水稻光溫敏核不育系Y58S花培后代改良株系的分子鑒定

黃翠紅, 黃明, 陳淳, 楊瑰麗, 周丹華, 黃鈺婷, 羅文龍, 陳志強(qiáng), 王慧

(國(guó)家植物航天育種工程研究中心，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣東 廣州 510642)

水稻光溫敏核不育系Y58S(安農(nóng)S-1/常菲22B//安農(nóng)S-1/Lemont///培矮64S)由湖南雜交水稻研究中心選育，具有廣適性、不育起點(diǎn)溫度低、配合力好、抗逆性強(qiáng)以及株葉形態(tài)好、異交結(jié)實(shí)率高、米質(zhì)優(yōu)良等優(yōu)點(diǎn)[1].自1989年兩系法推廣以來，不育起點(diǎn)溫度“漂變”及制種風(fēng)險(xiǎn)等問題一直制約著其發(fā)展.隨后，人們開始對(duì)提純改良不育系開展了大量的研究，實(shí)踐證明，不斷提純改良不育系是兩系法雜交水稻研究和超級(jí)雜交水稻組合選育的關(guān)鍵.水稻花藥培養(yǎng)技術(shù)自1970在我國(guó)開始至今經(jīng)歷了四十多年的研究與發(fā)展，并且取得了豐碩的成果.通過花藥培養(yǎng)可在短期內(nèi)獲得穩(wěn)定、純合的二倍體，大大縮短了育種年限，且提高選擇效率.但由于花藥培養(yǎng)受較多因素的影響，其綠苗率往往較低，尤其是秈稻品種，其中不同基因型對(duì)花藥培養(yǎng)力影響很大，前人研究認(rèn)為導(dǎo)入一定的粳稻血緣能有效提高花藥培養(yǎng)力[23].

花培后代植株鑒定存在較大的局限性，往往易受外界環(huán)境的影響導(dǎo)致鑒定周期較長(zhǎng)，其中田間種植鑒定是水稻品質(zhì)、外部形態(tài)特征等形狀鑒定的主要方法[2-3].然而，隨著DNA分子標(biāo)記鑒定技術(shù)的不斷發(fā)展，通過DNA分子標(biāo)記鑒定法可從DNA水平上反映遺傳多樣性，具有準(zhǔn)確可靠、取材方便、不受季節(jié)和組織特異性限制等優(yōu)點(diǎn)，能廣泛應(yīng)用于水稻品種種質(zhì)鑒定中.近年來，以SSR標(biāo)記為基礎(chǔ)的DNA指紋鑒定技術(shù)日漸成熟，并能廣泛應(yīng)用于水稻等農(nóng)作物品種的特異性、真實(shí)性及純度鑒定中，應(yīng)用前景較為可觀；應(yīng)用在雜交種質(zhì)鑒定的DNA分子標(biāo)記主要有DNA指紋法和互補(bǔ)擴(kuò)增法[4-13].目前，常用于水稻品種分子檢測(cè)鑒定的方法是聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)法，但該方法不能準(zhǔn)確讀出目標(biāo)DNA片段的大小，檢測(cè)工作量較為繁瑣，且檢測(cè)效率偏低，難以對(duì)大批量品種的DNA指紋鑒定圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行有效整合和準(zhǔn)確比較.因此，有待于建立一套準(zhǔn)確、高效且能直接讀出DNA片段大小的SSR標(biāo)記檢測(cè)新方法、新體系.

本研究在前期工作的基礎(chǔ)上通過對(duì)水稻兩系不育系Y58S與02428進(jìn)行雜交回交的后代(Y58S//02428/02428，BC1F3的兩系不育株系，目的為導(dǎo)入一定的粳稻血緣)進(jìn)行花藥培養(yǎng)，選育出新的光溫敏核不育系株系M196S，在此，結(jié)合本課題組的基因分型平臺(tái).進(jìn)行品種種質(zhì)鑒定與基因分型，檢測(cè)花培后代不育系M196S與各親本間的血緣關(guān)系并進(jìn)行綜合性狀分析，以期快速獲得聚有多個(gè)優(yōu)良基因的改良光溫敏不育系材料.

