大花香水月季葉綠體基因組密碼子使用偏性分析

牛 元，徐 瓊，王崳德，代立蘭，莊 健，趙亞蘭

(蘭州市農(nóng)業(yè)科技研究推廣中心，甘肅 蘭州 730010)

密碼子是生命遺傳信息傳遞過程當(dāng)中的基本單位。20種自然界中存在的氨基酸中，每種對(duì)應(yīng)至少1種，最多6種密碼子。同義密碼子即編碼相同氨基酸的密碼子[1]。如果沒有任何選擇壓力或者基因突變偏倚，則同義密碼子以相同概率出現(xiàn)。但實(shí)際生命體中，同義密碼子的使用頻率存在差異，形成密碼子使用偏性，即某物種或基因偏向使用同一種或幾種特定的同義密碼子[2]。研究表明，密碼子使用偏性廣泛存在于細(xì)菌、真菌、植物、動(dòng)物及人類中，其影響因素有很多，如基因序列堿基組成的偏好性[3-4]、自然選擇效應(yīng)[5-6]、tRNA豐度[7-10]、mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)[11-12]、氨基酸保守性[3]及每個(gè)蛋白的疏水性水平等。研究密碼子使用偏性不但可以確定最優(yōu)密碼子，從而設(shè)計(jì)基因表達(dá)載體，提高目的基因表達(dá)量，還可以利用已知密碼子使用模式來判斷未知基因的表達(dá)，或者根據(jù)其與某種功能的關(guān)聯(lián)程度，來預(yù)測(cè)某些未知功能基因。

薔薇屬(Rosa)是現(xiàn)代月季品種群的重要親本，我國(guó)擁有諸多薔薇屬植物的基因資源和優(yōu)良種質(zhì)[13]。大花香水月季(R.odoratavar.gigantea)屬薔薇科薔薇屬的落葉灌木，也稱巨花薔薇，為所有薔薇屬野生種中開花最大者，具有氣味芳香、花型大、耐低溫等優(yōu)良園藝性狀，為香水月季原始親本類型之一，是培育薔薇科大花品種的重要種質(zhì)資源[14]。月季新品種的選育主要依賴于有性雜交和自然突變中的選擇，隨著技術(shù)的發(fā)展，目前多利用分子標(biāo)記等生物學(xué)手段達(dá)到輔助選育的目的[13,15]。大花香水月季主要分布在我國(guó)云南及緬甸、泰國(guó)及越南等與我國(guó)接壤的邊境處[16]。蹇洪英[17]等通過核型分析鑒定其為二倍體；育種方面，王其剛[18]等研究了雌蕊群的授粉率和花粉管生長(zhǎng)途徑，為大花香水月季的資源保護(hù)提供了依據(jù)；孟令寧[19]等、李純佳[20]等建立了以帶腋芽的莖段為外植體的再生體系，為遺傳改良奠定了基礎(chǔ)；天然群體遺傳性分析方面，邱顯欽[21]、邵珠華[22-23]等分別通過表型分析、SSR分子標(biāo)記等手段進(jìn)行了研究，J.MENG[24-25]等通過開發(fā)微衛(wèi)星分子標(biāo)記，并從生物地理學(xué)和生物多樣性保護(hù)角度分析了其群體結(jié)構(gòu)；此外，X.L.Guo[26]等從花期調(diào)控的角度對(duì)其與多季開花的品種“月月粉”進(jìn)行了比較轉(zhuǎn)錄組方面的研究。大花香水月季葉綠體基因組的測(cè)序現(xiàn)已實(shí)現(xiàn)，但未見有文獻(xiàn)報(bào)道其密碼子應(yīng)用方面的研究。本研究通過對(duì)大花香水月季葉綠體基因組密碼子使用偏性的分析，討論影響密碼子偏性形成的主要因素，了解密碼子用法，為今后對(duì)外源基因進(jìn)行改造，提高以大花香水月季為目的宿主的外源基因的表達(dá)效率具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 序列獲取與整理

