右美托咪定對A549細胞缺氧／復氧損傷時細胞凋亡及CHOP的影響*

羅梓垠，高 慧，項冰倩，邱曉曉，戴雍月△，王萬鐵△

（1.溫州醫(yī)科大學缺血-再灌注損傷研究所，浙江 溫州325035；2.湖北省中西醫(yī)結合醫(yī)院病理科，武漢430015）

肺缺血／再灌注損傷（lung ischemia／reperfusion injury，LIRI）是個復雜的病理生理過程，主要表現(xiàn)為再灌注后肺血管阻力增加、肺水腫、肺泡損傷及微血管通透性增加，嚴重影響患者預后［1-2］。CCAAT／增強子結合蛋白同源蛋白（CHOP）是C／EBP轉錄因子的家族成員之一，是內質網(wǎng)應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）的一個特異轉錄因子。CHOP主要分布于細胞質中，正常情況下含量很低。但當ERS發(fā)生時，CHOP會大量表達，過量表達的CHOP會誘導細胞凋亡［3］。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，LIRI能激活ERS，活化CHOP凋亡通路，導致小鼠肺組織細胞凋亡。通過RNA干擾使CHOP進行基因沉默，LIRI程度減輕，提示抑制ERS相關通路是治療LIRI的有效作用靶點之一［4］。右美托咪定（dexmedetomidine，Dex）是一種新型的麻醉類輔助用藥，能與α2腎上腺素受體結合發(fā)揮鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛作用，有研究表明Dex能減輕多種器官的缺血／再灌注損傷［5］。本研究體外模擬LIRI方法建立A549（起源于肺泡II型上皮細胞系）細胞的缺氧／復氧（hypoxia／reoxygenation，H／R）損傷模型，旨在觀察Dex對A549細胞H／R損傷時細胞凋亡和CHOP表達的影響及可能機制，以期為Dex臨床治療LIRI提供充分的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

F12K培養(yǎng)基和胎牛血清（Gibco），右美托咪定（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司），CCK-8試劑盒（日本同仁），TUNEL檢測試劑盒（Roche），DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物科技有限公司），Trizol（Invitrogen），逆轉錄試劑盒、PCR試劑盒（Fermentas Life Science），BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術研究所），一抗：兔抗GAPDH多克隆IgG抗體（杭州賢至生物科技有限公司），CHOP、caspase-3、Grp78（Cell Signaling Technology），二抗：HRP偶聯(lián)山羊抗兔IgG二抗（Cell Signaling Technology）。其余試劑均為市售分析純。

常氧培養(yǎng)箱和低氧培養(yǎng)箱（Thermo），倒置相差顯微鏡（Olympus），超凈工作臺（蘇凈安泰），低溫高速離心機（Eppendorf），酶標儀（Biotek），搖床（Thermo），熒光化學發(fā)光成像系統(tǒng)（上海勤翔科學儀器有限公司），超低溫冰箱（Thermo），梯度 PCR儀（Bio-Rad）。

1.2 A549細胞的培養(yǎng)

在人肺泡Ⅱ型上皮細胞系A549細胞（購于中國科學院細胞庫）中加入新配制的含10%胎牛血清的F12K培養(yǎng)液（含糖）。F12K培養(yǎng)液中含100 U／ml青霉素和 100μg／ml鏈霉素。A549細胞常規(guī)置于37℃、5%CO2常氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞貼壁達80%以上進行傳代，每2 d按1∶3傳代，待傳代3～4次后用于實驗。

1.3 細胞模型的建立

采用隨機數(shù)字表法，將A549細胞分成4組（n＝10）：常氧培養(yǎng)組（N組），Dex常氧組（D組），缺氧／復氧組（H組），缺氧／復氧+Dex組（HD組）。依據(jù)參考文獻建立A549細胞H／R損傷模型［6］：將生長至對數(shù)生長期的A549細胞的完全培養(yǎng)基更換成無血清的F12K培養(yǎng)基，在常氧培養(yǎng)箱中預處理1 h。然后，將細胞培養(yǎng)液換為無糖的OGD液［7］，并置于低氧培養(yǎng)箱內孵育6 h。之后將OGD液再次更換為無血清的F12K培養(yǎng)基，于常氧培養(yǎng)箱內復氧處理24 h。D組和HD組在造模開始時加入Dex至終濃度 1 nmol／L［8］。

