子宮內膜全層切除法構建SD大鼠 宮腔粘連模型的效果評價

陳 芳 郭奇桑 陳麗梅 江寧紅 隋 龍,△

(1復旦大學附屬婦產科醫(yī)院宮頸疾病診療中心 上海 200011; 2上海市女性生殖內分泌相關疾病重點實驗室 上海 200011)

宮腔粘連(intrauterine adhesion,IUA)又稱為Asherman綜合征,1948年由Asherman首次詳細報道[1],是由于子宮內膜損傷導致子宮內膜瘢痕纖維化及修復障礙,宮腔部分或全部粘連閉塞從而引起一系列臨床癥狀的一種婦科常見病。近年來,隨著頻繁的宮腔操作及宮腔鏡手術的普及,IUA的發(fā)病率和檢出率逐年上升,成為女性繼發(fā)不孕的第二大病因[2-3]。目前認為,創(chuàng)傷和感染是IUA發(fā)生的主要高危因素,任何引起子宮內膜基底層脫落、缺失使得肌層暴露的損傷均可導致子宮內壁相互粘連,子宮內膜前后壁基底層破壞是粘連發(fā)生的必要條件[4-5]。IUA導致的不孕、反復流產、月經減少甚至閉經等一系列臨床疾病的治療一直是國內外婦產科醫(yī)生面臨的棘手問題。IUA病理機制尚不明確[6],目前主要治療方法為盡可能恢復宮腔解剖形態(tài),然而粘連部位子宮內膜生理功能的恢復尚不明確,遠期療效不肯定,且IUA的治愈率和妊娠率尚無明顯改善[7]。因此,有必要建立一個穩(wěn)定的接近人類IUA發(fā)病原因的IUA動物模型,以利于更加深入研究其發(fā)病機制及病理生理,為子宮內膜損傷和IUA的實驗研究和臨床治療尋找契機與手段。本實驗采用子宮內膜全層切除法,以期建立一種更符合人體子宮內膜機械性損傷的IUA大鼠模型。

材 料 和 方 法

主要材料

動物來源 清潔級成年雌性SD大鼠105只,6～8周齡,體重200～250 g,購自上海斯萊克實驗動物責任有限公司[SCXK(滬)2012-003],動物由復旦大學附屬婦產科醫(yī)院動物實驗中心飼養(yǎng)。飼養(yǎng)飲條件:每5只合并一籠,室溫21～22 ℃,濕度67%～75% ,自由攝水。

試劑和儀器 LEICA顯微鏡(德國Leica公司)、石蠟切片機(金華市益迪醫(yī)療設備廠)、Masson 染色試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)、戊巴比妥鈉、顯微手術器械(上海金鐘器械廠)、醫(yī)用7-0縫線(上海強生公司)、羊抗鼠CD31一抗(美國Abcam公司)和兔/鼠通用型免疫組化試劑盒[基因科技(上海)有限公司]。

造模方法

實驗動物分組 105只大鼠根據(jù)損傷范圍的不同隨機分為A組(2.5 cm×0.5 cm,即全周徑子宮內膜切除)、B組(2.5 cm×0.25 cm,即半周徑子宮內膜切除)和C組(假手術,只做切口不切除內膜),每組35只大鼠。

造模步驟 取6～8周齡雌性SD大鼠適應環(huán)境1周,術前禁食1晚,按2%戊巴比妥鈉0.3 mL/100 g體重,腹腔注射麻醉,固定大鼠。剃除下腹部皮膚毛發(fā),75%乙醇消毒。在無菌手術操作臺中于恥骨聯(lián)合上方2～3 cm處縱向切開腹壁皮膚2.5 cm,逐層切開組織,進入腹腔,緩慢挑出大鼠的Y型子宮,A、B兩組雙側宮角同時手術,左側宮角為造模側,右側宮角為自身對照(只做切口,不損傷內膜),C組左側宮角只做切口不切除內膜,右側宮角不處理。眼科直剪于子宮中段正中央縱向剪開長2.5 cm切口,保留子宮系膜完整,眼科彎剪垂直于子宮縱切口,逐個部位將子宮內膜剪除,徹底去除子宮內膜全層,深度控制在不突破子宮漿膜面,即確保子宮漿膜面的完整性,剪除直至子宮壁菲薄半透明為止。B組以子宮系膜為界,只去除1/2宮腔面積的子宮內膜。子宮內膜切除完成后,無菌紗布徹底止血,7-0縫線間斷縫合子宮,將子宮還納至腹腔,生理鹽水沖洗腹腔,關腹。C組只沿子宮中段做相同長度縱切口,不切除子宮內膜(圖1)。

A:Bilateral uteruses in rat after opening the abdomen;B:A longitudinal incision about 2.5 cm along the uterus was made;C:In the surgery of endometrial resection,endometrium had not been completely removed;D:Bilateral uteruses were made in the same modeling method.

