凡納濱對蝦對哈維氏弧菌不同攻毒方式的響應(yīng)

樊 英, 許 拉, 王曉璐, 李 樂, 蓋春蕾, 于曉清, 李天保, 葉海斌

(山東省海洋生物研究院, 山東省海水養(yǎng)殖病害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 青島 266104)

哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)隸屬于弧菌科弧菌屬，是海水中一種常見的病原菌，在海洋環(huán)境中分布很廣，主要感染蝦及魚類[1-2].通常情況下，哈維氏弧菌是凡納濱對蝦(Litopenaeusvanname)的正常菌群;在養(yǎng)殖動物自身健康或養(yǎng)殖環(huán)境發(fā)生變化的情況下，該菌開始大量繁殖，通過不同方式不同程度地打破宿主微生態(tài)平衡，損傷宿主的組織結(jié)構(gòu).對蝦被感染后一般會出現(xiàn)肝胰腺混沌、白鰓、紅腿、肌肉白濁等癥狀[3].目前發(fā)現(xiàn)哈維氏弧菌的致病性相關(guān)因子主要為胞外產(chǎn)物(extracellular products, ECP)，包括蛋白酶、溶血素、外毒素、脂多糖等，還與噬菌體介導(dǎo)的毒力基因轉(zhuǎn)移相關(guān)[4-7].弧菌的致病過程與對蝦生理狀態(tài)、環(huán)境脅迫、菌的攻毒方式等相關(guān).注射和浸浴是病原學(xué)研究中常見的攻毒手段.本文研究凡納濱對蝦在不同濃度和不同感染途徑的哈維氏弧菌作用下，腸道組織形態(tài)、腸道弧菌數(shù)量及蝦體死亡率的變化，為闡明哈維氏弧菌的致病機(jī)理提供理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 攻毒對象及養(yǎng)殖條件

健康的凡納濱對蝦來自山東濱州某養(yǎng)殖場，體長約3.5 cm.正式試驗(yàn)前，凡納濱對蝦暫養(yǎng)于塑料桶(85 cm×55 cm×45 cm)內(nèi)4 d，連續(xù)充氣，以配合飼料飽食投喂.養(yǎng)殖水體鹽度為18‰，水溫26 ℃，pH 8.0，亞硝酸鹽含量0.01 mg·L-1，氨氮含量0.01 mg·L-1.隨后將凡納濱對蝦隨機(jī)分組，每組20尾.在攻毒試驗(yàn)前禁食1 d.

1.2 供試菌株及致病性

試驗(yàn)所用攻毒菌株是從某養(yǎng)殖場瀕死對蝦肝胰腺分離的哈維氏弧菌，由山東省海水養(yǎng)殖病害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離、保存(命名TCBS-G).通過預(yù)試驗(yàn)確定哈維氏弧菌的半致死濃度LD50(7 d)為1.3×107CFU·mL-1.

將分離純化的哈維氏弧菌接種于2216e液體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)20 h，通過分光光度計560 nm(D560 nm)比濁測定后備用.將供試菌液(1.8×107CFU·mL-1)300 mL加入20 L水體中，浸泡20尾試驗(yàn)對蝦，對照組為同體積無菌生理鹽水.浸泡12 h后撈出試驗(yàn)對蝦，徹底換水，健康養(yǎng)殖條件下暫養(yǎng)4 d，每天觀察對蝦被感染后的發(fā)病與死亡情況，以瀕死對蝦重新分離到原感染菌為致病性判定指標(biāo).

1.3 注射攻毒試驗(yàn)

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)立對照組和不同濃度的哈維氏弧菌試驗(yàn)組，每組3個平行.將供試弧菌濃度通過無菌生理鹽水稀釋至105和107CFU·mL-1.采用1 mL無菌注射器將0.1 mL稀釋哈維氏弧菌注射入凡納濱對蝦第五至第六腹節(jié)處，對照組注射同體積的無菌生理鹽水.監(jiān)測所有凡納濱對蝦在哈維氏弧菌感染后的生存情況，并記錄死亡的時間，試驗(yàn)周期為7 d.

1.4 浸浴攻毒試驗(yàn)

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，共設(shè)立3個處理組.將活化的哈維氏弧菌供試菌液[105和107CFU·mL-1]300 mL加入20 L水體中，浸泡20尾試驗(yàn)凡納濱對蝦，同時設(shè)同體積無菌生理鹽水作為對照，每組3個平行.隔離養(yǎng)殖于試驗(yàn)水箱中，浸泡過夜后撈出試驗(yàn)對蝦，徹底換水，暫養(yǎng)，每天觀察凡納濱對蝦感染后的發(fā)病與死亡情況，試驗(yàn)周期為7 d.

