬新華，劉 楠，歐國榮，高志賢，劉忠文

（軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院環(huán)境醫(yī)學(xué)與作業(yè)醫(yī)學(xué)研究所，天津市環(huán)境與食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室天津300050）

阿特拉津，又名莠去津（atrazine，AT），化學(xué)名稱為：2-氯-4-乙胺基-6-異丙胺基-l，3，5-三嗪，作為一種除草劑在世界范圍內(nèi)已廣泛推廣應(yīng)用了40多年，環(huán)境中有著廣泛的分布。經(jīng)調(diào)查，我國某些地區(qū)的河流、水庫、土壤中均發(fā)現(xiàn)有阿特拉津農(nóng)藥殘留［1］。

阿特拉津殘留的檢測(cè)方法主要有氣相色譜法、液相色譜法和傳感器檢測(cè)法等［2，3］。上述方法需要昂貴的儀器設(shè)備和專業(yè)的操作人員，不適宜現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)。酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）是目前發(fā)展最為迅速且較為完善的檢測(cè)方法，具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)費(fèi)用低、用時(shí)少等特點(diǎn)，因此應(yīng)用范圍極為廣泛。本實(shí)驗(yàn)室建立的檢測(cè)克倫特羅的ELISA，靈敏度高、特異性好［4］；閆莉等建立的雙抗體夾心ELISA能夠方便、準(zhǔn)確、快速地檢測(cè)組織中的3-硝基酪氨酸含量［5］?；诖?，本研究擬建立檢測(cè)阿特拉津的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

牛血清白蛋白（bovine albumin，BSA）、卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）、吐溫-20、過氧化氫、尿素均為美國Sigma公司產(chǎn)品，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠抗體購自北京中杉金橋生物公司；四甲基聯(lián)苯胺（tetramethylbenzidine，TMB）購自天津華生生物技術(shù)有限公司。其他未作特別說明的試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器及材料

酶聯(lián)條（天津潤(rùn)泰科技有限公司）；MultiskanMK3酶標(biāo)儀（Thermo Labsystems公司）；微量移液器（Eppendorf）；ALC-210型 4萬分之一電子天平（AcculAB）；Alliance 2695型 HPLC儀（美國 Waters公司）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（天津市實(shí)驗(yàn)儀器廠）；其它未作說明的儀器均為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)國產(chǎn)儀器。

1.3 間接競(jìng)爭(zhēng) ELISA［6］

具體操作見參考文獻(xiàn)6。簡(jiǎn)要修改如下：用包被緩沖液（pH9.6，0.05 mol／L的 CBS）將包被抗原稀釋成適當(dāng)濃度，加入96孔板，每孔100μl，37℃溫育2 h。用 pH 7.4的 PBST洗滌液洗滌 3次，每次 3 min，每次洗滌后甩去孔中洗滌液，在吸水紙上拍干。每孔加入130μl封閉溶液，37℃溫育1 h，用PBST洗滌3次，每次3min。用樣品稀釋液將競(jìng)爭(zhēng)抗原稀釋成一定濃度，每孔加入50μl一系列濃度的競(jìng)爭(zhēng)抗原；用抗體稀釋液將一抗稀釋成一定濃度，每孔加入50μl適當(dāng)濃度的一抗，37℃溫育 1.5 h，用 PBST洗滌5次，每次3 min。每孔加入100μl新配制的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠 IgG，37℃溫育45 min，用PBST洗滌6次，每次3 min。每孔加入新配制的底物液100μl，37℃溫育10 min，然后每孔加入2mol／L的H2SO4溶液 50μl終止反應(yīng)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上讀取A450nm和A630nm。

1.4 ELISA法條件優(yōu)化［7］

1.4.1 包被抗原與一抗的最佳工作濃度篩選 采用棋盤滴定法來確定兩者的最佳結(jié)合濃度。首先用一系列濃度的包被抗原包被96孔酶標(biāo)板，再將一抗作一系列稀釋，用間接ELISA測(cè)定兩者的最佳結(jié)合濃度，操作步驟同1.3。

