牡丹子葉離體再生研究

衛(wèi)儼 張紫娟 李梅蘭 胡永紅 朱木蘭

摘要：以牡丹（Paeonia suffruticosa）品種鳳丹的子葉片為起始外植體，研究了不同種類、濃度及其配比的植物生長調(diào)節(jié)劑對牡丹愈傷組織誘導、不定芽分化及不定根誘導等離體再生過程的影響。結(jié)果表明，0.1%升汞浸泡7 min，再用10%次氯酸鈉溶液浸泡5 min消毒效果最佳，胚的無菌率和萌發(fā)率分別為82.96%、56.03%；誘導愈傷組織的最佳NAA濃度為3.0 mg/L，出愈率達85.03%；最適宜的不定芽誘導培養(yǎng)基為WPM+1.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA，不定芽誘導率可達77.35%，平均不定芽數(shù)為3.05個；最適宜的不定芽伸長培養(yǎng)基為WPM+0.3 mg/L 6-BA+2.0 mg/L GA3，不定芽伸長率為81.12%，芽的平均伸長長度可達1.93 cm；最適宜的生根培養(yǎng)基為1/2MS+2.0 mg/L NAA+1.5 mg/L IBA+1.0 mg/L AgNO3，生根率達54.31%。

關鍵詞：牡丹（Paeonia suffruticosa）；子葉葉片；再生體系

中圖分類號：S567.1+5；Q813.1+2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2018）07-0117-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.07.028

Study on Regeneration System for Cotyledons in Peonyin Vitro

WEI Yan1，2，3，ZHANG Zi-juan1，2，3，LI Mei-Lan1，HU Yong-hong2，ZHU Mu-lan2，3

（1.College of Horticulture，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，Shanxi，China；

2.Institute of Physiology & Ecology，Shanghai Chen Shan Botanical Research Center，Shanghai 201602，China；

3.Institute of Physiology & Ecology，Shanghai Institutes for Biological Sciences，CAS，Shanghai 200032，China）

Abstract： The cotyledon leaves of peony（Paeonia suffruticosa） cultivars Fengdan was used as the initial explants，the effects of different species，concentration and compatibility of plant hormones on the regeneration process of peony cotyledon leaves were studied，including callus induction，adventitious bud differentiation and adventitious root induction. The results showed that the use of 0.1% mercury immersion for 7 minutes，then 10% sodium hypochlorite solution soak for 5 minutes is the best disinfection method，aseptic rate and germination rate of embryo were 82.96% and 56.03%. The optimum naphthylacetic acid （NAA） concentration in callus occurrence was 3.0 mg/L and the callus induction rate was 85.03%. The optimum medium for the adventitious buds occurrence was WPM+1.0 mg/L 6-benzylamino purine（6-BA）+0.3 mg/L NAA along with the frequency of differentiation was 77.35% and average number of adventitious buds was 3.05. The suitable medium for adventitious bud elongation was WPM+0.3 mg/L 6-BA+2.0 mg/L gibberellin（GA3）. The elongation efficiency was about 81.12%，and the average shoot length was 1.93 cm. The optimum rooting medium was 1/2MS+2.0 mg/L NAA+1.5 mg/L indole butyric acid（IBA）+1.0 mg/L AgNO3，the rooting rate reached 54.31%.

Key words： peony（Paeonia suffruticosa）；cotyledon leaves；regeneration system

牡丹（Paeonia suffruticosa）是芍藥科芍藥屬植物，為多年生落葉小灌木?；ù笊G、富麗端莊，素有“花中之王”的美譽[1]。牡丹作為中國傳統(tǒng)名花，自古以來頗受人們喜愛，常用作園林觀賞花卉；牡丹子富含人體所需的氨基酸、維生素、多糖和多種不飽和脂肪酸[2，3]，以牡丹子仁為原料榨制而成的食用油，不飽和脂肪酸含量高達92%以上，其中α-亞麻酸占42%，多項指標超過被稱為“液體黃金”的橄欖油[4，5]；牡丹根皮成分丹皮酚，有抗炎、降溫、解熱、解痙等多種藥理[6]，為常用的鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜之良藥[7]。

雖然牡丹市場前景廣闊，但是該物種的常規(guī)育苗方式耗時長、成本高、操作難度大。因此，通過組織培養(yǎng)技術建立牡丹離體再生體系具有重要意義。目前，國內(nèi)外關于牡丹離體再生的研究尚未完全成熟，特別是再生過程中褐化嚴重、生根困難等問題阻礙了該物種的科研與生產(chǎn)進程[8-13]。本研究以鳳丹牡丹子葉片為起始外植體，初步構(gòu)建牡丹離體再生體系，以期為牡丹的種苗生產(chǎn)、遺傳改良及種質(zhì)資源保存等相關研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試牡丹種子品種為鳳丹，產(chǎn)自安徽省銅陵市，于2016年采集于上海辰山植物園。

