低溫脅迫對(duì)閩楠幼苗形態(tài)及生理特性的影響

安常蓉，韋小麗，葉嘉俊，王明丹，田肖簫

(1.貴州大學(xué) 林學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.安龍縣灑雨鎮(zhèn)林業(yè)站，貴州 安龍 552404)

溫度對(duì)林木生長(zhǎng)發(fā)育具有重要作用，是決定林木地域分布、生長(zhǎng)發(fā)育以及林木生物產(chǎn)量的重要因素。林木受低溫的危害分為凍害和冷害。冷害是指零上低溫對(duì)林木的傷害，凍害則是指零下的低溫對(duì)林木的傷害[1]。相關(guān)研究表明，林木對(duì)冷害的生理生化反應(yīng)主要表現(xiàn)在根系吸收能力下降、膜系統(tǒng)受損、物質(zhì)代謝失調(diào)和呼吸代謝異常；而凍害對(duì)林木的影響表現(xiàn)在含水量降低、保護(hù)物質(zhì)積累和脫落酸含量增高，促進(jìn)植物進(jìn)入休眠[2]。2008年南方特大凝凍災(zāi)害發(fā)生后，越來越多的研究者們致力于林木抗凍性的調(diào)查研究[3-6]，研究表明雪凝天氣會(huì)直接破壞森林植物、改變森林生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)組成、降低生態(tài)系統(tǒng)的功能與效益和影響生態(tài)系統(tǒng)的演替方向。羅在柒等[7-8]研究貴州主要鄉(xiāng)土闊葉樹種幼苗凍害調(diào)查及耐凍樹種選擇，表明幼苗受凍程度主要與樹種耐寒特性、土壤含水狀況、植株木質(zhì)化程度及苗木質(zhì)量有關(guān)。任軍等人對(duì)近幾年來國(guó)內(nèi)外關(guān)于植物抗寒性與形態(tài)結(jié)構(gòu)、膜系統(tǒng)、保護(hù)性酶系統(tǒng)、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、基因等因素的關(guān)系作全面綜述，分析認(rèn)為研究植物抗寒性的生態(tài)習(xí)性、生理生化規(guī)律、環(huán)境因素以及各個(gè)因素之間的調(diào)控機(jī)理，在理論基礎(chǔ)和實(shí)際生產(chǎn)上具有重要價(jià)值[9]。

閩楠〔Phoebebournei(Hemsl.)Yang〕是我國(guó)珍貴用材樹種，漸危種。分布于浙江、福建、江西、廣東、貴州等地區(qū)海拔200-1 000m的常綠闊葉林中，被列為國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物[10]。由于閩楠的漸危，近年來對(duì)閩楠的研究也越來越受到重視，對(duì)閩楠的研究主要集中在種群生態(tài)[11-14]、育苗技術(shù)[15-19]、人工林經(jīng)營(yíng)[20-22]等方面，而關(guān)于閩楠幼苗對(duì)低溫的抗性尚無報(bào)道。冬季低溫是影響苗木新陳代謝和生長(zhǎng)發(fā)育的重要逆境因子之一，幼苗能否忍耐低溫逆境成苗直接關(guān)系到林木育苗的成敗。因此，本研究擬采取人工模擬不同低溫條件，對(duì)一年生閩楠幼苗進(jìn)行冷害培養(yǎng)試驗(yàn)和凍害及危害后的恢復(fù)試驗(yàn)，闡述低溫脅迫后閩楠幼苗葉片形態(tài)和生理生化指標(biāo)的變化，以探討閩楠幼苗對(duì)持續(xù)冷害和短時(shí)間凍害的響應(yīng)，能夠承受的低溫極限及受害后的恢復(fù)能力，為閩楠苗木培育以及人工栽培中應(yīng)對(duì)低溫逆境采取相應(yīng)技術(shù)措施提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)處理分兩部分，即冷害和凍害處理。冷害處理是當(dāng)盆栽閩楠苗完全恢復(fù)生長(zhǎng)，抽出明顯新梢后(當(dāng)年10月)，將其移入4個(gè)RXZ智能型人工氣候箱(寧波江南儀器廠)中，分別設(shè)置25℃(對(duì)照)和3個(gè)冷害溫度即10℃、5℃和0℃，每個(gè)溫度處理的相對(duì)濕度和光照強(qiáng)度均固定設(shè)為80%、1 100Lx，光周期為10h/14h(光/暗)。在處理前澆水使苗盆中的土壤濕度基本一致，而持續(xù)處理過程中不需要補(bǔ)充水分，為了減少處理過程中的水分蒸發(fā)，用留有大小不一帶孔的塑料薄膜覆蓋盆表面。處理后定期觀察每個(gè)溫度處理下閩楠幼苗的形態(tài)變化，并分別在處理2d、10d、20d取樣測(cè)定苗木的生理生化指標(biāo)。凍害處理是將閩楠幼苗放置在可控低溫冰箱即-5℃下凍害處理24h，處理后取出一部分幼苗置于25℃的氣候箱中分別恢復(fù)1h、12h，記錄處理后的形態(tài)變化并取樣測(cè)定生理生化指標(biāo)。以上每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5株苗，即1個(gè)處理15盆苗。

