鈣蛋白酶介導(dǎo) NF-κB/STAT3通路調(diào)控 巨噬細(xì)胞極化的分子機(jī)制

胡瓊依 王 強(qiáng)

(1復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院皮膚科 上海 200032; 2上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院風(fēng)濕免疫科 上海 200025)

巨噬細(xì)胞具有高度的異質(zhì)性和可塑性,是器官和系統(tǒng)的重要調(diào)節(jié)和效應(yīng)細(xì)胞,在炎癥反應(yīng)中充當(dāng)橋梁作用[1]。近年的研究表明,許多器官的巨噬細(xì)胞在胚胎發(fā)育期就定植于組織,并進(jìn)行自我更新[2-3]。在各種微生物和其他環(huán)境因素刺激下,巨噬細(xì)胞向具有不同功能的亞型極化,通常分為經(jīng)典激活的M1型巨噬細(xì)胞(classically activated macrophage,CAM)和替代激活的M2型巨噬細(xì)胞(alternatively activated macrophage,AAM)[4]。在Th1細(xì)胞分泌的干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的刺激下產(chǎn)生M1型巨噬細(xì)胞,分泌促炎因子如IL-12、IL-23和TNF-α,合成誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)等;M2型巨噬細(xì)胞在IL-4刺激下分泌抗炎因子,如IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)及合成精氨酸酶-1 (arginase-1,Arg-1)等[5-6]。M1與M2型巨噬細(xì)胞之間的平衡對于維持免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)具有重要作用,巨噬細(xì)胞極化中多種轉(zhuǎn)錄因子相互作用,核因子-κB(nuclear factor-kappaB,NF-κB)和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)信號通路促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1型極化;而信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化蛋白3 (signal transducers and activators of transcription 3,STAT3)信號通路促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型極化[7]等。

鈣蛋白酶(calpain)屬于鈣離子依賴激活的中性半胱氨酸蛋白酶[8],廣泛表達(dá)于哺乳動物和其他多種生物。鈣蛋白酶家族有15個成員,其中廣泛表達(dá)且研究相對較多的是μ-calpain(calpain1)和 m-calpain(calpain2)。它們由兩個亞基組成,為異二聚體,分別由capn1和capn2基因編碼的大亞基即催化亞基(相對分子質(zhì)量80 000)和capn4基因編碼的小亞基即調(diào)節(jié)亞基(相對分子質(zhì)量28 000)組成。激活calpain1和calpain2分別需要約50和1 000μmol/L的鈣離子,其參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展,包括肌肉功能障礙[9]、糖尿病[10]、心衰[11]等。我們團(tuán)隊研究發(fā)現(xiàn)抑制calpain活性后,通過下調(diào)NF-κB信號通路而不是激活其上游的IKK(inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase)活性,減輕了內(nèi)毒素引發(fā)的心肌梗死的炎癥和心肌重建[12],從而改善了心肌缺血的現(xiàn)象[13]。

研究發(fā)現(xiàn),對calpain的抑制可以直接減少小鼠心肌梗死模型中心肌組織M2的激活[14],對缺氧狀態(tài)下TGF-β刺激的巨噬細(xì)胞活化變?nèi)鮗15];另外,激活calpain活性可以通過磷酸化STAT6而使M2激活[16],但既往研究均未對calpain調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的作用和機(jī)制做深入探討;本研究以巨噬細(xì)胞RAW264.7為模型,通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)對calpain進(jìn)行干預(yù),探索calpain通過NF-κB/STAT3通路調(diào)控巨噬細(xì)胞極化而發(fā)揮其誘導(dǎo)炎癥或抗炎癥的作用。

材 料 和 方 法

細(xì)胞和試劑巨噬細(xì)胞系RAW264.7由ATCC提供。Lipofectamine 2000 (美國Invitrogen公司),Opti-MEM(美國Invitrogen公司),脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)(美國Sigma公司),IL-4 (美國Peprotech公司),細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核蛋白提取試劑盒、BCA試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司),兔抗小鼠磷酸化p65單克隆抗體、兔抗小鼠磷酸化IKK單克隆抗體、兔抗小鼠p-JNK單克隆抗體、兔抗小鼠 STAT3單克隆抗體(美國CST公司),Trizol試劑盒、ECL顯影劑(美國Thermo Fisher Scientific公司),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒(美國Takara公司),Transwell小室(濾膜直徑6.5 mm,美國Corning公司)。