1.4.2 選擇一抗稀釋度為1∶16 000對(duì)包被抗原進(jìn)行細(xì)化篩選實(shí)驗(yàn) 操作步驟同1.3所示。實(shí)驗(yàn)將包被抗原的濃度分別調(diào)整為 1，1.2，1.4，1.6，1.8，2.0，2.2μg／ml，縱向包被 96孔板，每孔加入包被抗原100μl，4℃過夜。用PBS按5倍的梯度稀釋競(jìng)爭(zhēng)抗原，濃度從 20μg／ml至 5×10-5μg／ml，共 9個(gè)梯度，在96孔板中每孔加入50μl。將一抗的濃度調(diào)整為1∶16 000，每孔加入 50μl。其他操作步驟不變，取A450nm值最接近于1、且IC50值最小的包被抗原濃度為最佳工作濃度。

1.4.3 不同有機(jī)溶劑對(duì)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)的影響 用含不同濃度的不同有機(jī)溶劑來稀釋農(nóng)藥標(biāo)樣，其中有機(jī)溶劑用0.1 mol／L的 PBS稀釋，在已優(yōu)化條件的基礎(chǔ)上，進(jìn)行間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定，考察不同濃度的不同有機(jī)溶劑對(duì)抗原抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)的影響。最終選擇影響最小的有機(jī)溶劑及其濃度作為最佳有機(jī)溶劑及濃度。

1.4.4 酶標(biāo)二抗稀釋度篩選 將酶標(biāo)二抗即辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG的濃度按1∶1 500，1∶2 000，1∶2 500，1∶3 000，1∶3 500，1∶4 000，1∶4 500，1∶5 000的稀釋度等差稀釋，然后進(jìn)行間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA實(shí)驗(yàn)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算各稀釋度下阿特拉津檢測(cè)的IC50值，選擇IC50值較小、特異性吸附較小、且A450nm值在1附近的二抗?jié)舛茸鳛樽罴衙笜?biāo)二抗稀釋度。

1.5 檢測(cè)阿特拉津間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立［8］

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 在線性范圍內(nèi)，用樣品稀釋液（PBS，含10%甲醇）將阿特拉津標(biāo)樣稀釋成如下的一系列濃度：123.46 ng／ml，41.15 ng／ml，13.72 ng／ml，4.57 ng／ml，1.52ng／ml，0 ng／ml，共 6個(gè)梯度。用以上優(yōu)化的最佳條件，按間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA進(jìn)行阿特拉津檢測(cè)，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定5次，以阿特拉津濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以各濃度對(duì)應(yīng)的抑制率為縱坐標(biāo)繪制工作曲線，并對(duì)工作曲線進(jìn)行方程擬合，計(jì)算工作曲線的擬合度，建立阿特拉津檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)依據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)曲線得出最低檢出限及線性范圍。

1.5.2 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA特異性實(shí)驗(yàn) 按照以上優(yōu)化的最優(yōu)條件，以間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定阿特拉津的A450nm值。同時(shí)，按相同的稀釋方法稀釋阿特拉津的結(jié)構(gòu)類似物及功能類似物撲草凈，撲滅津，特丁通，三聚氰胺，毒死蜱，久效磷，對(duì)硫磷，六六六，并采用同一抗體進(jìn)行間接競(jìng)爭(zhēng) ELISA，測(cè)定各類似物的A450nm值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算抑制率等于50%時(shí)所需抑制物的濃度IC50，計(jì)算交叉反應(yīng)率，交叉反應(yīng)率越低，方法的特異性越好。

1.5.3 樣品添加回收率實(shí)驗(yàn)［9］白菜、番茄、胡蘿卜、梨、甘蔗、瘦肉均購自某菜市場(chǎng)，自來水采自天津自來水廠，牛奶購自某超市。每種樣品分別取四組，按常規(guī)前處理方法處理后，再按上述摸索優(yōu)化的最佳條件進(jìn)行間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定。其中，每塊酶標(biāo)板均設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線，且每個(gè)標(biāo)樣濃度重復(fù)測(cè)定5次，各樣品的每個(gè)濃度也重復(fù)測(cè)定5次，計(jì)算與樣品各濃度對(duì)應(yīng)的抑制率，并與同一塊酶標(biāo)板的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照，計(jì)算農(nóng)藥含量和樣品添加回收率。將測(cè)得的添加回收率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)算回收率變異系數(shù)和回收率的變化范圍，要求添加回收率落在相對(duì)穩(wěn)定、狹窄的區(qū)間內(nèi)。