1.3 指標(biāo)的測(cè)定

細(xì)胞質(zhì)膜透性測(cè)定參照電導(dǎo)率法[23]；超氧化物歧化酶(SOD)活性的測(cè)定用氮藍(lán)四唑法[23]；葉綠素含量測(cè)定采用混合液直接浸提法[24]；丙二醛(MDA)含量測(cè)定參照硫代巴比妥酸法[25]；脯氨酸(pro)含量測(cè)定采用酸性茚三酮法[26]。

1.4 數(shù)據(jù)計(jì)算

半致死溫度的計(jì)算參考Logistic曲線方程求得[27]。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算整理和SPSS進(jìn)行方差顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對(duì)閩楠幼苗形態(tài)的影響

對(duì)0-10℃低溫脅迫下閩楠幼苗的形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，2d內(nèi)，各溫度處理下植株的葉形、葉色和枝梢形態(tài)與對(duì)照相比未見明顯變化；0℃處理，在10d以內(nèi)，閩楠葉色仍未見明顯變化，但成熟葉有明顯增厚的跡象，頂梢嫩葉可見萎蔫下垂；20d時(shí)，10℃處理的閩楠成熟葉片萎蔫下垂并伴有少許葉片脫落現(xiàn)象，而0℃處理的葉片還伴有失綠現(xiàn)象。-5℃處理24h后，閩楠幼苗葉片失綠且中下部成熟葉下垂，相繼葉面出現(xiàn)結(jié)冰，葉脈紋理加粗易脫落；常溫恢復(fù)1h和12h后，葉片出現(xiàn)反卷，失綠現(xiàn)象嚴(yán)重，重度萎蔫且嚴(yán)重脫落?？梢姡S著溫度的降低和處理時(shí)間延長(zhǎng)，閩楠幼苗葉片發(fā)生了較為明顯的形態(tài)變化；而短時(shí)間的凍害處理和常溫恢復(fù)后閩楠幼苗葉片發(fā)生了顯著性變化。

2.2 低溫脅迫對(duì)閩楠幼苗生理生化的影響

2.2.1 低溫脅迫2d對(duì)閩楠幼苗生理生化的影響

低溫脅迫2d，不同溫度處理的閩楠幼苗葉綠素含量、MDA含量和脯氨酸含量相比對(duì)照組顯著降低(P<0.05)，而細(xì)胞質(zhì)膜透性、SOD酶活性與對(duì)照組相比無顯著變化(表1)。表明2d的脅迫下閩楠幼苗具有一定的抗寒能力，細(xì)胞組織保護(hù)能力較強(qiáng)。

2.2.2 低溫脅迫10d對(duì)閩楠幼苗生理生化的影響

隨著低溫脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，閩楠幼苗的生理生化指標(biāo)均發(fā)生了顯著性變化，見表2。