1 材料與方法

1.1 供試材料

M196S(Y58S//02428/02428 BC1F3的兩系不育株系的花培H2代材料，經(jīng)連續(xù)兩代育性跟蹤調(diào)查均表現(xiàn)為典敗)；對(duì)照(親本)材料：Y58S；02428；培矮64S；安農(nóng)S-1.

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 使用改進(jìn)的CTAB法提取全基因組DNA，并保存于-20 ℃冰箱中待用.

1.2.2 基因檢測(cè)方法 采用T-ARMS-PCR(四引物PCR毛細(xì)管電泳檢測(cè)方法)與SNP-HRM(高分辨溶解曲線)檢測(cè)結(jié)合進(jìn)行.

1.2.3 引物的選擇 使用《水稻品種真實(shí)性鑒定 SSR標(biāo)記法》的48對(duì)引物與本課題組基因分型平臺(tái)開發(fā)的10個(gè)有利基因的標(biāo)記.所用的引物均由上海生工有限公司合成提供.

1.2.4 T-ARMS-PCR分析 PCR 在20 μL體系中進(jìn)行，包括4 μL DNA模板、1.4 μL dNTP、2 μL 10×PCR Buffer、0.1 μLTaq酶(以上試劑均由Takara公司購(gòu)買)、0.4 μL primer (R+F)、14 μL ddH2O.PCR 擴(kuò)增循環(huán)為95 ℃，5 min；94 ℃，40 s；55 ℃，30 s；72 ℃ 45 s；72 ℃，7 min；25 ℃，1 min；33個(gè)循環(huán).PCR擴(kuò)增結(jié)束后，吸取2 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)，使用DNF-900雙鏈DNA試劑盒，并在Fragment analyzer全自動(dòng)毛細(xì)管電泳上進(jìn)行檢測(cè)分析.

HRM分析：采用巢式PCR擴(kuò)增，第一輪多重PCR以基因組DNA為模板，利用外部引物擴(kuò)增；第二輪PCR以稀釋的第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，利用內(nèi)部引物擴(kuò)增.第一輪PCR：反應(yīng)體系依次加入2×PCR Mix母液(北京百泰克)5 μL、2～5對(duì)外部引物F/R(10 μmol·L-1)各0.3 μL以及0.5 μL基因組DAN，最后以雙蒸水補(bǔ)足10 μL.PCR擴(kuò)增循環(huán)為95 ℃，5 min；25×(95 ℃，20 s； 57 ℃，20 s；72 ℃，10 s)；72 ℃，5 min.反應(yīng)完成后，向PCR管加入200 μL雙蒸水，以稀釋第一輪PCR產(chǎn)物(約20倍).第1輪PCR：反應(yīng)體系依次加入2×PCR Mix母液(北京百泰克)4 μL、內(nèi)部引物F/R(10 μmol·L-1)各0.3 μL、0.5 μL 20×EvaGreen染液(Biotium, USA)、以及0.5 μL稀釋過的第一輪PCR產(chǎn)物，最后以雙蒸水補(bǔ)足10 μL.PCR擴(kuò)增循環(huán)為95 ℃，2 min；25×(95 ℃，20 s； 59 ℃，20 s；72 ℃，10 s)；72 ℃，5 min；95 ℃，2 min；25 ℃，2 min.反應(yīng)完成后，向第2輪PCR產(chǎn)物加入20 μL礦物油轉(zhuǎn)移至HRM檢測(cè)板后放入LightScanner96高分辨率溶解曲線分析系統(tǒng)(Idaho Technology Inc，美國(guó))進(jìn)行HRM檢測(cè)，最后以配套的小片段法(small amplicon)進(jìn)行基因分型分析，具體分析步驟按照軟件操作指南進(jìn)行.

1.2.5 結(jié)果統(tǒng)計(jì) 記錄檢測(cè)樣品在48對(duì)引物中的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度，以及花培H2代株系M196S與幾個(gè)親本之間的相似條帶，并對(duì)其之間進(jìn)行相似性比較.

