李朝暉,張 穎,路 艷,陸慶明,謝曉華△
(解放軍總醫(yī)院南樓綜合外科,北京100853)
據(jù)WHO統(tǒng)計(jì),全世界每年僅交通事故傷害就導(dǎo)致超過(guò)120萬(wàn)人死亡[1]。嚴(yán)重的創(chuàng)傷失血(traumatic hemorrhage)是可以直接威脅生命的危急重癥,也是中青年人重要的致死原因。當(dāng)機(jī)體受到嚴(yán)重創(chuàng)傷時(shí),常因血容量丟失導(dǎo)致有效循環(huán)血量減少,引起嚴(yán)重微循環(huán)障礙,引發(fā)一系列延續(xù)性局部/全身創(chuàng)傷反應(yīng),造成臟器功能不可逆損傷,包括心肌組織,但其確切發(fā)生機(jī)制尚不清楚。目前已知,在心肌損傷的發(fā)生過(guò)程中,心肌細(xì)胞凋亡具有重要意義。本文通過(guò)在體觀察及體外心肌細(xì)胞培養(yǎng)研究,探討雙下肢骨折創(chuàng)傷失血反應(yīng)可否誘導(dǎo)心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡反應(yīng),以為下一步深入研究肢體創(chuàng)傷出血導(dǎo)致心肌損傷的發(fā)生機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
健康雄性SD大鼠20只,體重250~300 g(購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心),常規(guī)飼養(yǎng)條件下正常飲食飲水。大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和骨折創(chuàng)傷組(n=10)。腹腔注射3%異戊巴比妥鈉(80 mg/kg體重)麻醉大鼠,使用自制重物墜落裝置致大鼠雙后肢股骨干粉碎性骨折。方法為:將大鼠固定在裝置底盤(pán)上,將重物升至固定高度后任其自由墜落,分別砸傷大鼠雙側(cè)股骨干致其閉合性粉碎性骨折,隨后尾動(dòng)脈抽血約10ml,1 h后雙倍液體(生理鹽水)回輸,包扎,固定[2]。全部大鼠分別在創(chuàng)傷發(fā)生后 0、1、2、4、8、12、16、24及 48 h尾動(dòng)脈取血,并于 48 h時(shí)處死大鼠,留取左室前壁心肌標(biāo)本,液氮保存?zhèn)溆谩?/p>
取正常大鼠心臟,經(jīng)Langendorff裝置灌注,從灌流液中分離心肌細(xì)胞,置CO2培養(yǎng)箱中懸浮培養(yǎng)24 h后,加入創(chuàng)傷血清繼續(xù)培養(yǎng)48 h,構(gòu)建心肌損傷模型。
在創(chuàng)傷后的不同時(shí)間點(diǎn)(創(chuàng)傷前和創(chuàng)傷后1、2、4、8、12、16、24及 48 h),分別取各組大鼠尾動(dòng)脈血液,2 000~3 000 r/min離心 20 min,取血清,以備ELISA法測(cè)定。
心肌組織取材、固定、脫水、石蠟包埋、切片,常規(guī)蘇木素-伊紅染色,中性樹(shù)膠封固。
取心肌細(xì)胞制備切片,滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物,生物素標(biāo)記后,采用TUNEL法測(cè)定。
取30mg心肌碾碎后,加入1 ml Trizol振搖,離心 12 000 r/min×15min(4℃),采用 RT-PCR法測(cè)定基因表達(dá)。引物序列為:baxForward 5’-3’TCGTCCATCGAGGATGACTTC, Reverse 5’-3’AACACCACAATTAAGGCAGGG;bcl-2Forward 5’-3’ACGTGGACCTCATGGAGTG,Reverse 5’-3’TGTGTATAGCAATCCCAGGCA
取心肌碾磨,加入RIPA 300μl裂解30 min,4℃12 000 r/min離心,SDS-PAGE,電轉(zhuǎn)液中反應(yīng)后轉(zhuǎn)膜,加入一抗后4℃孵育過(guò)夜,給予二抗結(jié)合反應(yīng),經(jīng)DAB顯色,測(cè)定Bcl-2/Bax蛋白的表達(dá)量。