表1 低溫脅迫2d閩楠幼苗生理生化分析

注：表中數(shù)值為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”；同一列中標(biāo)注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

表2 低溫脅迫10d閩楠幼苗生理生化分析

由表2可知，幼苗葉綠素含量與對(duì)照相比顯著下降(P<0.05)，但與脅迫2d相比，葉綠素含量下降不明顯；細(xì)胞質(zhì)膜透性和SOD酶活性與對(duì)照相比顯著升高(P<0.05)，0℃處理的細(xì)胞質(zhì)膜透性和SOD酶活性升高最明顯，分別比對(duì)照高1.3倍和1.4倍；10℃和5℃處理的MDA含量與對(duì)照相比顯著下降，而0℃處理則與對(duì)照相比不顯著，但與脅迫2d相比，各處理的幼苗葉片MDA含量明顯下降；與脅迫2d相比，幼苗葉片脯氨酸含量明顯增加但均顯著小于對(duì)照，其原因是低溫下閩楠幼苗通過脯氨酸積累增強(qiáng)滲透調(diào)節(jié)的能力低于高溫的影響。綜上所述，脅迫10d時(shí)，閩楠幼苗葉片內(nèi)葉綠素對(duì)低溫的脅迫比較敏感，導(dǎo)致其色素合成繼續(xù)受阻，此時(shí)，細(xì)胞組織開始受到一定的影響，質(zhì)膜透性逐漸增大，但MDA含量呈下降趨勢(shì)，下降原因是由于SOD酶活性增加較快，較高的SOD酶活性能夠抑制膜脂質(zhì)過氧化作用，使得MDA含量下降。

2.2.3 低溫脅迫20d對(duì)閩楠幼苗生理生化的影響

由表3可知，隨著低溫脅迫時(shí)間的持續(xù)，閩楠幼苗葉片細(xì)胞質(zhì)膜透性、MDA含量、SOD酶活性顯著增加(P<0.05)，而葉綠素含量和脯氨酸含量繼續(xù)顯著降低(P<0.05)。其中，10℃、5℃和0℃處理的葉片細(xì)胞質(zhì)膜透性與對(duì)照相比顯著增大，分別比對(duì)照高133.70%、147.94%和159.18%；同樣，10℃、5℃和0℃處理的SOD酶活性與對(duì)照相比顯著增加，分別比對(duì)照高109.82%、109.03%和105.49%。與脅迫10d相比，幼苗葉片MDA含量和脯氨酸含量明顯增加，但各溫度處理的脯氨酸含量均顯著低于對(duì)照。另外，0℃處理的幼苗除細(xì)胞質(zhì)膜透性明顯高于其他溫度處理外，葉綠素含量、MDA含量、SOD活性和脯氨酸含量均低于10℃和5℃處理，說明在此溫度內(nèi)，植物組織受到嚴(yán)重脅迫，加劇細(xì)胞質(zhì)膜的破壞，顯著降低植物的抗寒能力。

