超聲波輔助提取檢測(cè)海紅果中吡蟲啉農(nóng)藥殘留的研究

◎ 關(guān)正萍，王君偉，許江彬，關(guān) 正

（1.山西師范大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，山西 臨汾 041000；2.山西師范大學(xué)現(xiàn)代文理學(xué)院，山西 臨汾 041000）

吡蟲啉是用來保護(hù)植物蔬菜防止害蟲侵害的，它可以消滅多種傷害植物的蟲子[1]。近幾年，吡蟲啉的添加量不斷增長(zhǎng)，果蔬中的殘留情況得到了人們的關(guān)注[1]，但吡蟲啉在海紅果中殘留的檢測(cè)方法還沒有出現(xiàn)[1]。

海紅果樹，它是一類抗旱、抗寒、產(chǎn)量高的樹，但在國(guó)內(nèi)卻是比較少有的果樹種類。它最開始產(chǎn)自秦晉蒙交界處，品質(zhì)優(yōu)良[2]。海紅果營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，海紅果實(shí)具有鮮食、干制等用途，同時(shí)具有增進(jìn)食欲等功能，特別對(duì)兒童以及老年缺鈣的癥狀具有良好的食療作用。用其制成的食品特別受百姓青睞，具有經(jīng)濟(jì)開發(fā)潛力。

超聲波輔助提煉結(jié)合HPLC采取超聲波幫助溶劑來提煉，這種方法可減少提煉時(shí)間，提高提煉率[3]。而我國(guó)還未出現(xiàn)明確檢測(cè)海紅果中吡蟲啉含量的方式。為此，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)超聲波輔助提取HPLC來檢測(cè)海紅果中的吡蟲啉的殘留情況。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

主要材料：吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)品100 μg/mL、乙腈（色譜純）、氨基柱(500 mg/3 mL)，均購(gòu)置于沃克化學(xué)儀器單位；干制海紅果，市售；哇哈哈飲用純凈水，超市購(gòu)置。

主要儀器：Agilent 1260高效液相色譜儀，菲爾伯恩實(shí)業(yè)發(fā)展（上海）有限公司；KQ-300E型超聲波清洗器，合肥攀升超聲波科技有限公司；Vortex Genie2T漩渦混合器，上海利聞科學(xué)儀器有限公司；GTR21-1高速冷凍離心機(jī)，基因有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海汗諾儀器有限公司；HP-01真空泵，邦西儀器科技（上海）有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 色譜分析條件的優(yōu)化

（1）檢測(cè)波長(zhǎng)的優(yōu)化。查找國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T23379-2009來確定吡蟲啉的紫外吸收光譜為270 nm[4]。

（2）流動(dòng)相的優(yōu)化。甲醇溶液：色譜級(jí)甲醇溶液1 000 mL，用0.22 μm的有機(jī)濾膜于抽濾裝置中過濾，在功率為800 W、水溫30 ℃的條件下超聲處理20 min，存儲(chǔ)備用。超純水：選用哇哈哈飲用純凈水，用0.22 μm的水系濾膜于抽濾裝置中過濾，在功率為800 W、水溫為30 ℃的條件下超聲處理20 min，存儲(chǔ)備用。此次試驗(yàn)選擇甲醇和水的比例分別為：甲醇∶水=85∶15（V/V）、甲醇∶水=80∶20（V/V）、甲醇∶水=75∶25（V/V）、甲醇∶水=70∶30（V/V）、甲醇∶水=65∶35（V/V）。通過對(duì)照5種差異色譜進(jìn)樣中帶著被測(cè)組分前進(jìn)運(yùn)動(dòng)的物質(zhì)的配比分析圖來確定最優(yōu)甲醇和水的比例[2]。

（3）流動(dòng)相流速的優(yōu)化。試驗(yàn)選擇的進(jìn)樣速度分別設(shè)置為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL/min。通過比較5種不同進(jìn)樣速度的分析圖來確定最優(yōu)流動(dòng)相流速[2]。

（4）色譜柱溫度的優(yōu)化。此次試驗(yàn)選擇的色譜柱溫度分別設(shè)置為20、25、30、35、40 ℃，通過對(duì)照5種不同色譜柱溫度的色譜圖來確定最優(yōu)色譜柱溫度[2]。

1.2.2 正交試驗(yàn)

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，以色譜柱溫度（C）、進(jìn)樣液體速度（B）、流動(dòng)相比例（A）為影響因素，以色譜圖峰面積、對(duì)稱因子為指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗(yàn)。確定最優(yōu)色譜條件組合。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將標(biāo)準(zhǔn)液配制成0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線。首先分別移取0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 mL，10.0 μg/mL吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)品于1 mL進(jìn)樣瓶里面，并用甲醇溶液添加至1 mL，用高效液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)，將檢測(cè)的峰面積對(duì)應(yīng)相應(yīng)的濃度繪制吡蟲啉的標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出線性回歸方程[1]。

