松墨天牛幼蟲腸道纖維素降解細菌的分離與鑒定

胡 霞, 傅慧靜, 李俊楠, 林中平, 張飛萍

(1.福建農(nóng)林大學林學院，福建 福州 350002；2.福州市林業(yè)局，福建 福州 350000)

纖維素是林木蛀干害蟲食物中的主要營養(yǎng)成分，在害蟲完成其正常生長發(fā)育過程中起著重要作用[1].大量研究表明，蛀干害蟲腸道內(nèi)生長著許多微生物，其數(shù)量甚至遠遠超過昆蟲自身細胞的總數(shù)[2].這些微生物可以分泌纖維素降解酶，從而在昆蟲自身消化系統(tǒng)和體內(nèi)共生微生物的協(xié)同作用下，完成對木質(zhì)纖維素的高效降解、消化、吸收和利用[3].因此，蛀干害蟲腸道微生物是其完成生活史不可或缺的協(xié)同因素.

目前已知的蛀干害蟲腸道微生物主要包括細菌、真菌和原生動物，其中真菌、細菌被認為是木質(zhì)纖維素類物質(zhì)的主要降解者.在以往的研究中，國內(nèi)外學者大多關注形態(tài)較大，能夠胞外分泌酶的木質(zhì)纖維素降解真菌，如瑞氏木霉(Trichodermareesei)等[4].但是，目前發(fā)現(xiàn)的纖維素降解真菌大多為好氧菌，它們一般不適宜在昆蟲腸道的缺氧型環(huán)境中生長[5].具有厭氧或兼性厭氧特點的纖維素降解細菌，則能夠在昆蟲腸道內(nèi)維持較高的種群豐度，其種類和數(shù)量要遠遠超過真菌[6].Cazemier et al在1頭太陽甲蟲(Pachnodamarginata)成蟲腸道內(nèi)，就發(fā)現(xiàn)了數(shù)量多達2.5±1.1×108的纖維素降解細菌，而Delalibera et al在楔天牛(Saperdavestita)腸道也發(fā)現(xiàn)了多達0.24～3.57×106的纖維素降解細菌[7,8].由此可見，細菌是蛀干害蟲腸道中降解木質(zhì)纖維素的重要成員.

松墨天牛(MonochamusalternatusHope)是松樹的主要蛀干害蟲，除能直接鉆蛀危害造成松樹衰弱甚至死亡外，還是松材線蟲病的病原物松材線蟲(BursaphelenchusxylophilusNickle)的傳播媒介[9].松材線蟲病作為世界上最危險的森林病害，自1982年傳入中國以來，已造成15個省份，100多萬hm2的松林枯死，經(jīng)濟損失超過200億美元[10].長期以來，控制松墨天牛，切斷松材線蟲病傳播途徑，是我國防控松材線蟲病最重要和最有效的措施之一.與其它蛀干類害蟲相同，在松墨天牛整個生長發(fā)育周期，尤其是幼蟲時期，木質(zhì)纖維是其最主要的營養(yǎng)來源[11]，腸道細菌在天牛幼蟲降解木質(zhì)纖維，幫助消化這類大分子物質(zhì)中可能發(fā)揮了重要作用.目前有關微生物降解纖維素的研究已較為深入，然而有關松墨天牛腸道細菌的纖維素降解研究鮮見報道.本研究通過可培養(yǎng)的方法篩選松墨天牛幼蟲腸道木質(zhì)纖維素降解細菌，并測定其纖維素酶活性，從而為解析松墨天牛幼蟲腸道木質(zhì)纖維素降解細菌的群落結(jié)構(gòu)及功能奠定基礎，也為進一步揭示腸道細菌與松墨天牛的互作關系提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

馬尾松蟲害木采集于福建省連江琯頭鎮(zhèn)(N 26°150′；E 119°593′)，將蟲害木鋸成長約1 m的木段，置于1.5 m3的養(yǎng)蟲籠內(nèi)，養(yǎng)蟲籠用網(wǎng)徑小于2 mm的鐵砂網(wǎng)密封.采用剝開馬尾松樹皮，劈開木段的辦法收集松墨天牛幼蟲以備實驗需要.

1.2 試驗方法

(1)昆蟲的預處理：將收集的松墨天牛幼蟲立即置于濕潤的無菌環(huán)境中，饑餓處理48 h，以排空松墨天牛腸道食物殘渣.選取9頭健康的松墨天牛幼蟲，用75%的酒精浸泡3 min，然后用無菌水漂洗3遍，繼而在體式顯微鏡下進行腸道解剖，將獲得的幼蟲中后腸部分轉(zhuǎn)移至含有0.01 mL磷酸鹽緩沖液(PBS：138 mM NaCl，2.7 mM KCl，pH 7.4)的1.5 mL離心管中.