1.4 細胞形態(tài)學觀察

造模結束后，將A549細胞置于倒置顯微鏡下觀察其生長狀況及形態(tài)學變化。

1.5 CCK-8法檢測細胞活力

用胰酶消化，將A549細胞吹打成細胞懸液，按104cells／well將其接種于96孔板中。每組設6個復孔，且加設空白對照組。接種細胞后，周圍一圈加PBS，防止培養(yǎng)液蒸發(fā)。置細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待貼壁生長良好后開始造模。從培養(yǎng)箱中取出96孔板，棄去舊培養(yǎng)基，按每孔110μl將CCK-8混合液加入96孔板，避光、37℃孵育30 min，用酶標儀在450 nm波長處測定吸光度值。

1.6 TUNEL法檢測細胞凋亡

取處于對數(shù)生長期的A549細胞，消化后置6孔板內進行細胞爬片，細胞生長良好后進行造模。造模結束后，按TUNEL檢測試劑盒說明書進行操作，在光學顯微鏡下（×100）觀察細胞形態(tài)，胞核呈棕褐色者為凋亡細胞，每張片至少觀察500個細胞，計數(shù)每100個細胞中的凋亡細胞數(shù)，再取其平均值，得出凋亡指數(shù)（apoptotic index，AI）。

1.7 Western blot法檢測 A549細胞 CHOP、Grp78、caspase-3蛋白的表達水平

用細胞刮刀收集A549細胞，加入預冷的裂解液100μl（PMSF：RAPI＝1∶100），反復吹打。置于冰上40 min，使其充分裂解。低溫離心，取上清液，用BCA法測定蛋白質濃度，繪制標準曲線，樣品蛋白配制成2μg／ml，繼之將其煮沸變性。配制瓊脂糖凝膠進行電泳，轉膜至PVDF膜。再將用TBS浸濕的膜放至5%脫脂奶粉中，室溫下封閉2 h。TBST漂洗，加入一抗（抗 CHOP／Grp78／caspase-3／GAPDH抗體，CHOP／caspase-3 1∶500稀釋，Grp78／GAPDH 1∶1 000稀釋），4℃孵育過夜。TBST洗滌7 min×3次，再加入HRP標記的二抗（測定CHOP／Grp78／caspase-3／GAPDH時二抗均以1∶8 000稀釋），室溫孵育 1 h。TBST洗滌 7 min／次、×3次，滴加發(fā)光液，反應 2 min，用熒光化學發(fā)光成像系統(tǒng)進行曝光，再用凝膠分析軟件分析內參蛋白與目的蛋白吸光度值。

1.8 RT-PCR檢測 A549細胞 CHOP、Grp78 mRNA的表達水平

在每組細胞皿里加Trizol充分勻漿，使細胞完全裂解。提取總RNA并測定RNA濃度，按照逆轉錄試劑盒說明書逆轉錄合成cDNA。引物由上海捷瑞生物工程有 限公司合成，CHOP：Left：5’-CCACTCTTGACCCTGCTTCTC-3’，Right：5’-CTAGCTGTGCCACTTTCCTTT-3’，擴 增 片 段 長 度 246 bp。Grp78： Left：5’-GTCCTATGTCGCCTTCACTCC-3’，Right：5’-AAATGTCTTTGTTTGCCCACC-3’，擴增片段長 度 232 bp。GAPDH： Left：5’-ATCCCATCACCATCTTCCAG-3’， Right： 5’-TTGAGGCTGTTGTCATACTTCT-3’，擴增片段長度220 bp。采用熒光實時PCR儀進行擴增。PCR參數(shù)：94℃，3 min；94℃，30 s；CHOP，52℃／Grp78 59℃／GAPDH 54℃，30 s；72℃，1min；共 33個循環(huán)，72℃，5min終止延伸。配制1.5%瓊脂糖凝膠，每孔加入5μl PCR產物，電泳條件為100 V，40min，紫外線照射掃描結果并保存。Quantity One軟件分析電泳條帶灰度值，以目的基因擴增產物密度與GAPDH基因擴增產物密度之比表示目的基因表達水平。