1.2.4 系統(tǒng)重現(xiàn)性的確定

選擇曲線中間點(diǎn)濃度為2.0 μg/mL的吡蟲啉樣品，重復(fù)進(jìn)樣5次，檢查儀器系統(tǒng)的穩(wěn)定性[3]。

1.2.5 回收率的測(cè)定

（1）制樣。取無病蟲害、無損壞的干制海紅果可食部分，用純凈水浸泡6 h，粉碎并混合均勻[5-6]。

（2）提取。稱取海紅果樣品4 g（精確至0.01 g）。取10 mL乙腈加到海紅果里面，加上面配制好的溶液，讓其含量依次為0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/kg[2]。同時(shí)，設(shè)置平行樣與空白對(duì)照。用超聲波處理15 min以后，加入2.0 g的氯化鈉，均勻混合10 min，固液分離10 min（5 000 r/min），然后吸5 mL有機(jī)溶劑于新的心型瓶中，在溫度為40 ℃的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋干。

（3）凈化。激發(fā)凈化柱用5 mL甲醇∶二氯甲烷（5∶95），溶解殘?jiān)? mL甲醇∶二氯甲烷（5∶95），反復(fù)3回進(jìn)到活化柱，接到雞心瓶中。洗脫用5 mL甲醇∶二氯甲烷（5∶95），全部接收于雞心瓶中。40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，旋干。加5 mL甲醇置換，混勻，旋干[2]。然后用1 mL甲醇解殘?jiān)黐2]。

（4）過膜。將1 mL溶解殘?jiān)募状歼^0.2 μm的有機(jī)濾膜[2]。

（5）檢測(cè)。HPLC檢測(cè)[2]。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的建立

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

借助GB/T23379-2009，發(fā)覺其最大吸收出現(xiàn)在270 nm處，因此波長(zhǎng)選擇270 nm。

2.1.2 流動(dòng)相配比的確定

此次試驗(yàn)選擇的流動(dòng)相分別為：甲醇∶水=85∶15（V/V），甲醇∶水=80∶20（V/V），甲醇∶水=75∶25（V/V）甲醇∶水=70∶30（V/V），甲醇∶水=65∶35（V/V）。5種比例的流動(dòng)相的檢測(cè)結(jié)果分別對(duì)應(yīng)圖1a-圖1e。

圖1 流動(dòng)相為甲醇∶水（V/V）對(duì)標(biāo)準(zhǔn)液測(cè)量結(jié)果圖

檢測(cè)條件：①檢測(cè)樣品，吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)液10.0 μg/mL。②進(jìn)樣液體速度，0.4 mL/min。③色譜柱溫度30 ℃。④檢測(cè)波長(zhǎng)，270 nm。

由圖1a-圖1e可知：當(dāng)流動(dòng)相為甲醇∶水=85：15（V/V）、甲醇∶水=80∶20（V/V）、甲醇∶水=75∶25（V/V）的時(shí)候，雖能檢測(cè)出吡蟲啉這種物質(zhì)，但峰型對(duì)稱度不高，并且未出現(xiàn)溶劑峰。后經(jīng)檢測(cè)得知當(dāng)以甲醇∶水=65∶35（V/V）檢測(cè)時(shí)，出峰的時(shí)間靠中，峰形對(duì)稱。當(dāng)以甲醇∶水=70∶30（V/V）檢測(cè)的時(shí)候，保留時(shí)間適中，峰形對(duì)稱性更高，溶劑峰與吡蟲啉峰型分開，并且沒有托峰，所以擇優(yōu)選擇甲醇∶水=70∶30（V/V）作為此次試驗(yàn)的色譜進(jìn)樣中帶著被測(cè)組分前進(jìn)運(yùn)動(dòng)的物質(zhì)[7]。

2.1.3 流動(dòng)相流速的確定

試驗(yàn)選擇的進(jìn)樣液體的速度分別設(shè)置為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL/min（結(jié)果分別對(duì)應(yīng)圖2a-圖2e）[8]。不同進(jìn)樣速度的測(cè)量結(jié)果，如圖2所示。

圖2 流速對(duì)標(biāo)準(zhǔn)液檢測(cè)結(jié)果圖

檢測(cè)條件：①檢測(cè)樣品名稱，吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)液10.0 μg/mL。②流動(dòng)相為甲醇∶水=65∶35（V/V）。③色譜柱度30 ℃。④檢測(cè)波長(zhǎng)，270 nm。