細(xì)胞培養(yǎng)和體外誘導(dǎo)、鑒定巨噬細(xì)胞系RAW264.7培養(yǎng)采用含10% 胎牛血清、青霉素(100 U/mL)、鏈霉素(100 mg/L)的 DMEM培養(yǎng)基,在含5%CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。體外誘導(dǎo)用0.1μg/mL LPS培養(yǎng) 28 h,誘導(dǎo)出M1型巨噬細(xì)胞;采用0.02μg/mL IL-4培養(yǎng)28 h,誘導(dǎo)出 M2 型巨噬細(xì)胞[17]。

calpain1/2體外干擾通過Lipofectamine 2000將calpain1-siRNA和calpain2-siRNA分別轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞(RAW264.7) 48 h后,分別誘導(dǎo)形成M1、M2型細(xì)胞。

qRT-PCR檢測mRNA水平利用Trizol法提取巨噬細(xì)胞總RNA,利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成 cDNA。引物設(shè)計與合成序列見表1。利用qRT-PCR試劑盒擴(kuò)增,采用兩步法,第1步預(yù)變性:95 ℃ 60 s;第2步PCR反應(yīng):95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,40個循環(huán);第3步:溶解曲線分析。使用2-ΔΔCt法計算各樣本中相對mRNA量。

表1 qRT-PCR反應(yīng)所用引物序列Tab1 The primers sequence of qRT- PCR

Westernblot檢測蛋白質(zhì)水平提取細(xì)胞核總蛋白和細(xì)胞質(zhì)蛋白,Western blot檢測巨噬細(xì)胞內(nèi)calpain1、calpain2、p-IKK、p-JNK、p-p65和STAT3的蛋白質(zhì)水平,顯影后的條帶用Image J 軟件分析灰度值。

Transwell遷移試驗巨噬細(xì)胞siRNA轉(zhuǎn)染48 h后,體外誘導(dǎo)為M1和M2型巨噬細(xì)胞,細(xì)胞用胰蛋白酶消化,制成細(xì)胞懸液鋪于Transwell上室,在Transwell下室加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,上室加入細(xì)胞懸液,培養(yǎng)24 h后用棉簽小心擦去上室內(nèi)的細(xì)胞,用Giemsa染色,在顯微鏡下觀察并拍照,平均取10個視野,計算遷移的細(xì)胞數(shù)。

結(jié) 果

不同濃度LPS和IL-4刺激巨噬細(xì)胞后對calpain表達(dá)的影響與正常對照組相比,0.01～1.0μg/mL的LPS刺激24 h后,巨噬細(xì)胞內(nèi)calpain1 mRNA水平降低,以0.01和0.1μg/mL較顯著(P<0.05);0.02～0.1μg/mL IL-4刺激24 h后,巨噬細(xì)胞內(nèi)calpain1 mRNA水平明顯升高(P<0.05)。我們發(fā)現(xiàn)0.1和1.0μg/mL的LPS刺激24 h后,巨噬細(xì)胞內(nèi)calpain2 mRNA水平均顯著升高(P<0.05);0.02和0.1μg/mL IL-4刺激24 h后,巨噬細(xì)胞內(nèi)calpain2 mRNA水平降低,以0.02μg/mL最為明顯(P<0.05,圖1)。

M1、M2型巨噬細(xì)胞內(nèi)calpainmRNA水平變化通過0.1μg/mL LPS或0.02μg/mL IL-4體外誘導(dǎo)M1、M2型巨噬細(xì)胞,qRT-PCR檢測M1相關(guān)的因子IL-23、TNF-α、iNOS和M2相關(guān)的因子IL-10、TGF-β、Arg-1的mRNA水平,結(jié)果表明M1、M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物存在著明顯的不同(圖2)。

A:Calpain1 mRNA expression level;B:Calpain2 mRNA expression level.(1)P<0.05.

圖1LPS和IL-4刺激巨噬細(xì)胞后calpainmRNA水平
Fig1CalpainmRNAexpressionlevelinmacrophageafterthestimulationofLPSandIL-4

A-C:M1-type macrophage;D-F:M2-type macrophage.(1)P<0.05.

