高效液相色譜-二極管陣列檢測器法測定平肺口服液中五味子醇甲的含量

肖宏華 ，馬長華 ，馬秉智 ，孫 磊

（1.北京市朝陽區(qū)食品藥品安全監(jiān)控中心，北京 100023；2.北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 102488；3.中日友好醫(yī)院 藥學部，北京 100029；4.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050）

平肺口服液為中日友好醫(yī)院制劑，清肺化痰止咳、解毒散結(jié)、止血，用于肺部腫瘤引起的胸痛、咳痰、咳血等癥。處方由浙貝母、魚腥草、五味子、白及等十味藥組成。其中五味子為該處方中主要藥味，五味子醇甲為五味子中主要有效成分。為更好的控制產(chǎn)品質(zhì)量，保證臨床療效，本文參照《中國藥典》[1]及相關文獻[2～6]，建立了高效液相色譜-二極管陣列檢測器法（HPLC-DAD）測定平肺口服液中五味子醇甲的含量，為其質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

Agilent 1260型高效液相色譜儀 （DAD檢測器，二元泵，OpenLAB色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)）；Waters Sunfire C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）；XS-205 DU 型 1/10 萬電子天平（METTLER-TOLEDO）；明澈 TM-D 24 UV 純水/超純水系統(tǒng)（Merck Millipore）。

五味子醇甲（批號110857-201714，含量以99.9%計）購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇、磷酸均為色譜純（Fisher Chemical）；水為超純水（自制）；平肺口服液（中日友好醫(yī)院中藥制劑室生產(chǎn)，批號分別為20160509、20170412、20170628、20170818）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Waters Sunfire C18 色譜柱 （4.6mm×250mm，5μm）；乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相，按表1進行梯度洗脫，流速1.0ml/min，檢測波長 216nm，光譜范圍：190.0～400.0nm，步進值1.0nm，柱溫35℃，進樣量：對照品溶液5μl、供試品溶液 20μl、陰性對照溶液 20μl。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取五味子醇甲對照品11.52mg，置100 ml量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液（115.08mg/L）。精密量取2ml，置10ml量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液（23.02mg/L）。

表1 流動相梯度條件

2.3 供試品溶液的制備

取本品5支，將內(nèi)容物倒入同一具塞錐形瓶中，搖勻。精密量取2ml，置10ml量瓶中，加水使溶解并稀釋至刻度，搖勻，用0.45μm濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4 陰性對照溶液的制備

依據(jù)平肺口服液的處方及制法，制備缺五味子的陰性樣品，按“2.3”項下方法制備陰性對照溶液。

2.5 專屬性考察

圖1 平肺口服液HPLC色譜圖

圖2 對照品色譜峰與供試品色譜峰光譜圖

分別取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液按“2.1”項下色譜條件進行測定。結(jié)果顯示在五味子醇甲對照品色譜峰相應保留時間處，陰性對照溶液色譜中沒有對應的色譜峰，說明陰性樣品對待測組分無干擾。在供試品色譜中待測組分與其他組分分離度＞1.5，得到很好的分離，色譜圖見圖1。利用OpenLAB色譜數(shù)據(jù)處理軟件的光譜功能，分析供試品色譜中在與對照品色譜峰相應保留時間處的色譜峰的光譜圖，結(jié)果與對照品色譜峰的光譜圖一致，并對該色譜峰進行純度檢測，純度因子為999.6，表明該方法專屬性良好，光譜圖見圖2。

2.6 線性關系考察

精 密 量 取 對 照 品 儲 備 液 （115.08mg/L）1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml、6.0ml分別置 10ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。按“2.1”項下色譜條件進行測定，以峰面積積分值為縱坐標（Y），對照品濃度為橫坐標（X），進行線性回歸，回歸方程為 Y=30.43X+3.873，r=1（n=5）。結(jié)果表明，五味子醇甲濃度在11.51～69.11mg/L范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關系。

2.7 重復性試驗

表2 平肺口服液加樣回收率試驗（n=9）

圖3 不同儀器的供試品HPLC色譜圖

取對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件，連續(xù)進樣6次，測定峰面積，結(jié)果峰面積RSD為 0.13%，表明儀器重復性良好。取供試品按“2.3”項下方法平行制備6份，按“2.1”項下色譜條件進行測定，計算五味子醇甲含量，結(jié)果平均含量為23.88mg/L，RSD為1.18%，表明方法的重復性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗

取供試品溶液，室溫下分別于 0，2h、4，8h、12h、24h 按“2.1”項下色譜條件進行測定，結(jié)果 RSD為 1.20%（n=6），表明供試品溶液在室溫下24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 加樣回收率試驗

精密量取已知含量的供試品2ml，置10ml量瓶中。制備9份，3份一組，分別加入含量50%、100%、150%的五味子醇甲對照品溶液，再加水稀釋至刻度，搖勻，用0.45μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，按“2.1”項下色譜條件，進樣10μl測定，計算加樣回收率。結(jié)果見表2。

2.10 樣品測定

取4批平肺口服液樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，進樣10μl測定，五味子醇甲含量（mg/L）分別為 23.88、29.70、16.38 和 14.57。

2.11 耐用性考察

取同一供試品溶液，分別采用Agilent-1260-DAD型、Waters-e2695-2498UV型、SHIMADZU-2010AHT型 3臺高效液相色譜儀進行測定，色譜圖見圖3。并且分別比較了Waters Sunfire C18色譜柱、Supleco Discovery C18色譜柱、Agilent ZORBAX Eclipse C18色譜柱，考察了不同柱溫（30℃、35℃、40℃），除五味子醇甲保留時間略有變動外，其余均無明顯差異。

3 討論

3.1 提取溶劑與提取方法的選擇

供試品溶液制備時，考察了水、甲醇、50%甲醇作為溶劑，甲醇、50%甲醇可以使樣品溶液產(chǎn)生沉淀，去除一些雜質(zhì)，但稀釋過程中會放熱，這就給定容造成誤差。另外，比較了直接稀釋法、乙酸乙酯萃取法、中性氧化鋁吸附法的處理效果，結(jié)果表明采用水作為溶劑直接稀釋，簡便易行，可以達到很好的效果。

3.2 檢測波長的選擇

通過DAD檢測器，在190.0～400.0nm波長范圍內(nèi)對五味子醇甲進行掃描，發(fā)現(xiàn)其在216nm和250nm波長處有最大吸收，且供試品色譜圖在這兩處波長下均無其他組分干擾，基線平穩(wěn)，但是，在216nm波長處五味子醇甲有較高的響應值，故選擇216nm作為檢測波長。

3.3 流動相的選擇

考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液3種流動相系統(tǒng)的分離效果，結(jié)果表明當乙腈-0.1%磷酸溶液作為流動相進行梯度洗脫時，所得色譜峰保留時間和峰面積最穩(wěn)定，峰形最好，分離效果最佳。

3.4 平肺口服液含測成分的選取

平肺口服液處方中含有預知子、浙貝母、魚腥草等眾多藥味，經(jīng)過前期研究發(fā)現(xiàn)，五味子醇甲為《中國藥典》中五味子質(zhì)量控制指標[1]，在該制劑中含量較高，且化學性質(zhì)相對穩(wěn)定，故選擇測定平肺口服液中五味子醇甲的含量，后續(xù)還將對其他成分進行含量測定研究，從而建立平肺口服液的質(zhì)量控制方法。

3.5 樣品測定結(jié)果分析

由樣品測定結(jié)果可知，4批次平肺口服液中五味子醇甲含量存在明顯的差異。究其原因，一方面可能與五味子藥材質(zhì)量有關，不同產(chǎn)地、不同的采收時間，五味子中五味子醇甲的含量有較大區(qū)別，五味子采收后，隨著存儲時間的延長，五味子中五味子醇甲的含量有降低的趨勢[3]。另一方面可能與生產(chǎn)工藝、提取過程等環(huán)節(jié)有關，有待于進一步研究。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典.一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.66.

[2]禹潔，劉培勛，龍偉，等.五味子總木脂素的分離純化與體外抗腫瘤活性的研究[J].中國藥師，2009，12（12）：1718.

[3]黃文倩，李麗，肖永慶，等.HPLC同時測定五味子中6種木脂素類成分[J].中國實驗方劑學雜志，2011，17（10）：63.

[4]胥愛麗，董玉娟.五味子配方顆粒的HPLC指紋圖譜研究[J].中國實驗方劑學雜志，2013，19（2）：81.

[5]柯華香，李化，蘇建春，等.南北五味子中木脂素類成分含量的比較[J].中國實驗方劑學雜志，2015，21（17）：40.

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