圖1大鼠子宮內膜切除術步驟
Fig1Thestepsofendometrialexcisioninrats

取材處理 各實驗組造模后按時間點3、7、15和30天分別處死5只大鼠取材,以C組子宮作為對照組。取材后記錄子宮狹窄、堵塞情況,4%多聚甲醛固定組織,行石蠟包埋、切片,分別行HE、Masson及CD31染色。

子宮內膜腺體數(shù)量、纖維化面積比、微血管密度(micro vascular density,MVD)測定方法 顯微視野選擇方法:A造模組和C假手術組隨機選取內膜處視野進行拍攝,B造模組則在切除內膜一側選取視野,3組選取視野的放大倍數(shù)相同。HE染色觀察子宮內膜造模后腺體數(shù)量:每張HE染色切片選取6個低倍鏡視野(×40),計算每個視野下腺體的數(shù)量,取其平均值。Masson染色計算纖維化面積比率:每張Masson切片選取8個高倍鏡視野(×200),纖維化面積比率為每個視野子宮內膜間質纖維化(膠原染色陽性面積)的總面積除以子宮內膜間質和腺體面積(整個視野面積)的總和,取平均值,以Image Proplus圖像分析軟件自動計算完成,評估造模后子宮內膜損傷和IUA的形成情況;CD31染色計算MVD,評價子宮內膜損傷及血供情況。

子宮腔通暢性評分方法 評分標準:將造模術后30天的大鼠子宮置于白色濾紙上,1 mL注射器從子宮卵巢端向大鼠宮腔內推入同等體積(約0.5 mL)的亞甲藍溶液。根據(jù)推入液體所需的力度及濾紙上藍色區(qū)域面積大小綜合評分,分為3個等級(圖2)。子宮通暢,計為0分;子宮通而不暢,計為1分;子宮完全不通暢,計為2分。IUA評估包括子宮內膜纖維化面積比率和宮腔通暢性兩個變量,將每只大鼠以上兩個參數(shù)評分相加,得到大鼠造模30天后子宮內膜纖維化總評分,評分越高提示IUA程度越重。

圖2 C組SD大鼠子宮腔通暢性評估Fig 2 Uterus patency evaluation of group C

妊娠率評估 造模術后12周,每組剩余15只大鼠與成年雄性SD大鼠連續(xù)合籠交配過夜,以合籠后第2天陰道圖片見精子為妊娠第1天,同時觀察雌鼠體重及腹形變化,于妊娠中晚期開腹探查受試雌鼠雙側子宮的受孕情況,統(tǒng)計每組孕鼠個數(shù)及孕囊或胚胎的數(shù)量,從第1天合籠時間開始至30天交配實驗完全結束。

結 果

觀察造模后子宮內膜形態(tài)學改變子宮內膜全層切除術后3天,A組和B組大鼠子宮病理組織學均表現(xiàn)為內膜上皮細胞大范圍脫落缺失,局部僅少量殘存上皮附著;子宮內膜間質水腫明顯,間質成分減少;殘余間質內毛細血管破裂、出血,伴有大量中性粒細胞浸潤(圖3),其中A組殘存的子宮內膜間質成分和腺體數(shù)量較B組明顯減少。造模后7天,A組子宮內膜上皮再生不明顯,幾乎無腺體再生,間質纖維化明顯,大量膠原蛋白形成,粘連致使大鼠子宮管腔完全粘連閉合(圖4);B組子宮內膜扁平腺上皮不同程度再生,間質充血水腫逐漸減輕,間質纖維化增生不明顯,無明顯IUA形成或宮腔閉合(圖5)。造模后15天,A組損傷達肌層、無上皮間質附著的子宮內膜基本無腺上皮再生,而殘存少量間質和上皮組織的內膜腺上皮層開始逐漸恢復,上皮下少量腺體再生,間質仍可見輕度充血、水腫,淋巴細胞浸潤,部分子宮可見IUA或有粘連帶形成,腺體稀疏,間質纖維化明顯;B組腺上皮再生,內膜間質仍比正常對照側稀薄,有纖維組織增生。造模后30天,A組子宮內膜間質纖維化,部分子宮內膜呈萎縮狀態(tài),仍可見子宮內膜上皮細胞全層缺失,間質稀薄或僅有少量間質殘存;局部子宮肌層裸露,無間質及上皮附著;部分子宮肌層缺失,僅有少數(shù)子宮內膜上皮可再生,間質修復困難;B組子宮內膜上皮基本恢復,間質再生,部分纖維組織形成(圖6)。