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載大花香水月季葉綠體基因組序列(GeneBank登錄號(hào)為KF753637，序列全長(zhǎng)156 634 bp)。根據(jù)其注釋信息可知該葉綠體基因組共包含88條基因編碼序列，占全長(zhǎng)的50.92%。將下載到的88條CDS(coding DNA sequence)，剔除30條長(zhǎng)度<300 bp及非3整數(shù)倍的序列和4條重復(fù)基因序列，篩選出54條序列用于本研究各項(xiàng)分析。

1.2 方法

1.2.1 密碼子偏好性分析 運(yùn)用軟件CodonW對(duì)大花香水月季54條基因序列的ENC(有效密碼子數(shù))、GC1、GC2、GC3(密碼子第1、2、3位的GC含量)、GCall(密碼子總GC含量)、RSCU(密碼子使用相對(duì)概率)、CAI(密碼子適應(yīng)指數(shù))、CBI(密碼子偏好指數(shù))及Fop(最優(yōu)密碼子頻率)等參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并用SPSS21.0做相關(guān)性分析。

1.2.2 中性繪圖分析 將各基因的GC3為橫坐標(biāo)，GC12(GC1和GC2的平均值)為縱坐標(biāo)作圖，分析密碼子3個(gè)不同位點(diǎn)堿基組成間的相關(guān)性，判斷密碼子偏性的主要影響因素。若GC12與GC3顯著性不相關(guān)，說明第1、2 位與第3 位堿基組成差異較大，密碼子偏性更多受選擇影響。反之，若兩者顯著相關(guān)，同時(shí)回歸系數(shù)接近1，說明3個(gè)位點(diǎn)堿基組成相似，密碼子偏性主要受突變影響[27]。

1.2.3ENC繪圖分析 將各基因的GC3、ENC值分別作為橫、縱坐標(biāo)，分析密碼子偏性受堿基組成的影響。理論ENC值的計(jì)算方法為：ENC=2+GC3+29/(GC32+(1-GC3)2)，理論值代表僅由堿基組成決定其偏性?；蚍植荚跇?biāo)準(zhǔn)曲線之下較遠(yuǎn)位置，說明該基因密碼子偏性受選擇因素影響；而在標(biāo)準(zhǔn)曲線上或附近分布的基因， 其偏性僅受突變影響[28]。

1.2.4 對(duì)應(yīng)性分析 為闡明在密碼子使用模式上不同基因的變異趨勢(shì)，基于RSCU值，應(yīng)用codonW軟件進(jìn)行對(duì)應(yīng)性分析。所有基因經(jīng)軟件處理后，分布于一個(gè)58維(58個(gè)同義密碼子)的向量空間中，根據(jù)基因間值的變異及向量的情況，可判斷密碼子偏性的主要影響因素。密碼子使用的最大變化差異量體現(xiàn)在第1軸，隨后副軸依次降低?；蛟诘?、2軸之間的分散程度，代表了密碼子的主要變化趨勢(shì)。以第1、2軸分別作橫、縱坐標(biāo)作圖，圖中每個(gè)點(diǎn)(基因)的分布，可作為其密碼子使用模式的判斷依據(jù)[29]。

1.2.5 PR2-plot分析 選擇4種密碼子編碼的氨基酸進(jìn)行密碼子第3位上4種堿基組成情況的分析，以G3/(G3+C3)|4作為橫坐標(biāo)，以A3/(A3+T3)|4作為縱坐標(biāo)作圖，圖的中心點(diǎn)(A=T且G=C)發(fā)出的矢量表示偏性的方向和程度[30]。

1.2.6 最優(yōu)密碼子分析 鑒定大花香水月季葉綠體基因組的最優(yōu)密碼子，須結(jié)合高頻率密碼子和高表達(dá)密碼子。根據(jù)軟件計(jì)算得到的RSCU值，將>1的密碼子確定為高頻密碼子。以ENC值為偏好性標(biāo)準(zhǔn)，分別選擇兩級(jí)10%的基因，建立高低偏性庫(kù)，將△RSCU>0.08的密碼子視為高表達(dá)密碼子。最終將同時(shí)滿足2種條件的密碼子定義為大花香水月季葉綠體基因組的最優(yōu)密碼子[31]。