由圖2可知，當(dāng)色譜過程中攜帶待測(cè)組分向前移動(dòng)的物質(zhì)的速度為0.2 mL/min的時(shí)候，峰形對(duì)稱性不好且保留時(shí)間太長(zhǎng)；當(dāng)色譜過程中攜帶待測(cè)組分向前移動(dòng)的物質(zhì)的速度為0.4 mL/min的時(shí)候，其保留時(shí)間短，分離度較好，并且峰形對(duì)稱性好，無尾峰；當(dāng)色譜過程中攜帶待測(cè)組分向前移動(dòng)的物質(zhì)的速度為0.6、0.8、1.0 mL/min的時(shí)候，保留時(shí)間雖短，但是對(duì)稱度不高。綜合考慮，選擇色譜過程中攜帶待測(cè)組分向前移動(dòng)的物質(zhì)的速度為0.4 mL/min[2]。

2.1.4 色譜柱溫度的確定

此次試驗(yàn)選擇的色譜柱溫度分別設(shè)置為20、25、30、35、40 ℃（結(jié)果分別對(duì)應(yīng)圖3a-圖3e）。如圖3所示[9]。

圖3 柱溫對(duì)標(biāo)準(zhǔn)液分析結(jié)果圖

檢測(cè)條件：①檢測(cè)波長(zhǎng)，270 nm。②檢測(cè)樣品，吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)液10.0 μg/mL。③流動(dòng)相為甲醇∶水=65∶35（V/V）。④流速，0.4 mL/min。

由圖3a可知，在本試驗(yàn)中，柱溫對(duì)保留時(shí)間、分離度等的影響并不是非常大。綜合考慮，選擇柱溫30 ℃[2]。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，以柱溫（C）、進(jìn)樣液體速度（B）、不同色譜過程中攜帶待測(cè)組分向前移動(dòng)的物質(zhì)比例（A）為影響因素，用峰面積和對(duì)稱因子當(dāng)指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗(yàn)。正交實(shí)驗(yàn)的因素與水平，見表1。

表1 L9（33）正交試驗(yàn)因素和水平表

2.2.1 正交結(jié)果的方差分析表

選擇曲線中間點(diǎn)濃度為2.0 μg/mL的吡蟲啉樣品，采用L9（33）正交試驗(yàn)來確定實(shí)驗(yàn)最佳工藝條件，結(jié)果見表2。

表2 L9（33）正交試驗(yàn)結(jié)果分析表

正交試驗(yàn)極差分析闡明，3個(gè)因素對(duì)吡蟲啉色譜圖的作用次序?yàn)锳BC，即流動(dòng)相的比例＞流速＞柱溫，最佳組合為A2B2C3，即當(dāng)流動(dòng)相比例為甲醇∶水=70∶30（V/V），流動(dòng)相的流速為0.4 mL/min，柱溫35 ℃時(shí)，峰面積最接近測(cè)量值。但由正交表選擇的最理想組合與色譜條件優(yōu)化的理想組合A2B2C2不相同，所以對(duì)以上兩個(gè)組合再進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

2.2.2 最優(yōu)配方選擇驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

由于正交表中的最優(yōu)組合與色譜條件優(yōu)化最優(yōu)組合有差異，故需進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)來保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。選擇曲線中間點(diǎn)濃度為2.0 μg/mL的樣品，分別以A2B2C2與A2B2C3這兩組色譜條件組合進(jìn)行驗(yàn)證，峰面積最接近被測(cè)值的為此次最優(yōu)組合。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果，見表3。

表3 最優(yōu)配方選擇驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表

表3表明：用A2B2C2這一組合的峰面積最接近測(cè)量值，所以此次實(shí)踐的最優(yōu)組合為A2B2C2。當(dāng)流動(dòng)相比例為甲醇∶水=70∶30（V/V），流速為0.4 mL/min，色譜柱溫度30 ℃時(shí)，峰面積最接近測(cè)量值，對(duì)稱性高。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

將標(biāo)準(zhǔn)液配制成0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)曲線樣液，求出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=75.754x+9.170 6及相關(guān)系數(shù)是0.999 2[10-11]。結(jié)果如圖4所示。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

分析圖4可知，本方法定量限為0.05 mg/kg，完全符合國(guó)內(nèi)外規(guī)定殘留最高值（MRL）[1]。

2.4 系統(tǒng)的重現(xiàn)性

選擇曲線中間點(diǎn)濃度為2.0 μg/mL的吡蟲啉樣品，重復(fù)進(jìn)樣5次，檢查儀器系統(tǒng)的穩(wěn)定性[12-13]。檢測(cè)結(jié)果，見表4。由表4可知，吡蟲啉峰面積依次為163.4、160.7、165、164.5、167.2，平均峰面積164.16，說明系統(tǒng)重復(fù)性較好。

表4 重復(fù)進(jìn)樣系統(tǒng)精密度表

2.5 海紅果中吡蟲啉的回收率

使各樣品中吡蟲啉的含量分別為0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/kg[14-15]。同時(shí)設(shè)置3組平行樣與空白對(duì)照[2]。結(jié)果見表5。