圖2M1、M2型巨噬細(xì)胞各種標(biāo)志物的mRNA水平
Fig2ThemRNAlevelsofmarkersinM1-typeandM2-typemacrophage

M1、M2型巨噬細(xì)胞內(nèi)calpain蛋白質(zhì)水平變化在M1型巨噬細(xì)胞內(nèi),calpain2蛋白質(zhì)水平明顯升高(P<0.05);而在M2型巨噬細(xì)胞內(nèi),calpain 2蛋白質(zhì)水平卻明顯降低(P<0.05)。calpain1蛋白質(zhì)水平在M1型和M2型巨噬細(xì)胞雖有趨勢性升高,但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(圖3)。

A:M1-type macrophage;B:M2-type macrophage.(1)P<0.05.

圖3M1、M2型巨噬細(xì)胞內(nèi)calpain蛋白質(zhì)水平
Fig3ThecalpainproteinlevelsinM1-typeandM2-typemacrophage

Calpain干擾對巨噬細(xì)胞極化類型的影響利用siRNA技術(shù)體外構(gòu)建calpain干擾的巨噬細(xì)胞,觀察calpain對巨噬細(xì)胞極化的影響(圖4)。在calpain1-siRNA組,LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IL-23、TNF-α和iNOS均減少(P<0.05);IL-4誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子TGF-β和Arg-1減少(P<0.05),而IL-10增加(P<0.05),推測calpain1可能影響巨噬細(xì)胞總數(shù)。在calpain2-siRNA組,LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IL-23、TNF-α和iNOS均減少(P<0.05);IL-4誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子TGF-β、Arg-1和IL-10均增加(P<0.05),推測calpain2可能促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1型極化。

Calpain2干擾對巨噬細(xì)胞內(nèi)NF-κB和STAT3的影響NF-κB、STAT3和JNK通路參與調(diào)控巨噬細(xì)胞極化,將巨噬細(xì)胞內(nèi)calpain2干擾后再用LPS和IL-4刺激,利用Western blot觀察巨噬細(xì)胞內(nèi)信號通路的變化。LPS刺激組calpain2受到干擾的細(xì)胞內(nèi)總磷酸化IKK蛋白質(zhì)水平降低;各組細(xì)胞總p-p65蛋白質(zhì)水平無明顯差異,而calpain2受到干擾的細(xì)胞接受LPS刺激后與對照組相比胞質(zhì)內(nèi)p-p65蛋白質(zhì)水平無明顯降低,說明p-p65核移位減少。此外,我們發(fā)現(xiàn)IL-4刺激后,calpain2-siRNA組與對照組相比,胞質(zhì)內(nèi)STAT3蛋白質(zhì)水平降低,提示STAT3核移位增加。LPS刺激的對照組和calpain2干擾組細(xì)胞磷酸化JNK蛋白質(zhì)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。因此,我們推論calpain2可能通過促進(jìn)NF-κB和抑制STAT3來促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1型極化(圖5)。

Calpain影響巨噬細(xì)胞的遷移功能巨噬細(xì)胞具有遷移能力,除了calpain調(diào)控巨噬細(xì)胞極化類型,我們進(jìn)一步研究了calpain對巨噬細(xì)胞移行功能的影響。利用Transwell遷移試驗,我們發(fā)現(xiàn)calpain1和calpain2干擾組巨噬細(xì)胞,包括M0、M1、M2的遷移能力均明顯下降(P<0.01,圖6)。

討 論

M1型巨噬細(xì)胞的刺激物有微生物產(chǎn)物L(fēng)PS和Th1分泌的IFN-γ、TNF-α和 GM-CSF等。M1型巨噬細(xì)胞不僅分泌TNF-α、IL-1β和IL-6等細(xì)胞因子,還分泌趨化因子(C-X-C基序)配體 9[chemokine (C-X-C motif) ligand 9,CXCL 9]、CXCL10、CXCL5,促進(jìn)Th1細(xì)胞免疫應(yīng)答。M1型巨噬細(xì)胞合成環(huán)氧化酶2 (cyclooxygenase 2,COX-2)和iNOS,參與NO和活性氧的代謝,可以清除細(xì)菌、真菌、病毒,還可介導(dǎo)抗寄生蟲、抗腫瘤反應(yīng)。M1型細(xì)胞持續(xù)激活導(dǎo)致組織損傷、炎癥并抑制修復(fù)[18-19]。

A-B:The screening results of calpain1-siRNA and calpain2-siRNA;C-D:The markers in M1-type macrophage;E-F:The markers in M2-type macrophage.(1)P<0.05.