2 結(jié)果與分析

2.1 密碼子偏好性分析

大花香水月季葉綠體基因組的54條DNA編碼序列的堿基組成與ENC值，由codonW計(jì)算得出(表1)，得到其密碼子3個(gè)堿基平均GC含量為38.54%，第1位GC含量為47.09%，第2位為39.55%，第3位為38.54%?？梢钥闯雒艽a子不同位置的GC含量并非平均分布，分布趨勢(shì)為第1位最高，其次為第2位，第3位最低。因此，在大花香水月季中，葉綠體基因組的密碼子使用頻率以A/T結(jié)尾的高于以G/C結(jié)尾的，這與葉綠體基因組富含AT的特征相符合。

ENC的理論值范圍是21～61，其值表示密碼子偏性的強(qiáng)弱[28]。值為20時(shí)，偏性最強(qiáng)，即同義密碼子完全偏倚，值為61時(shí)，代表完全沒有偏倚。從表 1中可以看到，54個(gè)基因的ENC值取值范圍35.94～57.63，平均為48.40，說明該基因組密碼子偏性較弱。

各位置的GC含量與ENC值的相關(guān)性分析見表2，GC1與GC2極顯著相關(guān)，但GC1、GC2與GC3均不顯著相關(guān)，說明葉綠體基因組密碼子堿基中，第1位與第2位相似度極高，與第3位差別較大。ENC值與GC1相關(guān)性不顯著，與GC2顯著相關(guān)，與GC3相關(guān)性極顯著，說明第2、3位堿基對(duì)密碼子偏好性有影響，但第3位影響較大。

表1 依據(jù)功能分類的各基因密碼子不同位置的GC含量Table 1 GC content of different positions of each gene classified according to function

注：ENC即有效密碼子數(shù)；GC1即密碼子第1位的GC含量；GC2即密碼子第2位的GC含量；GC3即密碼子第3位的GC含量；GCall即密碼子總GC含量；類別1表示核糖體蛋白編碼基因；類別2表示光合作用相關(guān)蛋白編碼基因；類別3表示保守基因ycf；類別4表示遺傳結(jié)構(gòu)相關(guān)的基因；類別5表示其他蛋白表達(dá)基因；下同。

表2 各基因相關(guān)參數(shù)的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of gene related parameters

注：*代表P<0.05；**代表P<0.01。表4同。

2.2 中性繪圖分析

大花香水月季葉綠體基因組各基因中性繪圖分析見圖1。GC12最小值為0.328，最大值0.540；GC3最小值0.201，最大值0.368。其中僅有ycf2基因的GC12與GC3的比值為1.03，在圖中接近對(duì)角線。此外，圖中其余各點(diǎn)均分布在對(duì)角線上方。Pearson相關(guān)性統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)表明GC3與GC12相關(guān)性不顯著，且回歸系數(shù)(斜率)為0.196 1，表示在堿基組成上的變異無明顯關(guān)聯(lián)。由此推斷，密碼子的用法受突變影響較弱，可能是受到翻譯選擇壓力的限制[27]。

圖1 中性繪圖分析Fig.1 Neutrality plot analysis

2.3 ENC繪圖分析

從ENC與GC3的相關(guān)性分析可以看出(圖 2)，大花香水月季葉綠體基因大部分都偏離了基因預(yù)期值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，表明除由堿基突變引發(fā)的差異影響該基因組密碼子偏性外，影響更多來自選擇效應(yīng)。ENC值相對(duì)較小的基因位于標(biāo)準(zhǔn)曲線下方，說明這種類型偏好使用特定密碼子，其密碼子偏性較強(qiáng)；而位于曲線上方的基因的ENC值相對(duì)較大，說明此類基因使用密碼子具有隨機(jī)性，具有相對(duì)較弱的密碼子偏性。此外，ENC比值頻數(shù)的分析結(jié)果表明(表3)，多數(shù)分布在-0.05～0.15，此范圍內(nèi)ENC的實(shí)際值與期望值相差較大。