計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,所有資料均運(yùn)用GraphPad Prism醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行檢驗(yàn),兩組等方差數(shù)據(jù)之間的比較采用成組t檢驗(yàn)。
2.1.1 心肌組織HE染色 閱片發(fā)現(xiàn),骨折創(chuàng)傷失血反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致心肌組織發(fā)生一定程度的損傷,心肌細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變,排列不規(guī)則,腫脹明顯,伴有大量巨噬細(xì)胞聚集(圖1,見(jiàn)彩圖頁(yè)Ⅳ)。
2.1.2 心肌細(xì)胞培養(yǎng)TUNEL染色 實(shí)驗(yàn)表明,加入創(chuàng)傷血清進(jìn)行心肌細(xì)胞培養(yǎng)后,能夠復(fù)制創(chuàng)傷模型,創(chuàng)傷組培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中出現(xiàn)大量核染成棕褐色的細(xì)胞,此即為凋亡的心肌細(xì)胞(圖2,見(jiàn)彩圖頁(yè)Ⅳ)。對(duì)照組凋亡指數(shù)為3.65±0.81,創(chuàng)傷組凋亡指數(shù)為 27.47±1.83,兩組有明顯差異(P<0.01)。
檢測(cè)大鼠骨折創(chuàng)傷后不同時(shí)間點(diǎn)血清炎性因子含量的變化,發(fā)現(xiàn)在創(chuàng)傷后短時(shí)期(8 h)內(nèi)血清IL-2水平急劇下降,8 h降至最低值(74.22±8.90 pg/ml,n=6),較對(duì)照組(214.41±11.99 pg/ml,n=10)顯著減低 (P<0.05);隨著時(shí)間的延長(zhǎng),血清IL-2的水平開(kāi)始緩慢增加,一直到創(chuàng)傷后48 h大鼠血清IL-2水平仍顯著低于對(duì)照組水平(P<0.05)。
在骨折失血后,創(chuàng)傷組大鼠血清IL-6、IL-10水平開(kāi)始急劇升高,創(chuàng)傷后4 h達(dá)到峰值,分別為(455.70±14.31pg/ml,n=6)和(189.71±8.05 pg/ml,n=6),較對(duì)照組(分別為 203.75±4.98 pg/ml,n=10和 64.52±8.36 pg/ml,n=10)顯著增加(P<0.05,P<0.05)。隨著時(shí)間的延長(zhǎng),血清 IL-6、IL-10水平呈逐步下降趨勢(shì),創(chuàng)傷后16~24 h恢復(fù)至對(duì)照組水平。
在骨折創(chuàng)傷失血后的早期,創(chuàng)傷組TNF-α表達(dá)水平迅速升高,創(chuàng)傷后1 h即可達(dá)到最高值(58.22±3.51 pg/ml,n=6),較對(duì)照組(45.24±5.94 pg/ml,n=10)顯著升高(P<0.05),隨后即呈快速下降趨勢(shì)(圖 3)。
骨折創(chuàng)傷發(fā)生后,Western blot方法檢測(cè)顯示,心肌bax蛋白表達(dá)量增高,而bcl-2蛋白表達(dá)量下調(diào)。
RT-PCR檢查結(jié)果則提示,對(duì)照組bax基因相對(duì)表達(dá)量為(0.98±0.03,n=10),創(chuàng)傷組為(3.96±0.21,n=6),兩組差異顯著(P<0.01)。而創(chuàng)傷組bcl-2基因相對(duì)表達(dá)量為(0.50±0.08,n=6),較之對(duì)照組(1.01±0.05,n=10)明顯下調(diào)(P<0.01,圖 4)。
Fig.3 Changes in contentofserum associated inflammatory factors in rats
Fig.4 Changes of bax/bcl-2 expression in ratmyocardial tissue 1:Control group;2:Trauma group
Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),加入創(chuàng)傷血清培養(yǎng)的損傷心肌細(xì)胞中,bcl-2蛋白表達(dá)量減少,而bax蛋白表達(dá)量增加。