1.2.6 指紋記錄和聚類分析 將擴(kuò)增產(chǎn)物清晰、穩(wěn)定、可重復(fù)的SSR引物的擴(kuò)增結(jié)果統(tǒng)計(jì)后進(jìn)行聚類分析.統(tǒng)計(jì)方法：把各引物的擴(kuò)增產(chǎn)物根據(jù)電泳后特異標(biāo)記有無，分別相應(yīng)轉(zhuǎn)化記錄為數(shù)字1和0，即用“1”表示有擴(kuò)增條帶，“0”表示無擴(kuò)增條帶[14-16].品種間遺傳相似度用公式GS(i,j)=2N(i,j)/[N(i)+N(j)] 計(jì)算，在這里N(i,j)表示品種i和j間共有的擴(kuò)增條帶數(shù), 而N(i)和N(j)分別表示品種i和j各自擴(kuò)增的總條帶數(shù)[17].這個(gè)數(shù)據(jù)矩陣用計(jì)算機(jī)軟件STATISTICA的UPGA (unweighted pair group average)聚類分析計(jì)算連鎖距離的分離百分比(percent disagreement linkage distance)[14].

2 結(jié)果與分析

2.1 花培H2代株系M196S與親本的指紋圖譜數(shù)據(jù)構(gòu)建

利用分布在12條染色體的48對(duì)SSR引物對(duì)花培H2代株系M196S與4個(gè)親本Y58S、02428、培矮64S、安農(nóng)S-1進(jìn)行毛細(xì)管電泳擴(kuò)增(圖1)并記錄各擴(kuò)增片段大小，結(jié)果表明，各對(duì)引物經(jīng)PCR擴(kuò)增出的條帶數(shù)從2～7條不等，擴(kuò)增產(chǎn)物的穩(wěn)定性和重復(fù)性也有所差異，其中M196S分別在RM71、RM85、RM471、RM336、RM311、RM267、RM253、RM481、RM278、RM561、RM551、RM432、RM331、RM21、RM3331、RM567、RM542、RM332 等18對(duì)SSR引物中的擴(kuò)增結(jié)果與Y58S表現(xiàn)一致；在RM471、RM311、RM253、RM258、RM17、RM598、RM542、RM316等8對(duì)引物中的擴(kuò)增結(jié)果與02428表現(xiàn)一致；在RM583、RM71、RM85、RM471、RM274、RM336、RM267、RM253、RM258、RM561、RM8277、RM551、RM331、OSR28、RM21、RM3331、RM231、RM567、RM542等19對(duì)引物中與培矮64S表現(xiàn)一致；而在RM71、RM274、RM336、RM119、RM258、RM561、RM551、RM598、RM432、RM331、RM3331、RM443、RM490、RM423、RM567、RM332、RM7102等17對(duì)引物中與安農(nóng)S-1表現(xiàn)一致.另外，毛細(xì)管電泳檢測(cè)法的準(zhǔn)備度與靈敏度較高，能快速檢測(cè)出DNA片段的準(zhǔn)確大小，同時(shí)利用毛細(xì)管電泳儀的分析軟件能快速無誤地將檢測(cè)結(jié)果轉(zhuǎn)換成數(shù)字(1/0)模式(表1)，便于數(shù)據(jù)分析及圖譜數(shù)據(jù)的構(gòu)建，實(shí)現(xiàn)指紋圖譜數(shù)據(jù)構(gòu)建的高通量.

圖1 M196S等材料在48對(duì)SSR引物中的部分?jǐn)U增結(jié)果Fig.1 Amplification results of the samples at 48 DNA fingerprint markers (section)

2.2 結(jié)果分析

用48對(duì)SSR引物的所有擴(kuò)增條帶對(duì)M196S等5個(gè)供試水稻材料按照遺傳相似度進(jìn)行聚類分析比較，結(jié)果表明，5個(gè)供試水稻材料的遺傳相似度0.45～0.69，在相似度0.45處分為2個(gè)組(圖2)，M196S、安農(nóng)S-1、Y58S和培矮64S為第1組，而02428為第2組.其中，第1組的4個(gè)材料具有較為相近的遺傳背景，Y58S(安農(nóng)S-1/常菲22B//安農(nóng)S-1/Lemont///培矮64S)具有安農(nóng)S-1和培矮64S的血緣，而來自安農(nóng)S-1的血緣大于培矮64S，同時(shí)M196S為Y58S花培后代，也即均具有以上材料血緣.另外，在相似度0.56和0.60處又被各自分組，根據(jù)品種間的相似性，最后分為4組，除了02428單獨(dú)1組外，M196S與安農(nóng)S-1各為1組、Y58S和培矮64S為另1組.這表明花培H2代材料M196S血緣更接近于安農(nóng)S-1，同時(shí)也遺傳了另外3個(gè)兩系不育系親本的血緣，而02428的血緣相對(duì)較少，M196S是花藥培養(yǎng)技術(shù)快速選育出來的1個(gè)新的不育系材料，同時(shí)分析結(jié)果也符合前期田間表現(xiàn)觀察的篩選結(jié)果.