2.4 對(duì)應(yīng)性分析

以第1軸和第2軸分別為橫、縱坐標(biāo)，將各基因在平面中分布。其中，分布相對(duì)集中的是光合系統(tǒng)基因，其他基因的分布較為分散。由表4可見，第一軸與CAI、CBI呈負(fù)顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.509和-0.35，與ENC、GC和GC3相關(guān)系數(shù)分別為0.069、-0.221和0.18，但均未達(dá)顯著水平。說明大花香水月季葉綠體密碼子偏性的影響因素中，CAI與CBI影響較大，其他因素也有一定影響。

圖2 GC3與ENC關(guān)聯(lián)分析Fig.2 Analysis of relationship between GC3 and ENC

表3 ENC比值頻數(shù)分布Table 3 Frequency distribution of ENC ratio

圖3 對(duì)應(yīng)性分析(RSCU)Fig.3 Corresponding analysis (RSCU)

2.5 PR2分析

通過PR2-plot分析，可以說明大花香水月季葉綠體基因組中4個(gè)密碼子編碼的氨基酸家族中第3位堿基的類別的使用情況(圖4)，基因在平面圖的4個(gè)區(qū)域中不均勻分布，基因較多分布在左下方圖中，說明密碼子第3位堿基的使用存在偏好性，嘧啶的使用比嘌呤更頻繁，即從使用頻率上看，T高于A，C高于G。而當(dāng)密碼子的使用僅由突變影響時(shí)，這4種堿基從使用頻率上看是一致的。由此推斷本研究中大花香水月季葉綠體基因組密碼子使用模式，受突變影響的同時(shí)，還受到其他因素的影響，如選擇壓力等。

表4 各度量指標(biāo)與第一軸的相關(guān)性Table 4 Correlation between the measurement index and the first axis

2.6 最優(yōu)密碼子分析

將54條CDS作為一個(gè)整體，運(yùn)行codonW計(jì)算RSCU值，選出RSCU>1的密碼子為高頻密碼子，即TTT、TTA等30個(gè)密碼子為大花香水月季葉綠體的高頻密碼子(表 5中以下劃線顯示)。將codonW計(jì)算得到的ENC值大小排序，前10%(前5條基因)構(gòu)成高表達(dá)基因庫(kù)，后10%構(gòu)成低表達(dá)基因庫(kù)。分別計(jì)算密碼子在2個(gè)基因庫(kù)中的RSCU值，從中篩選出△RSCU≥0.08的密碼子，即TTT、CTT等32個(gè)密碼子為高表達(dá)優(yōu)越密碼子(表5中以*號(hào)表示)，其中有12個(gè)以G結(jié)尾，8個(gè)以T結(jié)尾，7個(gè)以A結(jié)尾，5個(gè)以C結(jié)尾。

結(jié)合高頻密碼子和高表達(dá)優(yōu)越密碼子，將同時(shí)滿足2種條件的密碼子確定為大花香水月季葉綠體基因組的最優(yōu)密碼子。即最終確TTT、CTT、TCA、ACA、TAT、TAA、CAT、AAT、GAT、TGT、CGA、AGT和GGA等13個(gè)密碼子，且均以A或T結(jié)尾，其中8個(gè)以T結(jié)尾，5個(gè)以A結(jié)尾。

注：圖中各點(diǎn)代表了所研究的各個(gè)基因。G3/(G3+C3)|4置信區(qū)間(95%)為0.480±0.029，A3/(A3+T3)|4置信區(qū)間(95%)為0.445±0.021。

圖4PR2bias-plot分析圖
Fig.4 Analysis of PR2 bias plot

表5 大花香水月季葉綠體基因組最優(yōu)密碼子確定Table 5 Determination of preferred codons in chloroplast genome of Rosa odorata var.gigantea