1.2 基本培養(yǎng)基和無菌外植體的獲得

1.2.1 基本培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件 選用WPM為基本培養(yǎng)基，添加30 g/L蔗糖以及7 g/L瓊脂粉，pH調(diào)節(jié)至5.8；所有培養(yǎng)基經(jīng)121 ℃滅菌17 min，植物生長調(diào)節(jié)劑經(jīng)過濾滅菌后添加到受試培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件：光照度1 500～2 500 lx，光照時長16 h/d，溫度23±1 ℃，后續(xù)試驗中如無特殊說明，則培養(yǎng)條件一致。

1.2.2 無菌外植體的獲得 將采集的牡丹種子放置于黑暗條件下，用自來水浸泡至充分吸脹。在超凈工作臺上用70%乙醇消毒60～90 s，然后采用3種不同消毒處理：A，10%次氯酸鈉溶液消毒15 min，無菌水沖洗3～5次；B，0.1%升汞浸泡10 min，無菌水沖洗3～5次；C，先用0.1%升汞浸泡7 min，無菌水沖洗2～3次；然后用10%次氯酸鈉溶液浸泡5 min，無菌水沖洗5～8次。消毒后，無菌濾紙吸干牡丹種子表面水珠，用解剖刀將胚剝出后進行接種。7～14 d后，統(tǒng)計外植體的無菌率、萌發(fā)率和污染率。

1.3 愈傷組織誘導

培養(yǎng)5～10 d后，胚長成幼嫩的子葉。用鑷子和解剖刀輕輕地將兩片子葉分離，切去兩端，留取子葉葉片中間部位（1～2 mm）（圖1a）轉(zhuǎn)接至含有不同濃度NAA（0、1、2、3、4、5 mg/L）的WPM培養(yǎng)基上。遮光培養(yǎng)1周后轉(zhuǎn)入弱光條件下繼續(xù)培養(yǎng)。記錄愈傷組織的啟動天數(shù)，30 d后統(tǒng)計出愈率和愈傷組織比重。

出愈率=誘導出愈傷組織的子葉片個數(shù)/接種數(shù)×100%

愈傷組織比重=50個愈傷組織的鮮重（g）/50個愈傷組織的體積（cm3）

愈傷組織體積的測量方法參考郭陽鑫等[14]對大豆愈傷組織體積的測量方法。

1.4 不定芽分化

將誘導出的愈傷組織轉(zhuǎn)接至含有不同濃度組合的6-BA（0.5、1.0、1.5 mg/L）和NAA（0.1、0.3、0.5 mg/L）的WPM培養(yǎng)基上，分析不同濃度植物生長調(diào)節(jié)劑組合對不定芽誘導的影響。30 d后統(tǒng)計均不定芽數(shù)、不定芽誘導率。

不定芽分化率=分化出不定芽的愈傷組織數(shù)/接種數(shù)×100%

1.5 不定芽伸長

將誘導出的不定芽轉(zhuǎn)接至含有不同濃度6-BA（0.1、0.3、0.5 mg/L）和NAA（0.1、0.3、0.5 mg/L）的WPM培養(yǎng)基上，分析不同濃度植物生長調(diào)節(jié)劑組合對不定芽誘導的影響，30 d后統(tǒng)計。在含有GA3（1、2、3 mg/L）和NAA（0.1、0.3、0.5 mg/L）的WPM培養(yǎng)基上，分析不同濃度植物生長調(diào)節(jié)劑組合對不定芽誘導的影響。45 d后統(tǒng)計不定芽伸長率和平均伸長長度。

不定芽伸長率=伸長的不定芽數(shù)/接種數(shù)×100%

1.6 不定根誘導

選取生長健壯的芽苗（2～3 cm），轉(zhuǎn)接至1/2MS+1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA+1.0 mg/L AgNO3（A）、1/2 MS+1.5 mg/L NAA+1.0 mg/L IBA+1.0 mg/L AgNO3（B）、1/2 MS+2.0 mg/L NAA+1.5 mg/L IBA+1.0 mg/L AgNO3（C）、1/2 MS+2.5 mg/L 6-BA+2.0 mg/L IBA+1.0 mg/L AgNO3（D）的培養(yǎng)基上進行不定根誘導，45 d后統(tǒng)計每種處理的生根情況和生根率。