本實驗中觀察到采用A造模法造模后30天,大鼠子宮內膜呈萎縮狀態(tài),無粘連形成(圖6 A)共2

圖3 A、B組子宮內膜切除術后3天Masson染色Fig 3 Masson’s trichrome staining of endometrium 3 days after surgery in group A and B

圖4 A組子宮內膜切除術后7天Masson染色Fig 4 Masson’s trichrome staining of endometrium 7 days after surgery in group A

圖5 B組子宮內膜切除術后7天Masson染色Fig 5 Masson’s trichrome staining of endometrium 7 days after surgery in group B

例,病理學表現(xiàn)為:子宮內膜腺體消失,零星散在管腔閉鎖的微血管,MVD和纖維化面積比率均較A組其余樣本低。提示A造模術式對子宮內膜損傷較為徹底,采用子宮內膜全層切除法造模后可形成IUA模型和子宮內膜萎縮模型。

造模后子宮內膜腺體數(shù)量統(tǒng)計A組各時間點腺體數(shù)量明顯少于其余2組(P<0.00 1),差異具有統(tǒng)計學意義;B、C兩組相比較,差異無統(tǒng)計學意義(P=0.054),其中B組腺體數(shù)量在造模術后15天恢復至C組水平;A、B兩組相比較,A組腺體數(shù)量低于B組,隨時間變化,A組腺體數(shù)量僅呈緩慢增長,至術后30天,仍然不能增長至C組水平。由此說明,A組造模術式對子宮內膜造成的損傷較為徹底(圖7)。

圖6 A和B組子宮內膜切除術后30天Masson染色Fig 6 Masson’s trichrome staining of endometrium 30 days after surgery in group A and B

A:2.5 cm×0.5 cm;B:2.5 cm×0.25 cm;C:Sham operation.The same in the other figures and tables.

圖7A、B、C組腺體數(shù)量比較
Fig7ComparisonofglandquantitybetweengroupA,BandC

造模后CD31標記的子宮內膜MVD統(tǒng)計A、B模型組與C假手術組MVD相比較,A組各時間點MVD明顯低于其余2組(P均<0.000 1);B、C兩組差異無統(tǒng)計學意義(P=0.303);A組MVD明顯低于B組,且隨著時間的增長,A造模組MVD增長緩慢,各時間點相比較,差異無統(tǒng)計學意義(P=0.543),A造模組MVD水平至術后30天,明顯低于B、C兩組(圖8、9)。

子宮內膜纖維化面積比率和子宮腔通暢性評分子宮內膜Masson染色后膠原纖維顯微鏡下呈藍色,排列較整齊,血管和肌肉呈暗紅色(圖10),A、B、C組造模術后30天,A組有大量纖維組織形成, 膠原纖維彌漫子宮內膜間質;B組亦有較多量纖維組織形成,子宮內膜切除面膠原聚集,少量腺體及新生毛細血管形成。C組纖維組織成分少,僅有少量的膠原纖維分布。子宮內膜纖維化面積比率比較,A造模組高于B、C兩組(P<0.01),B造模組高于C組(P<0.05)。各組子宮通暢性評分比較,A組顯著高于C組,A、B、C組兩兩相比較(PA,B=0.05,PB,C<0.05,PA,C<0.001),均有統(tǒng)計學意義(表1)。

圖8 A、B、C組子宮內膜免疫組化CD31染色(×400)Fig 8 The immunohistochemical staining CD31 of endometrium in group A,B and C (×400)

圖9 A、B、C造模組MVD比較Fig 9 Comparison of MVD between group A,B and C

子宮內膜全層切除模型鼠妊娠率情況以大鼠左側子宮為A、B造模側,右側子宮采用假手術作為自身對照,造模后3個月與雄鼠合籠,孕囊數(shù)和妊娠率的統(tǒng)計方法:觀察并統(tǒng)計A、B、C各組造模單側宮角(即左側宮角)的孕囊數(shù)量,并進行組間比較,自身對照側(即右側宮角)的孕囊數(shù)量不納入統(tǒng)計。圖11采用A造模法造模,A圖為造模術后1個月IUA實體圖,見術后IUA閉塞并形成積液,對側子宮未見明顯粘連。B圖為術后3個月與雄鼠合籠后妊娠情況,大鼠左側子宮孕囊數(shù)量較對側明顯減少。從表2可知,A組術后IUA率為60%,高于B組和C組(P<0.001),而妊娠率僅為20%,均低于B、C兩組(P<0.05)。

The three pictures in the first line were taken on the edge of the endometrium,while the others in the second line were taken in the middle of the endometrium.