(2)培養(yǎng)基的配制：參照Delalibera et al[8]的方法，1號液體培養(yǎng)基(濾紙培養(yǎng)基)內(nèi)含有5 g·L-1濾紙條(Whatman)，40 mg·L-1胰蛋白粉(Becton Dickinson, Sparks, MD)，100 mg·L-1麥芽粉(Becton Dickinson)和2 g·L-1CaCO3，pH值為7.0；2號液體培養(yǎng)基(CMC培養(yǎng)基)內(nèi)含有5 g·L-1羧甲基纖維素鈉(CMC, low viscosity; Sigma, St. Louis, MO)，30 mg·L-1酵母浸提物，100 mg·L-1麥芽粉和2 g·L-1CaCO3，pH值為7.0；3號液體培養(yǎng)基內(nèi)含有5 g·L-1磷酸化微晶纖維素(PH105)，1.9 g·L-1K2HPO3，0.94 g·L-1KH2PO3，1.68 g·L-1NaHCO3，1.6 g·L-1KCl，1.43 g·L-1NaCl，0.15 g·L-1NH4Cl，0.037 g·L-17H2O·MgSO4，0.017 g·L-1CaCl2·2H2O和0.1 g·L-1yeast extract，pH值為7.0；4號固體培養(yǎng)基內(nèi)含有5 g·L-1羧甲基纖維素鈉，0.2 g·L-1酵母浸提物和12 g·L-1瓊脂，pH值為7.0[6].

(3)纖維素降解菌的計數(shù)與分離：參照Delalibera的方法，并進行了適當調(diào)整[8].取3只含1 mL PBS的離心管，分別裝入1條松墨天牛幼蟲腸道，用塑料研磨棒研磨10～20次.然后在4 ℃下以4 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心10 s，將腸道微生物從腸道組織分離，作為松墨天牛幼蟲腸道細菌的原始菌液.為方便菌落計數(shù)，依次將原始菌液稀釋至10-9，并分別取各個稀釋梯度菌液100 mL涂布于4號培養(yǎng)基平板上，然后配合剛果紅染色法記錄纖維素降解菌數(shù)；為方便分離純化纖維素降解菌株，將0.1 mL原始菌液轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移至含15 mL以濾紙作為唯一碳源的1號液體培養(yǎng)基或15 mL以CMC作為唯一碳源的2號液體培養(yǎng)基的50 mL三角瓶中，在避光條件下190 r·min-1，28 ℃有氧培養(yǎng)直至觀察到1號培養(yǎng)基中濾紙出現(xiàn)被降解現(xiàn)象.為了確定微生物的微晶纖維素降解活性，將經(jīng)過1號和2號培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選獲得的細菌接種至僅以微晶纖維素作為碳源的3號液體培養(yǎng)基中，在避光處理下190 r·min-1，28 ℃有氧培養(yǎng)7 d.最后將菌液梯度稀釋至10-9，各梯度菌液取0.1 mL涂平板于4號固體培養(yǎng)基，用于菌落計數(shù)及分離松墨天牛幼蟲腸道纖維素降解細菌菌株.該部分所有試驗均設置3次重復.

(4)纖維素酶活性測定：分別在形成菌落的4號固體培養(yǎng)基中加入1 g·L-1剛果紅染液染色30 min，倒出后加入1 mol·L-1NaCl溶液浸洗30 min，倒掉浸洗液后可觀察到菌落周圍形成透明圈，然后通過測量透明圈直徑與菌落直徑的比值判斷該菌落的CMC相對降解活性[12].

(5)形態(tài)鑒定及生理特征測定：通過平板培養(yǎng)后，在光學顯微鏡下觀察并記錄單菌落的顏色，形狀及質(zhì)地等特征，細菌細胞形態(tài)的鑒定參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》的方法，鑒定細菌的菌落顏色、菌體形狀、大小、革蘭氏陰性陽性區(qū)分、有無鞭毛、有無菌膜以及該菌株代表的細菌菌落個數(shù)等[13].