1.9 統(tǒng)計學處理

所有計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（）表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，并進行正態(tài)性檢驗。多組樣本均數(shù)間的比較進行方差齊性檢驗，組間兩兩比較應用單因素方差分析（one-way ANOVA）。方差齊性者兩兩比較采用LSD-t法，方差不齊者兩兩比較進行Dunnet’t3檢驗。

2 結果

2.1 Dex對A549細胞形態(tài)學的影響

倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，N組和D組未見懸浮細胞，A549細胞生長良好，胞體透亮，胞核完整。H／R損傷后，H組A549細胞呈不規(guī)則多邊形生長，細胞發(fā)生融合現(xiàn)象，核固縮，胞體變暗；細胞間隙增大，貼壁細胞數(shù)減少。與H組比較，HD組A549細胞數(shù)增多，細胞形態(tài)變化不明顯（圖1）。

2.2 Dex對A549細胞活力的影響

常氧培養(yǎng)條件下，N組和D組細胞活力的吸光度值分別為 1.358±0.104，1.371±0.046，二者無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。經 H／R損傷后，H組吸光度值為0.752±0.096，與N組比較，吸光度值明顯下降（P＜0.01）。經 Dex處理后，與 H組相比，HD組吸光度值上調，為 1.057±0.045，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），表明 Dex能增加 A549細胞 H／R損傷后的細胞活力（圖2）。

Fig.1 The historical changes of A549 cells in each group under the invertedmicroscope（×100）

Fig.2 The changes of expression of absorbance value and AIvalue in all groups

2.3 Dex對A549細胞凋亡率的影響

在常氧培養(yǎng)條件下，N組和D組AI值分別為3.500±1.080和 4.300±1.494，兩者比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。經 H／R損傷后，H組 AI值為35.400±3.534，與 N組比較，H組 AI值升高顯著（P＜0.01）。經 Dex處理后，HD組 AI值下降為 17.900±3.071，與 H組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），這表明Dex能降低H／R損傷A549細胞的AI值，減少細胞凋亡（圖 2，3）。

2.4 Dex對 CHOP、Grp78和 caspase-3蛋白表達的影響

Western blot結果顯示，與 N組相比，D組CHOP、Grp78和caspase-3蛋白表達水平無明顯統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。經 H／R損傷后，與 N組相比，H組中CHOP、Grp78和caspase-3蛋白表達水平均明顯升高（P＜0.01）。經 Dex處理后，HD組 CHOP、caspase-3蛋白水平顯著下降，與H組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，圖 4）。

Fig.3 The apoptosis index detected by TUNEL in each group（×100）

Fig.4 The expression levels of CHOP、Grp78、caspase-3 proteins in various groups

2.5 Dex對CHOP和Grp78mRNA表達的影響

RT-PCR結果顯示，與 N組相比，D組 Grp78、CHOPmRNA表達水平無明顯統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。經 H／R損傷后，H組中 Grp78、CHOPmRNA表達水平均明顯升高（P＜0.01）。經Dex處理后，與H組相比，HD組 Grp78 mRNA表達上升（P＜0.01），CHOPmRNA表達顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，圖 5）。