表3 低溫脅迫20d閩楠幼苗生理生化分析

2.2.4 凍害及恢復(fù)處理對(duì)閩楠幼苗生理生化的影響

表4表明，-5℃處理24h和常溫恢復(fù)1h和12h后，閩楠幼苗葉片葉綠素含量、MDA含量、SOD酶活性和脯氨酸含量發(fā)生顯著變化，而細(xì)胞質(zhì)膜透性變化不顯著(P>0.05)。其中，與-5℃/24h處理相比，常溫恢復(fù)1h、12h后其葉片葉綠素含量顯著下降，說明閩楠幼苗經(jīng)過短時(shí)間的凍害后，其葉綠素結(jié)構(gòu)遭受嚴(yán)重破壞，又經(jīng)過短時(shí)間的常溫恢復(fù)，其葉綠素合成結(jié)構(gòu)徹底被破壞；-5℃/24h及常溫恢復(fù)處理后，細(xì)胞質(zhì)膜透性呈現(xiàn)先增加后降低趨勢(shì)，常溫恢復(fù)1h的細(xì)胞質(zhì)膜透性最大，隨著恢復(fù)時(shí)間延長(zhǎng)，葉片細(xì)胞質(zhì)膜透性降低且低于凍害處理，即凍害后再進(jìn)行極短時(shí)間的恢復(fù)對(duì)細(xì)胞質(zhì)膜傷害最大且不可逆，而隨著恢復(fù)時(shí)間增加，植株在凍害過程中沒有完全受到傷害的組織開始緩解；-5℃/24h及常溫恢復(fù)處理后，閩楠幼苗的SOD酶活性高于持續(xù)的冷害處理，表明短時(shí)間的凍害和常溫恢復(fù)1h處理，閩楠幼苗對(duì)低溫具有一定的防御反應(yīng)，即引起SOD酶活性的增加，以此來減緩傷害，但常溫恢復(fù)12h后，幼苗SOD酶活性降低，可見植株遭受到嚴(yán)重破壞；-5℃/24h處理，閩楠幼苗MDA含量略小于20d的冷害處理，即短時(shí)間的凍害處理下植物組織受到嚴(yán)重脅迫，體內(nèi)膜脂過氧化物作用不斷加強(qiáng)，經(jīng)過常溫1h的恢復(fù)后，葉片MDA含量與凍害處理相比呈下降趨勢(shì)，這是由于SOD酶活性增加的緣故，常溫恢復(fù)12h后，幼苗葉片的SOD酶活性下降，而MDA含量增加，說明延長(zhǎng)恢復(fù)時(shí)間，閩楠的防御系統(tǒng)已受到較嚴(yán)重的傷害，植株恢復(fù)能力較弱；-5℃/24h及常溫恢復(fù)處理后，閩楠幼苗葉片脯氨酸含量呈先增加后降低的趨勢(shì)，其短時(shí)間的凍害和1h的常溫恢復(fù)處理使得葉片脯氨酸含量增加，這是由于游離脯氨酸對(duì)低溫凍害及常溫恢復(fù)反應(yīng)敏感，但隨著恢復(fù)時(shí)間延長(zhǎng)，脯氨酸含量顯著下降，表明細(xì)胞受到嚴(yán)重凍害而難以恢復(fù)。

表4 凍害及恢復(fù)處理下閩楠幼苗生理生化的分析

2.3 閩楠幼苗的半致死溫度

根據(jù)閩楠幼苗葉片在不同溫度處理下的細(xì)胞質(zhì)膜透性，用Logistic方程y=k/(1+ae-bx)擬合，計(jì)算該Logistic方程的二階導(dǎo)數(shù)，并令其等于0，則可獲得曲線拐點(diǎn)，x=Ln(lna)/b。本試驗(yàn)根據(jù)Logistic方程得出閩楠幼苗凍害脅迫的半致死溫度為-2.9℃。由閩楠幼苗的半致死溫度及在零上低溫時(shí)其細(xì)胞質(zhì)膜透性的變化規(guī)律，可以初步判定，0℃是閩楠幼苗受到傷害的一個(gè)臨界值，超過20d的0℃低溫，幼苗的傷害程度接近于半致死溫度的傷害。在生產(chǎn)實(shí)踐中，閩楠植株可以通過自身的積極響應(yīng)以適應(yīng)5℃以上的低溫環(huán)境，但隨著溫度的降低或持續(xù)長(zhǎng)時(shí)間的低溫或者短期的凍害天氣將會(huì)嚴(yán)重影響該樹種的正常生理代謝，對(duì)其苗木的生長(zhǎng)發(fā)育也會(huì)造成較大傷害。

3 結(jié)論與討論

在正常情況下，植株體內(nèi)的各種生理生化反應(yīng)都是比較穩(wěn)定而協(xié)調(diào)的，當(dāng)植物受到逆境脅迫時(shí)，其體內(nèi)的指標(biāo)都相應(yīng)地發(fā)生變化，這是植物對(duì)逆境做出的反應(yīng)[28]。因此可以通過冷害和凍害以及常溫恢復(fù)處理下植物體內(nèi)生理生化指標(biāo)的變化，探究其幼苗的受害程度，從而為林木育苗防寒防凍措施的制定提供理論依據(jù)。