1.5.4 ELISA與儀器方法的比對(duì)實(shí)驗(yàn) 在本實(shí)驗(yàn)ELISA檢測(cè)的線性范圍內(nèi)，隨機(jī)選取番茄和梨作為樣本與高效液相色譜法（HPLC）進(jìn)行比對(duì)實(shí)驗(yàn)。番茄和梨兩種樣品中阿特拉津標(biāo)樣的添加濃度為0 ng／ml，6 ng／ml，30 ng／ml，80 ng／ml。樣品按常規(guī)方法進(jìn)行前處理。

2 結(jié)果

2.1 包被抗原與一抗最佳工作濃度篩選

采用棋盤滴定法篩選包被抗原和一抗的最佳結(jié)合濃度。由表1可知：當(dāng)包被原濃度為1.6μg／ml、一抗的濃度為1∶16 000時(shí)，對(duì)應(yīng)的A450nm值為1.049，此時(shí)檢測(cè)靈敏度較高。初步選定包被抗原的工作濃度為 1.6μg／ml，一抗的工作濃度為 1∶16 000。

Tab.1 The selection of the optimum working concentration of coating antigen and antibody

2.2 選擇一抗稀釋度為1∶16 000對(duì)包被抗原進(jìn)行細(xì)化篩選試驗(yàn)

為了進(jìn)一步確定包被抗原的量，本實(shí)驗(yàn)圍繞包被抗原的較適工作濃度（1μg／ml～2.2μg／ml），以前一實(shí)驗(yàn)篩選的一抗工作濃度（1∶16 000）進(jìn)行間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定，其中阿特拉津小分子的使用濃度為20μg／ml～5×10-5μg／ml（按 5倍的梯度稀釋），共 9個(gè)梯度。選擇A450nm值在1附近且檢測(cè)靈敏度較高時(shí)所對(duì)應(yīng)的包被抗原濃度為最佳濃度（表2）。

Tab.2 The selection experimentof the optimum working concentration of coating antigen

由表2可知：當(dāng)包被抗原的濃度為1.6μg／ml時(shí)，其 A450nm值在 1附近（1.086），且 IC50值最?。?.679），因此選擇包被抗原濃度 1.6μg／ml。

2.3 不同有機(jī)溶劑對(duì)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)的影響

由圖1可知：各有機(jī)溶劑對(duì)ELISA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)均有一定的影響，表現(xiàn)在A450nm值均有不同程度的降低。而且同一種有機(jī)溶劑的濃度越大，對(duì)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)的抑制作用也越大。在所檢測(cè)的幾種有機(jī)溶劑中，對(duì)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)影響最小的是甲醇，曲線相對(duì)平緩。當(dāng)甲醇濃度為5%和10%時(shí)，對(duì)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)的影響較小。

由圖2可知：當(dāng)甲醇濃度為10%時(shí)，其對(duì)應(yīng)的IC50值和LOD值均最小，即靈敏度最高，因此本研究最終選擇10%甲醇作為助溶劑。

Fig.1 Effects of different solvents on competitive binding reaction MeOH：Methanol；ACN：Acetonitrile；PA：Acetone；DMF：N，N-dimethylformamide

Fig.2 The value of IC50 and LODwith differentmethanol concentrationLOD：Theminimum detection limit

2.4 酶標(biāo)二抗稀釋度的篩選

在本研究中，將酶標(biāo)二抗的濃度按1∶1 500，1∶2 000，1∶2 500，1∶3 000，1∶3 500，1∶4 000，1∶4 500，1∶5 000的稀釋度等差稀釋后，在已優(yōu)化條件的基礎(chǔ)上進(jìn)行間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表3。

Tab.3 The selection experiment of the optimum concentration of goat anti-mouse IgG-HRP

由表3可知：當(dāng)辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG的稀釋度為1∶4 000時(shí)，其檢測(cè)靈敏度及線性關(guān)系是最好的，因此選擇稀釋度為1∶4 000作為酶標(biāo)二抗的最佳稀釋度。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