表5 海紅果農(nóng)藥殘留量的回收率和變異系數(shù)表（n=10）

當(dāng)海紅果中吡蟲啉的添加量分別為0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/kg時(shí)，平均回收率分別為86.76%、87.65%、92.75%、86.45%、93.65%， 變 異 系 數(shù) 為1.23%～2.4%。結(jié)果表明，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差＜5，在允許范圍內(nèi)[10]，達(dá)到農(nóng)藥殘留分析的條件[16-17]。

3 結(jié)論

此試驗(yàn)為快速檢測(cè)海紅果吡蟲啉的農(nóng)藥殘留研究。首先進(jìn)行色譜條件的優(yōu)化，色譜柱溫度30 ℃；流動(dòng)相配比為甲醇∶水=70∶30（V/V），檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm，流動(dòng)相流速0.4 mL/min。然后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制以及系統(tǒng)重現(xiàn)性和回收率的測(cè)定。結(jié)果表明：當(dāng)添加水平在0.25～4.0 mg/kg時(shí)，回收率均在80%～120%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差＜5；該方法的定量出現(xiàn)的最小值為0.05 mg/kg，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系數(shù)0.999 2。因此，本試驗(yàn)檢測(cè)更準(zhǔn)確、訊速、靈敏，可作為果蔬中吡蟲啉檢測(cè)的技術(shù)支持。

[1]何進(jìn)林，張志華.高效液相色譜法測(cè)定水果中吡蟲啉農(nóng)藥殘留量[J].食品科學(xué)，2011，32（6）：230-232.

[2]王曉靜，馬文平.高效液相色譜法測(cè)定柚子中的4種農(nóng)藥殘留[J].寧夏農(nóng)林科技，2014，55（9）：58-61.

[3]朱啟迪，張改生，趙新亮，等.超聲波輔助提取高效液相色譜法檢測(cè)小麥籽粒中殺雄嗪酸的殘留[J].分析化學(xué)研究簡(jiǎn)報(bào)，2012，3（40）：462-465.

[4]冒銀道，林滬鋒，姜 濤.高效液相色譜法測(cè)定10%吡蟲啉·吡丙醚懸浮劑[J].農(nóng)藥，2015，54（11）：809-810.

[5]劉長(zhǎng)令.世界農(nóng)藥大全：殺蟲劑卷[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2012.

[6]張梅鳳，范金勇，張宏偉，等.新煙堿類殺蟲劑的研究進(jìn)展[J].世界農(nóng)藥，2009，31（1）：22-26

[7]路海燕，李 斌，陳忠正，等.分散固相萃取-HPLC檢測(cè)綠茶茶湯中吡蟲啉和啶蟲脒殘留[J].食品科學(xué)，2013，34（20）：203-206.

[8]王孝輝，宛曉春，侯如燕.茶葉中吡蟲啉農(nóng)藥殘留的液相色譜檢測(cè)方法[J].茶葉科學(xué)，2012，32（3）：203-209.

[9]Bonnechere ONNECHERE A，Hanot V，Jolie R，et al. Effect of household and industrial processing on levels of five pesticide residues and two degradation products in spinach[J].Food Control，2012，25（1）：397-406.

[10]AGUILERA A，VALVERDE A，CAMACHO F，et al.Effect of household processing and unit to unit variability of azoxystrobin, acrinathrin and kresoxim methyl residues in zucchini[J].Food Control，2012，25（2）：594-600.

[11]Kong Z Q，Dong F S，Xu J，et al. Degradation of acephate and its metabolite methamidophos in rice during processing and storage[J].Food Control，2012，23（1）：149-153.

[12]Zhao L W，Ge J，Liu F M，et al. Effects of storage and processing on residue levels of chlorpyrifos in soybeans[J].Food Chemistry，2014（150）：182-186.

[13]Martin L，Mezcua M，F(xiàn)errer C，et al.Prediction of the processing factor for pesticides in apple juice by principal component analysis and multiple linear regression[J].Food additives and Contaminants Part A，2013，30（3）：466-476.

[14]李艷霞，張保東.農(nóng)藥殘留檢測(cè)技術(shù)的研究[J].周口師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2005（9）：79-82.

[15]Jeschke P，Nauen R，Schindler M，et al.Overview of the status and global strategy for neonicotinoids[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2011，59（7）：2897-2908.

[16]Chauhan R，Monga S，Kumari B. Effect of processing on reduction of lambda-cyhalothrin residues in tomato fruits[J].Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology，2012，88（3）：352-357.

[17]李云成，孟凡冰，陳衛(wèi)軍，等.加工過程對(duì)食品中農(nóng)藥殘留的影響[J].食品科學(xué)，2012，33（5）：315-322.