(6)分子鑒定：根據(jù)細菌DNA提取試劑盒(Omega，美國)說明分別提取各細菌總DNA，繼而使用細菌通用引物fD1和rP1擴增細菌16S rDNA，具體辦法參見Hu et al[14].將測序數(shù)據(jù)16S rDNA序列上傳至Genbank(http://www.ncbi.nlm.nih/gov/blast/)，本研究松墨天牛幼蟲腸道具有纖維素降解活性的細菌菌株16S rDNA序列基因登陸號為：KX461909-KX461918.為進一步確定各松墨天牛腸道纖維素降解細菌的分類地位，首先將所有序列與RDPⅡ數(shù)據(jù)庫序列匹配[15]，然后通過BLAST在EzTaxon-e數(shù)據(jù)庫和NCBI數(shù)據(jù)庫中與已知16S rDNA序列比對[16]，下載相似度高且可靠序列用于聚類分析.將測序獲得的所有序列和Genbank下載的可靠相似序列通過MEGA 6.0中的MUSCLE進行匹配，計算最佳模型，構(gòu)建Neighbor-joining系統(tǒng)發(fā)育樹[17,18]，為計算每個分支的支持率，設置自展分析為1000個重復.

1.3 數(shù)據(jù)分析方法

差異顯著性分析均采用F檢驗(SPSS，Version 22).

2 結(jié)果與分析

2.1 松墨天牛幼蟲纖維素降解細菌菌落計數(shù)

以羧甲基纖維素鈉(CMC)作為唯一碳源，結(jié)合剛果紅染色法篩選的松墨天牛幼蟲消化道纖維素降解菌，通過稀釋涂平板法的菌落計數(shù)結(jié)果為每頭(5.2±0.38)×106CFU·mL-1.該結(jié)果與椴六點楔天牛(Saperdavestita)腸道纖維素降解細菌的菌落計數(shù)結(jié)果類似[(0.24～3.57)×106CFU·mL-1]，高于瑞肇大小蠹(Dendroctonurhizophagus)腸道纖維素降解菌的菌落計數(shù)結(jié)果[(2.3±0.43)×103CFU·mL-1][8]，明顯少于太陽甲蟲(Pachnodamarginata)成蟲腸道纖維素降解細菌的菌落計數(shù)結(jié)果[(2.5±1.1)×108CFU·mL-1][7].

2.2 CMC酶活細菌菌株分離與鑒定

不具有相同字母則表明彼此差異顯著.圖1 松墨天牛腸道細菌降解纖維素產(chǎn)生的透明圈與菌落的直徑比率Fig.1 The ratio of the CMC clearance zone diameter to the colony diameter of cellulolytic bacteria associated the gut of Monochamus alternatus

從松墨天牛幼蟲中后腸腸道中分離出154株具纖維素酶活性的細菌，其中65株為濾紙培養(yǎng)基(1號培養(yǎng)基)所得，89株從CMC培養(yǎng)基(2號培養(yǎng)基)中得到.這些菌株均能降解微晶纖維素，且經(jīng)剛果紅染色顯示不同大小的透明圈，其透明圈直徑與菌落的直徑比的平均值1.33～7.09(圖1).降解能力最強菌落降解透明圈直徑比與其它菌株均呈顯著差異(F=33.409，P<0.05).

對篩選獲得的154株具有木質(zhì)纖維素降解能力的細菌進行形態(tài)鑒定，結(jié)合代表菌株的分子鑒定結(jié)果表明這154株細菌分別隸屬于變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門細菌的8個菌屬、10個菌種(表1)(圖2).其中菌株HX-1具有最強的木質(zhì)纖維素降解能力，其纖維素降解透明圈與細菌菌落直徑比為7.09.細菌鑒定結(jié)果表明菌株HX-1隸屬于擬桿菌門(Bacteroidetes)，纖維粘網(wǎng)菌綱(Cytophagia)，噬纖維菌目(Cytophagales)，噬纖維細菌科(Cytophagaceae)，Siphonobacter菌屬，Siphonobacteraquaeclarae菌種.菌株HX-8也具有較強的木質(zhì)纖維素降解能力，其透明圈與菌落直徑比為5.30，經(jīng)鑒定其為叢毛單孢菌(Comamonaskoreensis).菌株HX-4經(jīng)鑒定為假單胞菌(Pseudomonassp.)，其纖維素降解透明圈與細菌菌落直徑比為4.13.菌株HX-7和菌株HX-5纖維素降解透明圈與細菌菌落直徑比近似，分別為3.55和3.30，經(jīng)鑒定二者分別為蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)和環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans).菌株3纖維素降解透明圈與細菌菌落直徑比為2.51，經(jīng)鑒定其為粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens).菌株HX-9為黃色單胞菌(Lysobacterenzymogenes)，其纖維素降解透明圈與細菌菌落直徑比為2.30.菌株HX-10、菌株HX-2和菌株HX-6纖維素降解透明圈與細菌菌落直徑比都較小，分別為1.62、1.43和1.33，經(jīng)鑒定其分別為克雷伯氏桿菌(Klebsiellapneumoniae)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和鞘脂菌(Sphingobiumrhizovicinum).