本研究在線性范圍內(nèi)，將阿特拉津標(biāo)樣用樣品稀釋液（PBS，含 10%甲醇）稀釋成一系列濃度（123.46 ng／ml，41.15 ng／ml，13.72 ng／ml，4.57 ng／ml，1.52 ng／ml，0 ng／ml），在已優(yōu)化條件的基礎(chǔ)上進(jìn)行間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定5次，以阿特拉津濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以各濃度對(duì)應(yīng)的抑制率為縱坐標(biāo)繪制工作曲線，結(jié)果如下。

Fig.3 Repeatability of standard curve for detecting AT

由圖3可知：標(biāo)準(zhǔn)曲線的重復(fù)性很好，幾乎重疊，表明方法的重復(fù)性很好。由5個(gè)重復(fù)的平均值所做的標(biāo)準(zhǔn)曲線呈“S”形，其頭及尾部曲線趨于平坦，中央近似直線的部分是最理想的檢測(cè)區(qū)域。對(duì)此檢測(cè)區(qū)域進(jìn)行擬合，擬合圖見圖4。

Fig.4 Standard curve for detecting AT

2.6 方法特異性實(shí)驗(yàn)

Tab.4The specificity of ELISA

T e r b u m e t o n 3.0 5 0 E+1 7 ＜0.0 1%M e l a m i n e 5.5 9 8 E+4 8 3＜0.0 1%C h l o r p y r i f o s 1.2 7 0 E+4 3 ＜0.0 1%M o n o c-r o t o p h o s 3.2 0 0 E+1 8 ＜0.0 1%P a r a t h i o n 7.3 9 0 E+0 8 ＜0.0 1%H e x a c h l o r o-c y c l o h e x a n e 2.4 8 0 E+9 5 ＜0.0 1%

2.7 樣品回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從表6可以看出：當(dāng)添加阿特拉津濃度為0 ng／ml和6 ng／ml時(shí)，ELISA檢測(cè)梨中阿特拉津殘留量分別為 1.356ng／ml和 7.826ng／ml，回收率為107.80%；番茄中阿特拉津殘留量分別為1.552 ng／ml和6.969 ng／ml，回收率為 90.28%；而在此濃度范圍內(nèi) HPLC均未檢出。

另還可知：當(dāng)阿特拉津添加濃度為30 ng／ml及80 ng／ml時(shí)，ELISA檢測(cè)梨中阿特拉津殘留的回收率分別為89.01%和91.87%，番茄中阿特拉津殘留的回收率分別為88.16%和 89.00%；HPLC法檢測(cè)梨中阿特拉津殘留的回收率分別為 126.7%和88.48%，番茄中分別為 121.0%和 93.41%。

3 討論

本研究建立的檢測(cè)阿特拉津ELISA的標(biāo)準(zhǔn)曲線的重復(fù)性很好，曲線相關(guān)系數(shù)R2＝0.9958，提示相關(guān)性較好，標(biāo)準(zhǔn)曲線最低檢出限為1.972 ng／ml。從采用阿特拉津結(jié)構(gòu)類似物進(jìn)行的交叉反應(yīng)結(jié)果可以看出，除撲草凈和撲滅津外，其他類似物與阿特拉津的交叉反應(yīng)率均遠(yuǎn)低于0.01%，說明該方法特異性較好。撲草凈，撲滅津與阿特拉津的相似之處，是其化學(xué)結(jié)構(gòu)中均有三嗪母環(huán)及環(huán)上的一個(gè)亞氨基（-NH-）和一個(gè)異丙氨基，交叉反應(yīng)率高達(dá)285%～380%，提示抗阿特拉津抗體是針對(duì)三嗪母環(huán)及環(huán)上的亞氨基和異丙氨基的。

Tab.5 Recoveries of different samples（n＝5）

Tab.6 The comparition between ELISA and HPLC（n＝5）

通過與HPLC對(duì)比試驗(yàn)，證實(shí)本文建立的阿特拉津ELISA檢測(cè)與HPLC檢測(cè)具有較好的可比性，說明此方法可代替大型儀器用于阿特拉津的檢測(cè)。

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