生根率=生出根系的芽苗數(shù)/接種芽苗數(shù)×100%

1.7 煉苗與移栽

選取長勢健壯且根系發(fā)達的再生苗，去掉培養(yǎng)瓶瓶蓋，加入少量的去離子水，放置于自然光下煉苗，3 d后用鑷子小心取出牡丹生根苗，洗去根部的瓊脂后移栽至裝有珍珠巖∶泥炭∶園土=1∶1∶1混合土的花盆中，放置于溫室，定時澆水，2周后統(tǒng)計牡丹生根苗的移栽存活率。

移栽存活率= 存活的牡丹苗/移栽的生根苗總數(shù)×100%

1.8 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用Microsoft Excel 2013和IBM SPSS Statistics Version 20軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒方法對無菌體系建立的影響

為了探究最佳的牡丹種子消毒方法，設計了3種不同的方法進行消毒。結(jié)果（表1）表明，方法A中僅使用10%次氯酸鈉溶液消毒時污染率最高，遠達不到無菌體系建立的要求。方法B即0.1%升汞消毒10 min，雖然無菌率較高，但是萌發(fā)率低，其原因可能是由于浸泡升汞的時間過長，毒性使得牡丹種子失去活性，從而影響萌發(fā)率。方法C消毒效果最佳，胚的無菌率為82.96%，且萌發(fā)率可達56.03%。因此，先用0.1%升汞浸泡7 min，再用10%次氯酸鈉溶液浸泡5 min為牡丹種子的最佳消毒方法。

2.2 不同濃度NAA對牡丹子葉片愈傷組織誘導的影響

暗培養(yǎng)7 d后，牡丹子葉片膨大并開始愈傷化，轉(zhuǎn)入弱光下繼續(xù)培養(yǎng)7～14 d后，子葉逐漸誘導出淡綠色的愈傷組織（圖1b）。通過在培養(yǎng)基中添加不同濃度NAA，研究其對牡丹子葉愈傷組織誘導的影響。由表2可知，隨著NAA濃度的增加，愈傷組織的啟動天數(shù)逐漸減少，而出愈率和愈傷組織比重先升高后下降。當NAA濃度為3.0 mg/L時，愈傷組織的啟動天數(shù)為8 d左右，出愈率為85.03%，且該植物生長調(diào)節(jié)劑條件下的愈傷組織比重為0.69 g/cm3，質(zhì)地較為致密，活力好（圖1c）。而當NAA濃度大于3.0 mg/L時，雖然愈傷組織的啟動天數(shù)較短、愈傷誘導率較高，但誘導出的愈傷組織呈白色、質(zhì)地疏松、易水漬化，不利于后續(xù)的不定芽誘導。由此可見，誘導牡丹子葉片愈傷組織的最佳NAA濃度為3.0 mg/L。

2.3 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對牡丹不定芽分化的影響

在不定芽誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)7～14 d后，牡丹愈傷組織開始增大、顏色加深，有少量細弱的不定芽發(fā)生（圖1d）。15～30 d后，逐漸誘導出大量不定芽，并長出幼葉（圖1e）。從表3中可以看出，相較于不添加植物生長調(diào)節(jié)劑的處理，添加植物生長調(diào)節(jié)劑的處理中不定芽誘導效果明顯更優(yōu)，但影響效果又隨著濃度的變化有所不同。6-BA和NAA濃度過高或過低都不利于不定芽的誘導，濃度過低，誘導效果不佳，芽苗分化數(shù)量少；濃度過高，愈傷組織易玻璃化，難以分化出不定芽。當6-BA濃度為1.5 mg/L，NAA濃度為0.3 mg/L時，雖然平均不定芽數(shù)最高，但不定芽誘導率較低，芽苗纖細。而當6-BA濃度為1.0 mg/L，NAA濃度為0.3 mg/L時，不定芽誘導率可達77.35%，均不定芽數(shù)為3.05個，且不定芽長勢正常。因此，最佳的不定芽誘導培養(yǎng)基為WPM+1.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA。