圖4calpain-siRNA干擾后巨噬細(xì)胞極化類型
Fig4Thetypeofmacrophagepolarizationaftertheinterventionofcalpain-siRNA

A:The decrease in total protein level of p-IKK was induced by LPS;B:The decrease in plasmic protein level of STAT3 was induced by IL-4.Lane 1:Control-siRNA;Lane 2:Calpain2-siRNA.

圖5calpain干擾后信號通路活性變化
Fig5Activitychangeofsignalingpathwaybytheinterventionofcalpain

A:The results of migration of macrophages (×200);B:The calculation of migration of macrophages.(1)P<0.01.

圖6calpain干擾巨噬細(xì)胞遷移能力的變化
Fig6Changeofthemigrationinmacrophagebyinterventionofcalpain

M2型巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子TGF-β、CCL17、CCL22和CCL24等;合成和多胺代謝有關(guān)的Arg-1,多胺是膠原合成、細(xì)胞增生和組織纖維化的必需成份。M2型巨噬細(xì)胞的主要功能是抑制炎癥反應(yīng),導(dǎo)致組織纖維化,促進(jìn)Th2免疫應(yīng)答,清除寄生蟲,促進(jìn)血管生成和組織修復(fù),參與免疫調(diào)節(jié),與過敏和哮喘有關(guān)[20]。

許多轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化,其中NF-κB的 p65 調(diào)控M1型細(xì)胞的極化,巨噬細(xì)胞表面Toll樣受體4 (toll-like receptor4,TLR4)與LPS結(jié)合,激活經(jīng)典NF-κB通路,包括IKK磷酸化,IκBα磷酸化修飾后降解,NF-κB的p65/p50進(jìn)入細(xì)胞核介導(dǎo)促炎因子的轉(zhuǎn)錄[21-22]。IL-10通過激活STAT3抑制NF-κB p65和STAT1,從而抑制M1型細(xì)胞極化[23]。本研究發(fā)現(xiàn)calpain1在M1型細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平較 M2型低(P<0.05),而calpain2 在M1型細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平與M2型相比明顯升高(P<0.05)。calpain2 通過抑制STAT3促進(jìn)NF-κB核移位,從而促使巨噬細(xì)胞由M0型向M1型極化。calpain1、2還能影響巨噬細(xì)胞遷移能力,對calpain1、2進(jìn)行下調(diào)干預(yù)后細(xì)胞的遷移能力明顯下降。

巨噬細(xì)胞受到LPS刺激后,胞質(zhì)內(nèi)NF-κB的p-p65減少,各組細(xì)胞總蛋白不變,意味著細(xì)胞核內(nèi)p-p65增加;而巨噬細(xì)胞進(jìn)行calpain2干擾后胞質(zhì)內(nèi)NF-κB的p-p65無明顯減少,各組細(xì)胞總蛋白不變,意味著細(xì)胞核內(nèi)p-p65無明顯增加。NF-κB通路通過與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用介導(dǎo)M1型細(xì)胞極化[24],因此我們還檢測了JNK和STAT3通路,發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞受到LPS刺激后,無論calpain2是否受到干擾,巨噬細(xì)胞內(nèi)JNK磷酸化無明顯差異;巨噬細(xì)胞受到IL-4刺激后胞質(zhì)內(nèi)STAT3減少,巨噬細(xì)胞calpain2受到干擾后胞質(zhì)內(nèi)STAT3進(jìn)一步減少。本實驗中STAT3在IL-4刺激下也能激活,與文獻(xiàn)報道的主要通過IL-10刺激而激活的結(jié)果不同[25],其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。總之,calpain2可能通過NF-κB和 STAT3 信號通路促使巨噬細(xì)胞M0型向 M1型極化,并調(diào)控巨噬細(xì)胞的遷移。

參 考 文 獻(xiàn)

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