2.3 花培H2代株系M196S綜合性狀的基因分型檢測(cè)

利用本課題組基因分型平臺(tái)分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)對(duì)花培H2代M196S株系進(jìn)行Wxb(低直鏈淀粉基因)、fgr(香味)、Chalk5(堊白度)、Alk(糊化溫度)、Pita(稻瘟病抗性)、Pik-H4(稻瘟病抗性)、Pi2/9(稻瘟病抗性)、Xa23(白葉枯抗性)、Rf3(野敗不育恢復(fù)基因)和Rf4(野敗不育恢復(fù)基因)等多個(gè)關(guān)于米質(zhì)、香味、抗病以及恢復(fù)力等有利基因的檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明(表2)，M196S含有2個(gè)純合的Wxb和Rf3基因，而兩個(gè)對(duì)照(親本)材料，其中Y58S含有4個(gè)純合的Wxb、Alk、Pita、Rf3以及攜帶雜合的Pi2/9基因；02428含有4個(gè)純合的Wxb、Chalk5、Pik-H4、Rf4基因.這表明M196S含有的有利基因均少于兩對(duì)照(親本)材料，而父母親本均為純合基因方能保證后代的穩(wěn)定純合，另一方面，花藥培養(yǎng)能快速得到純合的株系(由加倍單倍體形成的株系，簡(jiǎn)稱DH系)，加快育性的純合穩(wěn)定，然而DH系在加大力度注重育性選擇的過程中卻難免造成一些有利基因的丟失，這與前人研究結(jié)果一致[18-19]，也為后期花藥培養(yǎng)進(jìn)行選育種提供一定的參考價(jià)值.

表1 M196S等材料在48對(duì)SSR標(biāo)記上的毛細(xì)管電泳擴(kuò)增信息(部分)1)Table 1 Fragment sizes and transfer digital format of the samples by capillary and gel electrophoresis with 48 DNA fingerprint markers (section)

1)片段誤差為±0～1 bp.

圖2 用48對(duì)SSR引物對(duì)M196S等5個(gè)水稻品種的聚類分析結(jié)果Fig.2 Clustering of five rice materials with 48 DNA fingerprint markers

2.4 M196S的育性表現(xiàn)

2.4.1 田間育性鑒定 M196S株葉型表現(xiàn)較好(圖3)，將其株系的單株不斷分蔸種植，讓其持續(xù)抽穗，在廣州自然光照(長(zhǎng)日高溫)條件下考察花粉育性，花粉不育度保持在100%，與Y58S的花粉不育度相符，顯微鏡碘液染色檢查結(jié)果顯示為典敗類型.

表2 M196S等材料綜合性狀檢測(cè)結(jié)果的比較1)Table 2 Comprehensive characters of the materials

1)“+”表示含有該基因；“-”表示不含該基因；“H”表示基因型為雜合.

圖3 M196S(左)與Y58S(右)田間種植情況Fig.3 The field performance of M196S (L) and Y58S (R)

2.4.2 光溫箱育性鑒定 將M196S株系處于幼穗發(fā)育期的單株分蔸，用小桶移栽，放置于人工氣候箱長(zhǎng)日低溫條件(23 ℃，14 h)下分別處理0、2、4、6 d后觀察育性的變化，結(jié)果表明處理0～2 d，M196S花粉不育度為100%，處理4～6 d后檢測(cè)花粉不育度為50%～75%，并能收獲少量種子，此結(jié)果也表明了M196S的育性受光溫調(diào)控.