2.4 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對牡丹不定芽伸長的影響

將愈傷組織誘導出的牡丹叢生芽切分成單株，轉(zhuǎn)接至不定芽伸長培養(yǎng)基中培養(yǎng)15～20 d后，不定芽開始伸長（圖1f）。30～45 d后伸長的不定芽逐漸分化（圖1g）。從表4可以看出，不同濃度配比的6-BA和GA3對牡丹不定芽伸長有較大影響。就伸長率來看，當GA3濃度不變時，不定芽伸長率隨著6-BA濃度的升高，呈先升高后下降的趨勢；就平均伸長長度來看，GA3濃度的變化極大程度上影響著平均伸長長度，GA3濃度越高，平均伸長長度則越高。當GA3濃度為2.0 mg/L、6-BA濃度為0.3 mg/L時，不定芽伸長率最高，為81.12%，芽的平均伸長長度可達1.93 cm。且在此條件下，不定芽枝干粗壯，有利于后續(xù)生根培養(yǎng)。而當GA3和6-BA濃度較高時，平均伸長長度雖然高，但芽苗易徒長、莖干細長，在后續(xù)培養(yǎng)中易枯萎、死亡，難以生根。因此，最佳的不定芽伸長培養(yǎng)基為WPM+0.3 mg/L 6-BA+2.0 mg/L GA3。

2.5 不同生根方法對牡丹不定根誘導的影響

為了更好地探究牡丹的生根方法，研究了不同濃度IBA和NAA對牡丹再生苗不定根誘導的影響，在培養(yǎng)基中添加1.0 mg/L AgNO3以緩解褐化現(xiàn)象。不定根誘導培養(yǎng)20～30 d后，芽苗基部出現(xiàn)白色凸起狀根原基，45 d后逐漸分化成根（圖1h）。結(jié)果（表5）表明，隨著NAA和IBA濃度的升高，生根頻率呈先上升后下降的趨勢，處理C即1/2 MS+2.0 mg/L NAA+1.5 mg/L IBA+1.0 mg/L AgNO3條件下生根頻率最高，為54.31%，該條件下，誘導出的根系較發(fā)達，對于后續(xù)移栽存活率的提升起一定作用。而處理D條件下，雖然生根頻率相對較高，但誘導出的根系大多粗短，難以長出須根，且在誘導根系的同時容易在切口處長出愈傷組織，移栽后在土中容易腐爛，導致存活率較低。

3 討論

因為外植體活力越高越有利于不定芽的誘導，所以起始外植體的選擇很大程度上影響著整個試驗結(jié)果。唐豆豆等[15]以牡丹鱗芽和根蘗芽為外植體，獲得了較高的不定芽誘導率，但是鱗芽和根蘗芽取材受季節(jié)限制，且根蘗芽消毒困難，污染率較高。文書生等[16]以牡丹腋芽為外植體，同樣也有取材受限的問題。楊紅超等[17]、高昌勇[18]研究了牡丹胚的離體再生培養(yǎng)，然而再生過程中褐化現(xiàn)象嚴重。本試驗中以牡丹子葉片為起始外植體，在國內(nèi)外的牡丹再生研究中鮮見報道。在選材時，考慮到子葉片的取材不受季節(jié)限制，且相對幼嫩，具有較強的分生能力。在研究中也發(fā)現(xiàn)以子葉為起始外植體能夠獲得較高的不定芽誘導率，并且在愈傷誘導、不定芽誘導及伸長階段不易褐化，降低了牡丹再生過程中褐化死亡的概率。牡丹子葉離體再生體系的初步建立，為日后以牡丹子葉為受體材料，建立牡丹遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究奠定了基礎。

牡丹再生苗生根一直是牡丹組培研究中的一大難題。本研究中，雖然在一定程度上克服了牡丹生根難的問題，但是生根率較低。將牡丹芽苗接種至生根培養(yǎng)基后，有的芽苗逐漸發(fā)黃、枯死，其原因可能是大量元素減半導致牡丹芽苗枝葉干枯、脫落，從而快速完成生長周期；有的則在切口處長出愈傷組織，皆不利于不定根的誘導。在進行瓶內(nèi)生根誘導的同時，也嘗試瓶外生根的辦法，然而移栽后存活率較低。同樣，牡丹的褐化現(xiàn)象也嚴重阻礙了根系的誘導。在生根誘導過程中，牡丹切口處易褐化，不僅難以誘導出根系，莖葉部分也逐漸死亡。其主要原因是當外植體組織被切割后，切口分泌的酚類化合物發(fā)生氧化反應，形成褐色醌類物質(zhì)，褐色物逐漸擴散到培養(yǎng)基中，抑制其他酶的活性，從而毒害整個植株[19-21]。因此，在生根培養(yǎng)時，應適當提高轉(zhuǎn)接頻率，在芽苗切口褐化后用刀片輕輕刮除黑色物質(zhì)，盡量避免對牡丹芽苗造成新的傷口。

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