表1 松墨天牛腸道纖維素降解細菌的形態(tài)鑒定及菌落計數(shù)1)Table 1 Characteristics of cellulose-degrading microorganisms separated from guts of Monochamus alternatus

1)+表示有；-表示無；ND表示未觀察到.

圖2 松墨天牛腸道纖維素降解細菌16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Neighbor-joining phylogenetic tree of 16S rRNA gene fragments of Monochamus alternatus gut cellulolytic bacteria

對篩選培養(yǎng)的154株具有木質(zhì)纖維素降解能力的細菌進行菌落計數(shù)分析，結(jié)果表明，松墨天牛幼蟲腸道纖維素降解細菌群落由46.8%的γ變形菌(γ-Proteobacteria)、31.8%的擬桿菌(Bacteroidetes)、14.3%的厚壁菌(Firmicutes)、3.3%的β變形菌(β-Proteobacteria)和3.9%的α變形菌(α-Proteobacteria)組成(圖3).從菌屬水平分析，有49株細菌被鑒定為噬纖維菌(Siphonobacter)，占腸道纖維素降解細菌群落的31.8%，為松墨天牛幼蟲腸道纖維素降解優(yōu)勢菌；31株沙雷菌(Serratia)占腸道纖維素降解細菌群落的20.1%，24株假單胞菌屬細菌(Pseudomonas)和22株芽孢桿菌屬細菌(Bacillus)分別占腸道纖維素降解細菌群落的15.6%和14.3%；而另外4個菌屬在松墨天牛幼蟲腸道纖維素降解細菌群落中的比例相對較小，其中克雷伯氏桿菌(Klebsiella)占9.7%，鞘脂菌(Sphingobium)占3.9%，叢毛單孢菌(Comamonas)占3.3%，黃色單胞菌(Lysobacter)占1.3%.

圖3 松墨天牛腸道纖維素降解細菌的菌落計數(shù)百分比(n=154)Fig.3 The percent of cellulolytic bacteria derived from Monochamus alternatus

3 討論

本研究采用可培養(yǎng)的方法從松墨天牛幼蟲腸道中獲得154株纖維素降解細菌，分別隸屬于變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門細菌的8個菌屬、10個菌種.相對于其它鞘翅目昆蟲而言，松墨天牛幼蟲腸道纖維素降解菌菌落密度較高，但菌群落結(jié)構(gòu)組成相對簡單，這可能與部分細菌不能被純培養(yǎng)獲得有關[7,14].腸道纖維素降解細菌在蛀干類害蟲高效降解、消化、吸收和利用木質(zhì)纖維素的過程中起到非常重要的作用，對天牛類蛀干害蟲幼蟲腸道纖維素降解細菌的研究已是害蟲生物防治的熱點.曹月青等從桑粒肩天牛(Aprionagermari)幼蟲中腸分離獲得一種兼性厭氧纖維素分解菌[19]；Delalibera et al在椴六點楔天牛(Saperdavestita)幼蟲腸道中也得到了分解纖維素細菌菌群，但這些細菌僅能分解羧甲基纖維素鈉，不具有濾紙降解活性[8]；蘇麗娟等從桃紅頸天牛(Aromiabungii)幼蟲腸道中篩選的一株枯草芽孢桿菌能高效降解纖維素[20]；周峻沛從云斑天牛(Batocerahorsfieldi)幼蟲腸道細菌群落中也發(fā)現(xiàn)了大量具有纖維素酶活的細菌菌群，并認為纖維素降解細菌對云斑天牛的幼蟲生長發(fā)育和抵御寄主營養(yǎng)匱乏具有重要的作用[21].