1.5 凡納濱對蝦腸道對哈維氏弧菌感染的響應(yīng)

在供試菌株感染凡納濱對蝦12、24、48、72、96 h，分別從對照組和攻毒試驗(yàn)組中隨機(jī)挑取瀕死的凡納濱對蝦3尾，冰上解剖，獲取腸道，-80 ℃無菌保存，備用.將腸道內(nèi)容物稀釋后置于TCBS選擇性培養(yǎng)基上進(jìn)行弧菌計數(shù).將48 h中腸組織樣品置于Bouin氏液中固定，放入不同濃度酒精進(jìn)行梯度脫水后浸蠟、包埋，使用切片機(jī)(SHANDON, AS325)連續(xù)7 μm切片，干燥后利用蘇木精—伊紅(HE)染色法染色，最后觀察并進(jìn)行顯微攝影(OLYMPUS, BX53F).

1.6 計算公式及統(tǒng)計方法

累積死亡率/%=Dt/D0×100(D0和Dt分別為攻毒過程中凡納濱對蝦初始數(shù)量和累計死亡數(shù)量).

采用SPSS 17.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，若差異顯著，則用Duncan′s檢驗(yàn)法進(jìn)行多重比較，顯著性水平為P<0.05.

2 結(jié)果與分析

2.1 供試菌的致病性

凡納濱對蝦被供試哈維氏弧菌感染后出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，而對照組在4 d觀察期內(nèi)均正常.發(fā)病蝦體發(fā)白，肝胰腺出現(xiàn)混濁狀態(tài)，有的呈現(xiàn)淺白色，提取腸胃樣品肉眼觀察，呈現(xiàn)空、透現(xiàn)象；被感染的瀕死對蝦經(jīng)細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)，分離到大量的感染菌，其形態(tài)及理化特性與原感染菌一致(表1).

2.2 注射方式對感染凡納濱對蝦的影響

圖1顯示，高濃度(107CFU·mL-1)試驗(yàn)組的對蝦在第1天便出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，第3天死亡率達(dá)到最大值，之后趨于穩(wěn)定；低濃度(105CFU·mL-1)試驗(yàn)組對蝦出現(xiàn)死亡的時間與高濃度試驗(yàn)組相近，但死亡數(shù)量相對較少，第4天達(dá)到最大值.

2.3 浸浴方式對感染凡納濱對蝦的影響

圖2顯示，高濃度(107CFU·mL-1)試驗(yàn)組對蝦在第1天的死亡情況較低濃度(105CFU·mL-1)試驗(yàn)組嚴(yán)重，第2天死亡數(shù)量急劇增大，第3天死亡率達(dá)到最大值；低濃度試驗(yàn)組死亡情況相對平緩，第4天達(dá)到最大值.

表1 供試菌生化反應(yīng)結(jié)果(陸橋生物有限公司試劑盒)1)Table 1 Biochemical reaction results of V.harveyi tested (Beijing Land Bridge Technology CO, LTD)

1)“+”表示陽性,“-”表示陰性.

圖1 注射哈維氏弧菌7 d內(nèi)凡納濱對蝦累積死亡率Fig.1 Accumulative mortality of L.vannamei injected V.harveyi in 7 days

2.4 腸道內(nèi)容物弧菌數(shù)量對不同攻毒方式的響應(yīng)

不同攻毒方式導(dǎo)致弧菌數(shù)量出現(xiàn)不同程度的增加.注射12 h腸道弧菌數(shù)量未見顯著變化(P>0.05)，第3天達(dá)到最多，與對照組差異顯著(P<0.05)；而浸浴第1天腸道弧菌數(shù)量即大量增加，與對照組差異顯著(P<0.05)，第2天達(dá)到最大值，隨后弧菌數(shù)量發(fā)生回落(表2).

表2 攻毒方式對凡納濱對蝦腸道內(nèi)容物弧菌數(shù)量的影響1)Table 2 Effect of infection methods on Vibrio number in the gut of L.vannamei

1)數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤.同列數(shù)據(jù)后附不同字母者表示差異顯著(P<0.05).