進(jìn)一步以 RT-PCR方法檢測(cè)基因 bax/bcl-2表達(dá)。結(jié)果顯示:對(duì)照組心肌細(xì)胞中促凋亡基因bax的相對(duì)表達(dá)量為(0.99±0.09),而創(chuàng)傷組為(3.95±0.28),兩者差異顯著(P<0.01)。而對(duì)照組抑制凋亡基因 bcl-2的相對(duì)表達(dá)量為(0.99±0.08),創(chuàng)傷組為(0.56±0.05),二者相差具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖 5)。
Fig.5 Changes of bax/bcl-2 expression in cultured cardiomyocytes
目前認(rèn)為,創(chuàng)傷所導(dǎo)致的心肌損傷機(jī)制,與炎性因子介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激損傷、能量代謝障礙、鈣超載等諸多因素有關(guān),這些因素之間還存在相互鏈接,交織成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)。本研究通過(guò)ELISA檢測(cè)也發(fā)現(xiàn),創(chuàng)傷后 IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α均呈現(xiàn)時(shí)間依賴性規(guī)律的變化,首先是TNF-α在創(chuàng)傷后極短時(shí)間內(nèi)達(dá)峰值(1 h內(nèi)),然后緩慢下降;隨即IL-6、IL-10升高,4 h左右達(dá)到峰值,然后逐步下降;而IL-2呈現(xiàn)相反的改變,創(chuàng)傷后急劇下降,4~8 h時(shí)降至谷底,隨后緩慢回升。這樣的變化規(guī)律,與其他學(xué)者的研究報(bào)導(dǎo)是一致的[3]。這說(shuō)明創(chuàng)傷可使機(jī)體產(chǎn)生和釋放一系列炎癥相關(guān)因子,通過(guò)級(jí)聯(lián)放大產(chǎn)生“全身炎癥瀑布效應(yīng)”,造成心肌受損。如IL-6和TNF-α,可引起機(jī)體多種炎性介質(zhì)的釋放失調(diào)[4],TNF-α表達(dá)水平的持續(xù)增高既可直接導(dǎo)致心肌細(xì)胞膜受損、破壞,同時(shí)還可以募集其他炎性細(xì)胞浸潤(rùn),直至心肌發(fā)生壞死、纖維化。而IL-6則可以通過(guò)氧化應(yīng)激機(jī)制促使心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡[5],TNF-α還可以增加IL-6的表達(dá),產(chǎn)生協(xié)同作用,加速心肌細(xì)胞損傷。IL-10通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制直接/間接降低凋亡消音蛋白的活性,上調(diào)機(jī)體對(duì)創(chuàng)傷損害的敏感性閾值,避免凋亡發(fā)生[6]。
HE染色發(fā)現(xiàn),大鼠雙下肢骨折創(chuàng)傷失血反應(yīng)可以導(dǎo)致心肌不同程度受損,心肌細(xì)胞腫大,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。而且,培養(yǎng)心肌細(xì)胞TUNEL染色證實(shí),創(chuàng)傷可以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡。對(duì)于心肌細(xì)胞凋亡的認(rèn)知曾有爭(zhēng)議。曾有人認(rèn)為,心肌細(xì)胞是一種最終分化的細(xì)胞,其死亡過(guò)程應(yīng)為壞死,一旦壞死發(fā)生則不可再生。但隨著凋亡相關(guān)研究的逐步深入,心肌細(xì)胞凋亡這一現(xiàn)象得到普遍的認(rèn)同。心肌缺血、動(dòng)脈粥樣硬化、心肌病變等心血管疾患的不斷發(fā)展均可以導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡,進(jìn)而加重心臟功能受損;反之,心肌細(xì)胞凋亡又可以加速心臟疾患的進(jìn)程,累及心功能不斷下降。