3 討論

3.1 水稻兩系不育系的指紋圖譜鑒定

目前，種質(zhì)鑒定方面應(yīng)用前景較好的分子標(biāo)記主要是以SSR為基礎(chǔ)的DNA指紋圖譜標(biāo)記[5-6]，此類標(biāo)記能在各種生物組織中廣泛存在，具有穩(wěn)定遺傳和共顯性等特點(diǎn)，而且相對(duì)來說，SSR技術(shù)操作簡(jiǎn)單、快速、重復(fù)性好，可直接用于水稻等農(nóng)作物品種的真實(shí)性鑒定，還可鑒別串粉引起的假雜種和雜交種子中混雜的母本雜株[20-21].然而，采用聚丙烯酰胺電泳檢測(cè)法對(duì)SSR指紋圖譜標(biāo)記進(jìn)行水稻品種DNA指紋數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建，如何準(zhǔn)確地對(duì)大批量不同批次、不同膠塊的水稻品種DNA指紋鑒定數(shù)據(jù)進(jìn)行整合一直是個(gè)難題[22].本課題組的基因分型平臺(tái)的DNA提取與檢測(cè)方法經(jīng)反復(fù)多次的應(yīng)用實(shí)踐證明，結(jié)果是準(zhǔn)確可靠的，并很好地解決了大規(guī)模不同批次DNA指紋鑒定數(shù)據(jù)的有效整合和準(zhǔn)確比較的問題，同時(shí)毛細(xì)管電泳檢測(cè)出的各多態(tài)性DNA片段的準(zhǔn)確性更有利于轉(zhuǎn)換成數(shù)字(1/0)模式，便于后期數(shù)據(jù)分析及圖譜數(shù)據(jù)的構(gòu)建.本研究通過電泳檢測(cè)及分析結(jié)果表明，花培H2代材料M196S為異于Y58S的新的改良兩系不育系材料，血緣更接近于安農(nóng)S-1，這與Y58S同樣來源于安農(nóng)S-1有關(guān)，同時(shí)也遺傳了其余3個(gè)親本(培矮64S、Y58S與02428)的血緣，其中與02428血緣較遠(yuǎn)，這與前期田間的選擇淘汰的育種手段有關(guān)，與02428雜交回交是為了保證導(dǎo)入一定的粳稻血緣以提高花藥培養(yǎng)力，隨后經(jīng)3代自交多次選留與母本血緣更為接近的單株，并淘汰偏粳血緣材料，因此，經(jīng)人為選擇育種后的檢測(cè)結(jié)果與預(yù)期的結(jié)果基本一致，也說明了通過與02428雜交導(dǎo)入一定粳稻血緣提高花藥培養(yǎng)力的途徑是有效可行的[23].

3.2 利用花藥培養(yǎng)加快選育進(jìn)程

大量的研究結(jié)果表明，花培育種具有縮短育種年限、選擇效率高和遺傳類型多等特點(diǎn)[24]，主要表現(xiàn)為：第一，加速遺傳特性的穩(wěn)定，使雜種從雜合子迅速達(dá)到純合，從而縮短了育種周期；第二，花粉植株來源于單倍體加倍后的雙單倍體，其基因型與表現(xiàn)型一致，排除了顯性基因遮蓋隱性基因的干擾，大大避免了選擇的盲目性，提高了選擇效率；第三，由于花粉植株是經(jīng)過基因重組，具有多種多樣基因型的每個(gè)花粉粒再生成的植株，在自然加倍過程中不受有性受精過程的競(jìng)爭(zhēng)，且在離體培養(yǎng)過程中或多或少會(huì)誘導(dǎo)基因的突變，使花藥培養(yǎng)后代的遺傳變異類型較常規(guī)，雜交后代更豐富[25].花藥培養(yǎng)可用于水稻新光溫敏核不育系的選育以及原光溫敏核不育系的提純[26-27].通過花藥培養(yǎng)獲得所有的植株在遺傳標(biāo)記位點(diǎn)均為純合，因?yàn)闊o論單倍體、二倍體還是多倍體均由小孢子誘導(dǎo)而來，其中二倍體均為DH系.在單個(gè)性狀選育過程中，通過花藥培養(yǎng)技術(shù)能得到快速純合穩(wěn)定的單株，然而在兩系不育系改良中由于過多集中在育性的選擇上，忽略了其他有利基因如品質(zhì)、抗性基因等，若子代基因型為雜合型時(shí)，對(duì)分離群體的選擇中往往會(huì)造成某些有利基因的丟失，因此在得到育性穩(wěn)定改良兩系不育系株系后可結(jié)合分子輔助選擇育種及時(shí)進(jìn)行檢測(cè)驗(yàn)證，以便于指導(dǎo)后期田間改良工作進(jìn)一步的開展，有待于進(jìn)一步的雜交選育以及結(jié)合分子輔助選擇方法的不斷驗(yàn)證，最終獲得育性穩(wěn)定且聚合有多個(gè)優(yōu)良基因的改良不育系株系.