2.5 腸道組織結(jié)構(gòu)對不同攻毒方式的響應(yīng)

由圖3可見，在不同攻毒方式和不用濃度哈維氏弧菌作用下，對蝦腸道組織可分為輕度感染和重度感染.輕度感染主要發(fā)生于低濃度注射試驗(yàn)組，其癥狀為腸道上皮細(xì)胞邊緣略變薄(圖3B).重度感染主要發(fā)生于高濃度試驗(yàn)組，且浸浴感染較嚴(yán)重，癥狀主要為上皮細(xì)胞損傷、變形并脫落，細(xì)胞核裂解，嚴(yán)重者腸黏膜褶皺處向下沉落或脫落，腸壁上環(huán)肌肉與縱肌層也有脫落(圖3F)；高濃度注射試驗(yàn)組表現(xiàn)為細(xì)胞核模糊不清，少許出現(xiàn)上皮細(xì)胞與固有層分離現(xiàn)象(圖3C).

A.注射對照組;B.105 CFU·mL-1注射試驗(yàn)組;C.107 CFU·mL-1注射試驗(yàn)組;D.浸浴對照組;E.105 CFU·mL-1浸浴試驗(yàn)組;F.107 CFU·mL-1浸浴試驗(yàn)組.圖3 不同攻毒方式下凡納濱對蝦腸道組織結(jié)構(gòu)的變化Fig.3 Change of gut histological structure of L.vannamei infected by different methods

3 討論

對蝦被致病菌感染后，在血淋巴、肌肉及肝胰腺內(nèi)細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答等多方面呈現(xiàn)對外界致病菌的防御，但是針對不同攻毒方式下弧菌與對蝦腸道相互作用的研究極為缺乏.Rajendran et al[8]針對甲殼類生物開展了哈維氏弧菌浸浴攻毒試驗(yàn)，觀察發(fā)現(xiàn)浸浴侵染后的動物組織形態(tài)變化與自然侵染相似，說明浸浴攻毒是一種最為自然并且行之有效的侵染生物體的方式[9-10].然而，不同攻毒方式造成的損傷不同，涉及不同的致病機(jī)理.注射攻毒是將病菌經(jīng)對蝦腹節(jié)處注射到肌肉內(nèi)，經(jīng)過自身系統(tǒng)循環(huán)，分散至全身，到達(dá)腸道需要一定的時間和過程；浸浴攻毒是致病菌經(jīng)對蝦口或鰓被攝入體內(nèi)，之后到達(dá)腸道，進(jìn)而傷及全身其他部位和功能.因此，浸浴攻毒比注射攻毒更容易損傷蝦體的腸道組織.本研究中，浸浴攻毒后對蝦出現(xiàn)死亡的時間比注射攻毒早且狀況嚴(yán)重.

甲殼動物被哈維氏弧菌感染后會出現(xiàn)許多疾病[9-10].Diggles et al[10]研究表明，綠巖龍蝦(Jasusverreauxi)被哈維氏弧菌感染后出現(xiàn)蠶食現(xiàn)象，外表皮受傷更便于哈維氏弧菌的寄居繁殖，加重病害程度和發(fā)生范圍.Jayasree et al[11]發(fā)現(xiàn)，斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)在被哈維氏弧菌感染后出現(xiàn)附肢發(fā)紅、外表皮松軟及白便等癥狀，這與本研究中凡納濱對蝦被哈維氏弧菌感染后表現(xiàn)的癥狀相似.

對蝦腸道黏膜褶皺的高低和疏密、上皮細(xì)胞的完整性和數(shù)量等會影響腸道性能[9,12].正常腸上皮細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞間隙清晰，內(nèi)壁為高柱狀上皮組織，腸內(nèi)壁向腸腔凸起形成褶皺[13].對蝦被致病菌感染后，其上皮組織損傷開始于上皮細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)明顯變薄，隨著侵染的加深，腸道上皮細(xì)胞核肥大，核邊緣模糊不清，上皮細(xì)胞核最終完全降解形成胞內(nèi)空洞[14].本研究發(fā)現(xiàn)，在不同方式、不同濃度弧菌攻毒后對蝦腸道的組織結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為輕度感染和重度感染.隨著弧菌濃度的提高和攻毒時間的延長，中腸組織損傷情況逐漸加重.重度感染表現(xiàn)為上皮細(xì)胞完全潰散并脫落，肌層也被損傷.此外，對蝦腸道在受到哈維氏弧菌侵染后，黏膜褶皺處發(fā)生皺縮或損傷直至脫落.然而，有關(guān)對蝦的腸道修復(fù)機(jī)制需進(jìn)一步深入研究.

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