本研究篩選獲得的噬纖維菌(Siphonobacteraquaeclarae)纖維素降解能力最強，且在松墨天牛幼蟲腸道中表現(xiàn)為優(yōu)勢菌，占腸道纖維素降解細菌群落的31.8%.Wilson和David在S.aquaeclarae所隸屬的噬纖維菌科細菌中發(fā)現(xiàn)存在第三種纖維素降解機制：其既不分泌游離的纖維素酶，也沒有纖維小體結(jié)構(gòu)，而是通過菌體表面分泌纖維素酶并吸附結(jié)晶纖維素，增大接觸面積來實現(xiàn)高效降解[22].基于噬纖維菌科細菌強大的纖維素降解能力和獨特的纖維素降解機制，國內(nèi)外學者先后對該科哈氏噬纖維菌Cytophagahutchinsonii，古字狀菌Runellaslithyformis，蟑螂桿狀體Leadbetterellabyssophila，螺狀菌Spirosomalinguale,Dyadobacterfermentans展開研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這類細菌的纖維素降解酶活力與細胞相關聯(lián)，它們對纖維素的降解可能是細胞表面纖維素酶以及部分非酶蛋白的協(xié)同作用來完成的[23].基于其獨特的纖維素降解機制，松墨天牛腸道內(nèi)木質(zhì)纖維豐富的微環(huán)境，恰好為S.aquaeclarae的大量富集提供可能.另外，噬纖維菌科細菌常常具有高效的纖維素降解能力，這一特性對于以纖維素為主要營養(yǎng)源的昆蟲來說非常重要.松墨天牛幼蟲以馬尾松韌皮部和木質(zhì)部為食物來源，通過松墨天牛的咀嚼和腸道自身分泌的消化酶液等并不能很好地吸收纖維素大分子物質(zhì)，滿足其營養(yǎng)需求，因此，高豐度的具有纖維素降解活性的S.aquaeclarae為松墨天牛幼蟲的營養(yǎng)代謝及生長發(fā)育提供了必要條件.這也可能是S.aquaeclarae在松墨天牛幼蟲腸道占據(jù)種群豐度優(yōu)勢的一個重要原因.在以往對昆蟲腸道微生物的研究中，僅在地下害蟲暗黑鰓金龜幼蟲腸道中有發(fā)現(xiàn)S.aquaeclarae，而對其在暗黑鰓金龜幼蟲該腸道中的功能尚不清晰[24].在松墨天牛腸道中發(fā)現(xiàn)S.aquaeclarae尚屬蛀干類害蟲中的第一例，該菌極有可能是蛀干害蟲腸道木質(zhì)纖維降解細菌的一個新成員.但是，針對該科Siphonobacter屬細菌的木質(zhì)纖維素降解功能和機制還未見報道，作為蛀干害蟲腸道木質(zhì)纖維降解細菌的一個新成員，噬纖維細菌S.aquaeclarae也可能在纖維素酶系組成、酶學特性、功能基因和代謝通路上存在特異性，以適應松墨天牛腸道獨特的微生態(tài)環(huán)境，S.aquaeclarae在松墨天牛腸道的木質(zhì)纖維素降解功能和作用機制還有待于進一步研究.

沙雷菌(Serratia)在松墨天牛幼蟲腸道纖維素降解細菌群落中的比例相對較高，占20.1%，為優(yōu)勢菌屬.沙雷菌為革蘭氏陰性菌，廣泛分布于世界各地，能夠在水，土壤和各種動物腸道等復雜環(huán)境中存活[25].何正波等從桑粒肩天牛幼蟲腸道中也分離出了具有纖維素降解活性的沙雷氏菌屬(Serratia)、芽孢桿菌屬(Bacillus)和克雷伯氏菌屬(Klebsiella)細菌[26].目前研究發(fā)現(xiàn)沙雷菌具有分泌纖維素酶等多種胞外酶的能力[27]，這表明沙雷菌普遍存在于松墨天牛等木食性昆蟲腸道中，并與宿主的纖維素降解功能息息相關.沙雷菌還具有的穩(wěn)定性強和快速適應環(huán)境的能力，這可能也是沙雷菌在松墨天牛幼蟲腸道纖維素降解細菌群落中占據(jù)種群豐度優(yōu)勢的一個重要原因[25].變形菌綱腸桿菌科假單胞菌(Pseudomonas)是松墨天牛幼蟲腸道降解纖維素細菌群落中的第三大類群.Huang等在鞘翅目暗黑鰓金龜(Holotrichiaparallela)幼蟲腸道中也發(fā)現(xiàn)假單胞菌(Pseudomonas)為優(yōu)勢細菌菌群[24].假單胞菌廣泛分布于植物組織、動物組織、水和土壤中，也是動植物的病原菌，但同時許多假單胞菌也具有纖維素降解活性[28-30].

本研究通過單碳源培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)、形態(tài)及分子鑒定和相對纖維素降解活性測定方法，明確了松墨天牛腸道纖維素降解細菌的群落多樣性及部分功能，但腸道細菌纖維素降解機制還有待進一步研究.本研究結(jié)果不僅有助于豐富昆蟲腸道微生物研究素材，還有助于深入理解松墨天牛的營養(yǎng)代謝和生境適應性，并為進一步揭示腸道細菌與松墨天牛的互作關系提供理論依據(jù).

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