葉片是植物進(jìn)化過程中對(duì)環(huán)境變化比較敏感且可塑性較大的器官，環(huán)境變化常導(dǎo)致葉的形態(tài)解剖結(jié)構(gòu)的響應(yīng)與適應(yīng)[29]。通常植物通過調(diào)整細(xì)胞的生理生化狀態(tài)來適應(yīng)短期的環(huán)境變化，通過結(jié)構(gòu)發(fā)育改變適應(yīng)長(zhǎng)期的環(huán)境變化。本試驗(yàn)結(jié)果表明，2d內(nèi)，各溫度處理下植株的葉形、葉色和枝梢形態(tài)與對(duì)照相比未見明顯變化；0℃處理，在10d以內(nèi)，閩楠葉色仍未見明顯變化，但成熟葉有明顯增厚的跡象，頂梢嫩葉可見萎蔫下垂；20d時(shí)，10℃處理的閩楠成熟葉片萎蔫下垂并伴有少許葉片脫落現(xiàn)象，而0℃處理的葉片還伴有失綠現(xiàn)象。-5℃處理24h時(shí)閩楠幼苗葉片出現(xiàn)失綠、結(jié)冰和下垂的現(xiàn)象，在25℃條件下恢復(fù)1h和12h后，葉片重度萎蔫，嚴(yán)重脫落。因此，在低溫脅迫下，閩楠幼苗葉片形態(tài)的變化可能與低溫導(dǎo)致植物生理脫水有關(guān)[30]，而葉色的變化則與低溫下新葉綠素合成降低、原有葉綠素破壞有關(guān)。

低溫脅迫可引起植物體內(nèi)活性氧代謝失調(diào)，導(dǎo)致葉綠體結(jié)構(gòu)被破壞，從而影響光合速率[31]。前人的研究表明低溫脅迫會(huì)引起植物葉綠素含量的下降[32-33]。本試驗(yàn)中，閩楠幼苗葉片內(nèi)葉綠素含量隨溫度的降低和脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而持續(xù)下降，這和前人的結(jié)論是一致的，其下降原因是持續(xù)低溫處理導(dǎo)致葉綠素合成受阻，而短期凍害及常溫恢復(fù)處理則直接破壞葉綠素結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其葉片失綠。葉綠素含量的減少一方面是對(duì)低溫脅迫的反應(yīng)，另一方面也是長(zhǎng)期適應(yīng)低溫的響應(yīng)[34]。

植物體內(nèi)細(xì)胞的膜系統(tǒng)以及細(xì)胞器膜體系與植物抗寒性有十分密切的關(guān)系，以質(zhì)膜相對(duì)透性來表示植物在低溫傷害下細(xì)胞質(zhì)膜透性的變化是鑒定植物抗寒性較常用的方法[35-37]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著冷害溫度的降低和時(shí)間的延長(zhǎng)，閩楠幼苗葉片細(xì)胞質(zhì)膜透性顯著增大。-5℃/24h及常溫恢復(fù)處理后，細(xì)胞質(zhì)膜透性呈現(xiàn)先增加后降低趨勢(shì)，常溫恢復(fù)1h的細(xì)胞質(zhì)膜透性最大，隨著恢復(fù)時(shí)間延長(zhǎng)，葉片細(xì)胞質(zhì)膜透性降低且低于凍害處理，說明凍害后再進(jìn)行極短時(shí)間的恢復(fù)對(duì)細(xì)胞質(zhì)膜傷害最大且不可逆，但隨著恢復(fù)時(shí)間增加，植株在凍害過程中沒有完全受到傷害的組織開始緩解。