3.3 分子輔助選擇與花藥培養(yǎng)的結(jié)合

以水稻光溫敏核不育系為母本配制的兩系法雜交水稻具有高效、便捷、受限制因素少的特點(diǎn)，已經(jīng)成為我國(guó)雜交水稻育種中提高產(chǎn)量、改良品質(zhì)的主要途徑之一[28].而分子輔助選擇作為一種有效的輔助育種手段與兩系不育系選育方法的結(jié)合極大地提高了兩系法的效率，同時(shí)結(jié)合花藥培養(yǎng)技術(shù)能大大加快兩系不育系的提純進(jìn)程，縮短育種程序.分子標(biāo)記輔助選擇育種是利用分子標(biāo)記與決定目標(biāo)性狀基因緊密連鎖或表現(xiàn)共分離關(guān)系的特點(diǎn)，通過檢測(cè)分子標(biāo)記檢測(cè)目的基因的存在，實(shí)現(xiàn)對(duì)個(gè)體的目標(biāo)區(qū)域以及全基因組篩選，從而減少連鎖累贅，獲得期望的個(gè)體，以實(shí)現(xiàn)有目的的提高育種效率的輔助手段[29].通過分子標(biāo)記輔助選擇既可以鑒別親緣關(guān)系，也可在回交育種中鑒別數(shù)量性狀和隱性性狀的轉(zhuǎn)移、雜種后代的選擇、雜種優(yōu)勢(shì)的預(yù)測(cè)及品種純度鑒定等各個(gè)育種環(huán)節(jié)，達(dá)到選擇目標(biāo)性狀的目的，具有快速、準(zhǔn)確、不受環(huán)境條件干擾等優(yōu)點(diǎn).基于分子標(biāo)記輔助選擇本課題組開發(fā)了基因分型平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)DNA的自動(dòng)提取以及T-ARMS-PCR技術(shù)、高分辨溶解曲線(HRM)檢測(cè)技術(shù)的完善，保證檢測(cè)結(jié)果更為快速、準(zhǔn)確、可靠，并實(shí)現(xiàn)高通量，這為花培后選育出來的育性改良兩系不育株系進(jìn)一步進(jìn)行綜合性狀改良的進(jìn)程提供保證.

[1] 鄧啟云.廣適性水稻光溫敏不育系Y58S的選育[J].雜交水稻,2005,20(2):15-18.

[2] 辛業(yè)蕓,張展,熊易平,等.應(yīng)用SSR分子標(biāo)記鑒定超級(jí)雜交水稻組合及其純度[J].中國(guó)水稻科學(xué),2005,19(2):95-100.

[3] 李進(jìn)波,方宣鈞,楊國(guó)才,等.兩系雜交稻親本SSR指紋圖譜的建立及其在種子純度鑒定中的應(yīng)用[J].雜交水稻,2005,20(2):50-53.

[4] 陸維忠,鄭企成.植物細(xì)胞工程與分子育種技術(shù)研究[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社,2003:167-181.

[5] 程本義,施勇烽,沈偉峰,等.南方稻區(qū)國(guó)家水稻區(qū)域試驗(yàn)品種的微衛(wèi)星標(biāo)記分析[J].中國(guó)水稻科學(xué),2007,21(1):7-12.

[6] 程本義,施勇烽,沈偉峰,等.水稻品種DNA指紋檢測(cè)技術(shù)體系及其應(yīng)用[J].雜交水稻,2008,23(1):54-59.

[7] 程本義,吳偉,夏俊輝,等.浙江省水稻品種DNA指紋數(shù)據(jù)庫(kù)的初步構(gòu)建及其應(yīng)用[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2009,21(6):555-560.

[8] 朱玉君,毛一劍,莊杰云,等.利用SSR標(biāo)記鑒定雜交水稻種子純度[J].中國(guó)稻米,2009,16(6):24-26.