圖10A、B、C造模組術后30天子宮內膜Masson染色比較(×400)
Fig10Masson’strichromestainingofendometriumgroupA,BandC30daftersurgery(×400)

GroupThe ratio of fibrosis areaUterus patency A0.89±0.071.87±0.16 B0.56±0.031.20±0.17C0.37±0.070.68±0.10

The ratio of fibrosis area:PA,B<0.01,PA,C<0.001,PB,C<0.05;Uterus patency:PA,B=0.05;PB,C<0.05;PA,C<0.001.

R:Right;L:Left.

圖11A模型鼠造模術后IUA(A)及妊娠(B)情況
Fig11TheIUAperformance(A)andpregnancy(B)ofratingroupA

表2大鼠IUA模型子宮妊娠率

Tab2PregnancyrateinIUAmodelsofrats(n=15)

Pregnancy rate:PA,B<0.05,PA,C<0.001,PB,C=0.01.

討 論

IUA引起的閉經、繼發(fā)不孕、反復流產或前置胎盤、胎盤植入等產科并發(fā)癥嚴重影響了女性的身心健康[8-9],也是國內外婦產科醫(yī)師長期以來棘手的醫(yī)學難題。IUA分解術雖能一定程度改善內膜條件,但總體治愈率和妊娠率無明顯提高,IUA的內膜修復機制到目前為止尚不明確,因此,臨床研究中亟需尋找到合適的IUA動物模型,以提供理想的實驗基礎,指導IUA疾病的治療,為實現(xiàn)“人人享有生殖健康”的奮斗目標邁進一步。

本實驗經過研究對比,選取大鼠作為造模動物,大鼠具有雙子宮雙宮頸單陰道的特殊解剖結構,兩側子宮不相通,其雙子宮結構可形成自身對照,是IUA造模動物的良好選擇對象。迄今為止,IUA的動物造模方法主要有物理方法、化學方法和生物方法3類:物理方法包括機械損傷[10-12]、電凝損傷[13]及熱鹽水損傷[14]等;化學方法主要使用0.4%甲醛溶液及無水乙醇等行宮腔注射[15];生物方法包括宮腔內成纖維細胞移植[16]及脂多糖感染聯(lián)合機械損傷法[17]。

以上方法均能一定程度上造成子宮內膜損傷,形成內膜纖維化及IUA,但IUA最主要的病因為刮宮后的內膜基底層損傷[18]。研究報道指出,妊娠期宮腔操作引起的IUA高達91%,其中66.7%源于人工流產或自然流產后的刮宮,21.5%源于產后出血[19]。物理方法中電凝損傷或熱鹽水損傷導致的子宮內膜凝固型壞死和化學方法導致的子宮內膜腐蝕性炎性壞死,與臨床上機械性損傷后的修復反應不同,不適合用于IUA 的子宮內膜再生功能的研究,本研究采用機械性損傷方法旨在為子宮內膜損傷后的再生修復研究提供有效的動物模型。

如上所述,創(chuàng)傷是IUA發(fā)生的主要病因[20-21]。子宮腔由前壁、后壁及周圍側壁所組成,單獨某一壁的損傷不足以導致整個宮腔的粘連閉塞,損傷面積越大,內膜再生能力越差,IUA形成的概率越高。因此,本研究依據(jù)IUA發(fā)生的高危因素,根據(jù)不同的子宮內膜切除面積將實驗組分為全周徑子宮內膜全層切除組和半周徑子宮內膜全層切除組,構建IUA大鼠模型。

本實驗前期預實驗中采用單純搔刮法損傷大鼠子宮內膜,證實單純性機械搔刮法不足以徹底損傷子宮內膜基底層。SD大鼠子宮內膜在機械搔刮后3天起內膜腺上皮細胞即開始再生,7天子宮內膜組織完全再生,術后28天間質部位僅有輕微纖維化改變,子宮內膜上皮的形態(tài)學基本恢復,宮腔基本無粘連帶形成。說明單純搔刮法對子宮內膜上皮再生影響較小,無法構建滿意的大鼠IUA模型。而實驗組在此基礎上改進的子宮內膜全層切除法能較為徹底地切除子宮內膜腺上皮及絕大部分間質,引起SD大鼠的子宮內膜全層損傷,構建出滿意的大鼠IUA模型,且該模型與人體刮宮導致的IUA較為接近。