伴隨著SOD活性的變化，細(xì)胞內(nèi)的MDA含量也發(fā)生相應(yīng)的變化。馮建燦等人發(fā)現(xiàn)低溫下喜樹(Camptothecaacuminata)幼苗SOD活性與MDA含量之間存在著一定程度的負(fù)相關(guān)[38]。在試實(shí)驗(yàn)中，低溫處理10d時(shí)，閩楠幼苗SOD活性與對(duì)照相比顯著上升，而MDA含量與對(duì)照相比呈下降趨勢(shì)；-5℃凍害處理24h，幼苗的SOD活性顯著增加，25℃恢復(fù)1h后SOD活性持續(xù)上升，恢復(fù)12h后則有所下降，MDA含量變化與SOD活性變化趨勢(shì)相反?？梢?，本研究結(jié)論與前人一致。值得關(guān)注的是凍害下閩楠幼苗的SOD活性顯著高于冷害處理，但MDA含量則與不同時(shí)間的冷害處理接近，說明凍害下高的SOD活性顯著抑制了MDA的產(chǎn)生。由此可見，SOD酶活性和MDA含量對(duì)低溫變化十分敏感，是衡量閩楠幼苗抗寒性較好的指標(biāo)[39]。

脯氨酸是一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，它能夠維持細(xì)胞正常代謝，消除有毒物質(zhì)，保護(hù)膜蛋白和保持水分，可作為抗寒性鑒定指標(biāo)之一[40-41]。本試驗(yàn)中，隨著冷害溫度的降低和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，閩楠幼苗的脯氨酸含量持續(xù)增加，但都低于對(duì)照，說明低溫下閩楠幼苗通過脯氨酸積累增強(qiáng)滲透調(diào)節(jié)的能力低于高溫的影響，與前人[42]的研究一致。凍害處理下，葉片內(nèi)脯氨酸含量與冷害處理相比則明顯下降，且常溫恢復(fù)1h、12h均不能恢復(fù)，說明-5℃處理使幼苗受到嚴(yán)重傷害而失去滲透調(diào)節(jié)能力以致后期恢復(fù)困難。不同植物在不同條件下不一定通過同一途徑來抵抗外界的不良環(huán)境，從脯氨酸在逆境條件下積累的途徑來看，它既可能有適應(yīng)性的意義，也有可能是細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能受損傷的表現(xiàn)，因此植物抗逆境的途徑是多種多樣的[43]。

綜上所述，閩楠幼苗在經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的冷害處理，能夠通過自身保護(hù)酶作用和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累，使植株能夠維持10-20d的正常生長(zhǎng)，超過20d，幼苗葉形發(fā)生明顯的變化且生理特性與對(duì)照相比顯著上升或下降，說明此時(shí)苗木已遭受嚴(yán)重的低溫傷害。另外，對(duì)閩楠幼苗進(jìn)行短時(shí)間的凍害及常溫恢復(fù)處理時(shí)，幼苗葉形和大部分生理生化指標(biāo)均發(fā)生顯著的變化，表明植株的生理代謝受到嚴(yán)重影響以致恢復(fù)生長(zhǎng)較困難。在生產(chǎn)實(shí)踐中，冬季有持續(xù)長(zhǎng)時(shí)間的冷害或短期的凍害天氣，因此，在進(jìn)行閩楠苗木培育時(shí)，應(yīng)根據(jù)溫度的變化及時(shí)做好防寒措施，保證苗木正常生理代謝和生長(zhǎng)發(fā)育?？傊?，在低溫脅迫下，植物會(huì)通過各種生理生化變化來適應(yīng)低溫環(huán)境以更好地生長(zhǎng)。但該試驗(yàn)僅測(cè)了一年生閩楠幼苗在低溫脅迫下的形態(tài)變化和部分生理生化指標(biāo)，如果要深入地研究閩楠幼苗的抗寒性還需結(jié)合幼苗光合特性和其他生理指標(biāo)(如POD、CAT等)以及不同的生長(zhǎng)發(fā)育階段來進(jìn)行綜合分析。此外，還需細(xì)化溫度梯度的設(shè)置，真正了解一年生幼苗忍耐的極限溫度和持續(xù)低溫的最長(zhǎng)時(shí)間。

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