Fig.5 The expression levels of Grp78、CHOPmRNA in various groups

3 討論

肺泡II型上皮細胞是肺泡的重要組成部分，盡管僅占肺泡表面積的5%，但對維持肺泡結構和功能具有重要作用。肺泡II型上皮細胞的凋亡和壞死數(shù)量直接決定LIRI的嚴重程度及預后。由于肺泡II型上皮細胞體外培養(yǎng)較為困難，其性狀不穩(wěn)容易向肺泡I型上皮細胞轉化，故很多體外實驗研究采用A549細胞來替代肺泡 II型上皮細胞［9］。H／R損傷模型的建立是先對A549細胞進行一定時間的氧糖剝奪，低氧造模時，A549細胞培養(yǎng)液被更換成OGD液，并置于低氧培養(yǎng)箱中進行低氧處理以模擬在體肺組織缺血損傷；隨后將OGD液更換成細胞培養(yǎng)液，將培養(yǎng)皿放回常氧培養(yǎng)箱中模擬在體的再灌注損傷，這是國內外研究常用的離體組織器官缺血／再灌注損傷的造模方法之一［8，10］。本研究觀察到，造模后H組細胞數(shù)量減少、細胞形態(tài)發(fā)生改變。采用CCK-8法檢測細胞活力，與N組相比，H組細胞吸光度值顯著下降，細胞活力降低。TUNEL結果顯示，與N組比較，H組凋亡細胞數(shù)明顯增多，AI值升高，提示H／R損傷造模成功。

引起細胞凋亡的因素有很多，如氧化應激、炎癥反應、細胞內鈣穩(wěn)態(tài)失衡等。有研究發(fā)現(xiàn)，細胞凋亡與LIRI有密切聯(lián)系，且細胞凋亡在LIRI中起到重要作用［11］。ERS是細胞凋亡的途徑之一。葡萄糖調節(jié)蛋白 78（glucose-regulated protein 78，Grp78）是內質網(wǎng)上3種伴侶蛋白之一，在非應激狀態(tài)下處于無活性狀態(tài)。當ERS發(fā)生時，Grp78會與3種內質網(wǎng)跨膜蛋白 PERK（protein kinase R like ER kinase）、IRE1（inositol-requiring protein-1）和 ATF6（activating transcription factor 6）解離，使其活化，介導發(fā)生未折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPR），與未折疊或錯誤折疊蛋白結合，維持內環(huán)境的穩(wěn)態(tài)［12］。PERK、ATF6及IRE1都能誘導CHOP轉錄，使細胞內CHOP大量表達，促使細胞凋亡［13］。caspase-3是 Caspase家族中重要的凋亡執(zhí)行者，是多個凋亡信號通路的一個共同的下游效應酶，其活化是凋亡進入不可逆階段的標志［14］。本研究表明，N組 CHOP、Grp78、caspase-3蛋白和 CHOP、Grp78mRNA表達均處于較低水平。經 H／R干預后，H組 AI值上調，CHOP、Grp78、caspase-3蛋白和 CHOP、Grp78mRNA的表達水平急速增加，提示H／R損傷會誘發(fā) ERS，導致細胞凋亡。

右美托咪定（Dex）通過多種途徑對重要器官發(fā)揮一定的保護作用，主要途徑有抑制炎癥反應、抑制血管收縮、減輕氧化應激水平、增強機體免疫力等［15］，具有廣闊的應用前景。袁培根等［16］研究證實，Dex能通過α2受體上調Nrf2核內表達，啟動有利基因以對抗氧化作用，從而達到緩解肢體I／R損傷的作用。葛東建等［17］研究發(fā)現(xiàn)，Dex預處理能激活p-Akt信號通路減輕急性肺損傷，發(fā)揮對肺的保護作用。本研究顯示，經Dex干預后，HD組A549細胞Grp78蛋白與mRNA表達增加，其機制可能與Grp78活性增加以促進蛋白折疊，試圖恢復內質網(wǎng)功能，抑制內質網(wǎng)應激，發(fā)揮保護細胞作用。這亦與調控內質網(wǎng)相關凋亡通路等有密切關系。CHOP信號通路是內質網(wǎng)應激重要途徑之一，與H組比較，HD組CHOP、caspase-3蛋白，CHOPmRNA表達水平明顯下降，細胞活力增加，細胞損傷程度減輕、凋亡細胞數(shù)明顯減少。提示Dex能抑制ERS，對抗細胞凋亡，減輕H／R損傷。

綜上所述，Dex對H／R損傷A549細胞具有一定的保護作用，其機制可能與減少過度ERS時CHOP表達所引起的細胞凋亡有關。本研究在離體實驗中證實Dex對LIRI的保護作用，進一步闡明肺組織細胞凋亡的分子機制，為Dex治療LIRI提供理論依據(jù)。

［1］ Razi SS，LatifMJ，Li X，et al.Dietary flaxseed protects against lung ischemia reperfusion injury via inhibition of apoptosis and inflammation in amurine model［J］.J Surg Res，2011，171（1）：e113-121.