本研究顯示,相比于半周徑子宮內膜全層切除法,全周徑切除法造模后纖維化評分和IUA形成率更高,胚胎著床率更低,具有明顯的統(tǒng)計學意義,該實驗進一步證實子宮腔內壁的損傷面積越大,內膜再生能力越差,IUA形成的概率越高。另外,本研究還發(fā)現(xiàn),采用子宮內膜全層切除法構建IUA模型過程中,損傷深度控制尤為重要,當損傷深度達子宮內膜基底層時,切除絕大部分間質和腺上皮組織,僅殘留少量腺上皮時,較易構建成宮腔粘連模型(圖3),此模型適用于內膜損傷后防粘連措施的效果評價;而當損傷深度達子宮淺肌層甚至深肌層,子宮內膜層幾乎完全被切除時,則反而不易形成IUA,如圖5所示,造模后30天觀察,仍見子宮內膜萎縮,無法生長,此模型適用于子宮內膜再生修復的研究,如干細胞再生修復。本實驗中A、B、C各組造模后分4個時間點進行觀察:3、7、15和30天,3組模型中每個時間點均有5只大鼠,每組共20只大鼠用于形態(tài)學觀察。造模術后30天不形成粘連,組織病理學表現(xiàn)如圖5所示的實際樣本數(shù)僅有A模型組中的2例,其組織學表現(xiàn)為腺體消失,高倍鏡下可觀察到零星散在的微血管,同時纖維化程度較A組其余樣本明顯小。這2例子宮內膜萎縮模型均在A造模組術后30天觀察到,其余時間點未見,因此,A組出現(xiàn)內膜萎縮的比例為40%,IUA的比例為60%,由此說明A造模術式對子宮內膜損傷較為徹底,采用子宮內膜全層切除法造模后可形成IUA模型和子宮內膜萎縮模型。分析可能的原因有:(1)與子宮內膜切除程度相關,當內膜切除較為徹底時,因殘留的間質成分少,無明顯纖維蛋白形成,子宮內膜術后30天則表現(xiàn)為萎縮狀態(tài),不形成粘連;(2)與不同時期病理變化不同有關,子宮內膜切除法造模后30天之前的病理表現(xiàn)可能主要以纖維化為主,而造模30天后以子宮內膜萎縮為主。這與組織再生修復過程相關,造模后3天為急性炎癥期,7～15天為纖維化形成期,造模后30天,損傷部位過深的內膜雖然可由周邊內膜爬行覆蓋,但因局部微血管密度低,缺乏血供,從而逐漸萎縮。該實驗進一步表明不孕癥的機制除了與IUA有關,還可能與子宮內膜的萎縮、稀薄有關,正如臨床上刮宮后導致的不孕,并不一定都是由IUA造成的,也有可能與子宮內膜萎縮、不生長有關。

目前,IUA動物模型的造模方法及模型評估尚無統(tǒng)一標準。在動物造模過程中,造模后分不同時間點評估內膜損傷后的形態(tài)學改變,進行IUA形態(tài)學評分及纖維化半定量評分,并評估妊娠結局,是目前較為常用的模型評估方法。綜合以上實驗結果,本研究采用子宮內膜全層切除法建立了較為滿意的大鼠IUA模型,該模型的建立可以從基因、蛋白以及干細胞等多個層面深入研究IUA的發(fā)病機制,并且可以作為一個平臺從細胞因子、生物材料以及干細胞移植等方面探求新的治療方法并檢測其有效性及安全性。對研究臨床IUA發(fā)病機制及防治方法具有積極意義。

由于大鼠的子宮結構與人類差異較大,且相同品系動物間仍存在異質性,如何選擇更為合適的動物或更為優(yōu)良的造模方法,建立標準化動物造模流程,使損傷后的子宮內膜病變程度更具標準性和可控性,值得進一步探索。與生物及化學造模方法相比較,本實驗采用的子宮內膜全層切除法尚存在一定的不足:沒有統(tǒng)一切除標準,具有一定經驗性,對子宮內膜切除深度的控制以及內膜去除的徹底程度因實驗者操作熟練程度的不同而具有一定差異。因此,本實驗造模全部由一人完成,通過大量的訓練以及擴大樣本量來降低組內和組間誤差,后續(xù)如何建立統(tǒng)一化的造模標準,尚待進一步探索與研究。

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