[9] HUANG X Q, BORNER A , RODER S, et al. Asseing genetic diversity of wheat (TriticumaestivumL.) germplasm using microsatellite markers[J]. Theor Appl Genet, 2002,105:699-707.

[10] 王鳳格,趙久然,郭景倫,等.中國(guó)玉米新品種DNA指紋庫(kù)建立系列研究:Ⅰ.玉米品種純度及真?zhèn)舞b定中SSR技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)體系的建立[J].玉米科學(xué),2003,11(1):3-6.

[11] 李俊芳,張雪原,孫世賢,等.國(guó)家玉米主產(chǎn)區(qū)預(yù)試品種的SSR分析:Ⅰ.預(yù)試品種的真實(shí)性和一致性評(píng)價(jià)[J].玉米科學(xué),2006,14(6):38-42.

[12] 張雪原,趙攀峰,王鳳格,等.玉米品種SSR分子標(biāo)記與田間小區(qū)種植一致性鑒定結(jié)果的比較[J].玉米科學(xué),2009,17(1):40-45.

[13] 王立新,李云伏,常利芳,等.建立小麥品種DNA指紋方法的研究[J].作物學(xué)報(bào),2007,33(10):1 738-1 740.

[14] WENG M L, LIU B, JIN D, et al. Identification of 27 porphyra lines (Rhodophyta) by DNA fingerprinting and molecular markers[J]. Journal of Applied Phycology, 2005,17(1):91-97.

[15] WANG B, JIA J H, SHI J F, et al. Idetification of porphyra lines using computerized DNA fingerprinting[J]. Acta Oceanologica Sinica, 2001,20(3):401-407.

[16] 王斌,賈建航,李傳友,等.通過DNA指紋的計(jì)算機(jī)分析進(jìn)行水稻種質(zhì)鑒定[J].云南大學(xué)學(xué)報(bào),1999,21(S1):20.

[17] NEI M, LI W H. Mathematical model for studying genetic variation interms of restriction endonuclease[J]. Proc Natl Acad Sci, 1979,76(1):5 269-5 273.

[18] 何平,李晶昭,朱立煌.影響水稻花藥培養(yǎng)力的數(shù)量性狀基因座位間的互作[J].遺傳學(xué)報(bào),1999,26(2):524-528.

[19] 唐海芹.水稻花藥培養(yǎng)力的QTL分析[D].廣州：華南農(nóng)業(yè)大學(xué),2009.

[20] 趙久然,王鳳格,郭景倫,等.中國(guó)玉米新品種DNA指紋庫(kù)建立系列研究Ⅱ.適于玉米自交系和雜交種指紋圖譜繪制的SSR核心引物的確定[J].玉米科學(xué),2003,11(2):3-5.

[21] 張彥,郭士偉,何冰,等.利用SSR標(biāo)記建立雜交水稻分子指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2006,22(2):181-183.

[22] 賀梅,黃少鋒,張麗萍,等,花藥培養(yǎng)育種在水稻育種上的應(yīng)用[J],北方水稻,2010,40(1):75-78.

[23] 沈錦驊,李梅芳,陳銀全,等.花藥培養(yǎng)在水稻品種改良上的應(yīng)用[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),1982,4(2):15-19.

[24] 趙維娜.水旱稻雜交F1代花藥培養(yǎng)技術(shù)的研究及其DH系的構(gòu)建[D].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué),2004.

[25] 尹建華.秈型光敏核不育水稻雜種花粉植株的育性表現(xiàn)[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),1993,3(1):27-32.

[26] 向躍武,張志雄,張安中,等.水稻光敏核不育系的花藥和體細(xì)胞培養(yǎng)選育研究[J].西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1993,15(5):462-465.

[27] MOU T M, LU X G, HOAN N T, et al. Two-line hybrid rice breeding in and outside China[C].國(guó)際雜交水稻學(xué)術(shù)研討會(huì),2003.

[28] MARCEL R J, DAVID H. Maker-assisteds election: new tools and strateges[J]. Trendsi Plant Sci, 1998(3):236-239.

[29] REED G H, WITTWER C T. Sensitivity and specificity of single-nucleotide polymorphism scanning by high-resolution melting analysis[J]. Clinical Chemistry, 2004,50(10):1 748-1 754.