［2］ 羅梓垠，郭長滿，項冰倩，等.右美托咪定對肺缺血／再灌注損傷小鼠內質網(wǎng)應激相關分子caspase-12表達的影響［J］.中國應用生理學雜志，2016，32（2）：164-168.

［3］ 陳 丹，宋 冬，葉玉柱，等.右美托咪定通過影響CHOP凋亡通路減輕缺血／再灌注肺損傷［J］.中國病理生理雜志，2015，31（6）：1093-1098.

［4］ 周俊輝，王良榮，郝卯林，等.靶向小干擾RNA對小鼠肺缺血／再灌注損傷時細胞凋亡及CCAAT／增強子結合蛋白同源蛋白的作用［J］.中華實驗外科雜志，2013，30（8）：1608-1611.

［5］ Kucuk A，Yaylak F，Cavunt-Bayraktar A，etal.The protective effects of dexmedetomidine on hepatic ischemia reperfusion injury［J］.Bratisl Lek Listy，2014，115（11）：680-684.

［6］ Wang W，Jia L，Wang TK，et al.Endogenous calcitonin gene-related peptide protects human alveolar epithelial cells through protein kinase c and heat shock protein［J］.J Biol Chem，2005，280（21）：20325-20330.

［7］ Gu JT，Sun P，Zhao HL，et al.Dexmedetomidine provides renoprotection against ischemia-reperfusion injury inmice［J］.Crit Care，2011，15（3）：R153.

［8］ Cui J，Zhao HL，Wang CY，etal.Dexmedetomidine attenuates oxidative stress induced lung alveolarepithelial cellapoptosis in vitro［J］.Oxid Med Cell Longev，2015，358396.

［9］ Foster KA，Oster CG，MayerMM，etal.Characterization of the A549 cell line as a type IIpulmonary epithelial cellmodel for drugmetabolism［J］.Exp Cell Res，1998，243（2）：359-366.

［10］周子懿，唐宇平，高俊鵬，等.羅布麻提取物對神經元缺氧復氧損傷的保護作用［J］.上海中醫(yī)藥雜志，2010，44（8）：63-67.

［11］Luo ZY，Zhou JH，Xiang BQ，et al.Effects of curcumin on cell apoptosis in pulmonary ischemia／reperfusion injury in mice［J］.Int JClin Exp Pathol，2016，9（7）：6633-6644.

［12］Zhang XY，Zhang TT，Song DD，etal.Endoplasmic reticulum chaperone GRP78 is involved in autophagy activation induced by ischemic preconditioning in neural cells［J］.Mol Brain，2015，8（1）：20.

［13］夏元平，王立花，樊燕蓉.細胞凋亡與內質網(wǎng)應激機制［J］.藥學與臨床研究，2010，18（3）：291-293.

［14］岳原亦，張 揚，張一奇.Caspase家族與細胞凋亡［J］.中國醫(yī)療前沿，2011，6（6）：25-26.

［15］劉先保，張春芳，詹 鴻.右美托咪定器官保護作用研究進展［J］.中國現(xiàn)代應用藥學，2013，30（10）：1148-1151.

［16］袁培根，薛彬彬，林 碧，等.Nrf2／ARE通路介導右美托咪定減輕肢體缺血／再灌注損傷中的作用［J］.中國應用生理學雜志，2016，32（3）：250-254.

［17］葛東建，祁 賓，李金玉，等.右美托咪定預處理對急性肺損傷大鼠的保護作用［J］.重慶醫(yī)學，2013，42（28）：3405-3407.