資料表明,壓力過(guò)負(fù)荷所致心衰過(guò)程中,常常伴有心肌細(xì)胞肥大,而細(xì)胞數(shù)量減少,凋亡系這種量減少過(guò)程的主要原因;即使是極小量的減少,也極可能會(huì)明顯惡化心力衰竭的進(jìn)程。甚至有研究提示,單一細(xì)胞死亡,通過(guò)與鄰近細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),也會(huì)對(duì)整個(gè)心臟功能產(chǎn)生影響[7]。體外心肌細(xì)胞培養(yǎng)觀察到,凋亡在短時(shí)間內(nèi)(2 h)即可發(fā)生[8];而在體研究表明,凋亡的發(fā)生可能需要4~24 h[9,10],甚至更長(zhǎng)。相對(duì)于某一固定的時(shí)間點(diǎn),所測(cè)得的凋亡反應(yīng)僅能反映相對(duì)固定的短時(shí)間內(nèi)細(xì)胞的凋亡進(jìn)程,只有歷經(jīng)足夠長(zhǎng)的時(shí)間過(guò)程檢測(cè),才可能符合機(jī)體心臟的實(shí)際狀況[11]。
心肌細(xì)胞凋亡過(guò)程中,Bcl-2/Bax是一對(duì)最有效也是最關(guān)鍵的凋亡蛋白,具有非常重要的意義。Bax分布廣泛,細(xì)胞膜、細(xì)胞漿及細(xì)胞核中都有它的定位,如在線粒體外膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核周膜等處[12]。在各種凋亡誘發(fā)信號(hào)介導(dǎo)下,游離于胞漿中的Bax發(fā)生遷移,與Bcl-2異源寡聚化為Bax-Bcl-2,可以使Bcl-2的活性受到抑制;同時(shí)還可以直接同源寡聚化為Bax-Bax,促進(jìn)Cyt-c釋放入胞漿,松解凋亡激活因子Apaf-1與 Bcl-2的耦合,進(jìn)而觸發(fā)凋亡[13]。與之相反,Bcl-2的主要作用是抑制心肌細(xì)胞凋亡,是公認(rèn)的長(zhǎng)命基因,通過(guò)C末端插入域定位于線粒體外膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核周膜等處,能夠封閉Bax激活的mPTP孔道,進(jìn)而阻斷凋亡[14]。研究表明,細(xì)胞內(nèi) Bcl-2/Bax的比例變化,對(duì)于是否產(chǎn)生凋亡傾向具有關(guān)鍵意義,直接反映心肌受損程度[15]。一般情況下,Bcl-2/Bax處于穩(wěn)定的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài),一旦機(jī)體受到刺激,通過(guò)信號(hào)傳遞打破這種動(dòng)態(tài)平衡,將產(chǎn)生截然相反的結(jié)局。因此,Bax/Bcl-2的比例可以作為檢測(cè)凋亡的一個(gè)很重要的指標(biāo),如出現(xiàn)Bax表達(dá)增加而B(niǎo)cl-2表達(dá)下調(diào),則促進(jìn)凋亡;反之,則可抑制凋亡反應(yīng)。有資料顯示,心肌缺血初始階段,p38MAPK及其下游通道活化,促進(jìn)Bax易位至線粒體,進(jìn)而啟動(dòng)凋亡;這一過(guò)程涉及凋亡激活因子Apaf-1,以及死亡蛋白(caspase-9)的易化過(guò)程;Bcl-2通過(guò)維持線粒體膜的完整性,阻斷該反應(yīng)過(guò)程[16,17]。
綜上,本研究表明,大鼠雙下肢骨折創(chuàng)傷失血反應(yīng),無(wú)論在體內(nèi)或體外,均可以誘導(dǎo)凋亡調(diào)控基因Bcl-2/Bax表達(dá)比例發(fā)生變化,呈現(xiàn)促凋亡發(fā)生樣改變,導(dǎo)致遠(yuǎn)隔臟器的損傷。通過(guò)一系列細(xì)胞因子介導(dǎo),最終可以引發(fā)心肌細(xì)胞凋亡,造成更加嚴(yán)重的傷害,但其確切傳遞機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。針對(duì)性地阻斷其傳導(dǎo)通路,或上調(diào)其保護(hù)性應(yīng)答機(jī)制,可能會(huì)為臨床提高危重創(chuàng)傷的救治、避免心肌損傷的發(fā)生提供一定的幫助。
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