續(xù)表5

氨基酸密碼子高表達(dá)基因組數(shù)目RSCU低表達(dá)基因組數(shù)目RSCU△RSCU基因組數(shù)目RSCUCCA70.97 131.11 -0.14 2561.12 CCG??60.83 40.34 0.49 1340.59 ThrACT111.07 231.92 -0.85 4291.56 ACC100.98 121.00 -0.02 2110.77 ACA???161.56 121.00 0.56 3351.22 ACG??40.39 10.08 0.31 1220.44 AlaGCT291.78 392.44 -0.66 5431.81 GCC???120.74 30.19 0.55 1920.64 GCA140.86 161.00 -0.14 3161.06 GCG?100.62 60.38 0.24 1470.49 TyrTAT?271.74 191.46 0.28 6601.62 TAC40.26 70.54 -0.28 1530.38 TERTAA???42.40 31.80 0.60 301.67 TAG00.00 21.20 -1.20 130.72 HisCAT?71.27 81.14 0.13 3811.49 CAC40.73 60.86 -0.13 1300.51 GlnCAA241.45 191.90 -0.45 6071.54 CAG??90.55 10.10 0.45 1790.46 AsnAAT?301.46 311.32 0.14 7941.53 AAC110.54 160.68 -0.14 2410.47 LysAAA271.64 281.75 -0.11 8581.53 AAG?60.36 40.25 0.11 2600.47 AspGAT??261.68 121.20 0.48 7131.62 GAC50.32 80.80 -0.48 1660.38 GlTGAA441.40 371.64 -0.24 8601.49 GAG?190.60 80.36 0.24 2950.51 CysTGT?61.50 31.20 0.30 1771.51 TGC20.50 20.80 -0.30 580.49 TERTGA???10.60 00.00 0.60 110.61 TrpTGG141.00 171.00 0.00 3791.00 ArgCGT80.76 181.46 -0.70 2911.38 CGC50.48 50.41 0.07 880.42 CGA?181.71 191.54 0.17 2861.36 CGG?60.57 40.32 0.25 980.46 SerAGT??111.40 90.92 0.48 3271.24 AGC30.38 101.02 -0.64 1050.40 ArgAGA161.52 231.86 -0.34 3741.77 AGG???100.95 50.41 0.54 1290.61 GlyGGT181.29 362.00 -0.71 4931.31 GGC?100.71 80.44 0.27 1700.45 GGA?181.29 211.17 0.12 5621.50 GGG?? 100.71 70.39 0.32 2780.74

注：*代表△RSCU>0.08，**代表△RSCU>0.3,***代表△RSCU>0.5。帶下劃線顯示的密碼子表示其基因組RSCU>1，加粗顯示的密碼子表示其為最優(yōu)密碼子。

3 結(jié)論與討論

大花香水月季葉綠體基因組密碼子的使用受突變影響較弱，更多地受到如選擇壓力等其他因素的影響。最終結(jié)合高頻密碼子和高表達(dá)優(yōu)越密碼子，確定了TTT、CTT、TCA、ACA、TAT、TAA、CAT、AAT、GAT、TGT、CGA、AGT和GGA等13個(gè)密碼子為大花香水月季葉綠體基因組的最優(yōu)密碼子。

密碼子使用偏性是物種對(duì)基因組環(huán)境和自然進(jìn)化壓力的適應(yīng)性選擇， 影響密碼子使用偏性的因素有很多，如基因序列堿基組成的偏好性、自然選擇效應(yīng)、mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)、基因長(zhǎng)度、tRNA豐度及每個(gè)蛋白的疏水性水平及氨基酸保守性等[3-12]。其中，最普遍的影響因素即密碼子的堿基組成，密碼子第3位上堿基突變受到的選擇壓力較小，因此，GC3通常被作為分析密碼子使用的重要依據(jù)。本研究中中性繪圖分析顯示密碼子第1、2位與第3位堿基組成變異無明顯關(guān)聯(lián)。而PR2-plot分析顯示，密碼子第3位堿基的使用存在偏性，嘧啶比嘌呤使用更為頻繁。這與前人對(duì)陸地棉(Gossypiumhisutum)[32]和小麥(Triticumaestivum)[33]葉綠體基因組的研究結(jié)果相一致。而楊國(guó)鋒[34]等對(duì)蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)葉綠體基因組的研究發(fā)現(xiàn)，密碼子第3位的堿基使用頻率上，T高于A，G高于C。張?jiān)聵s[35]研究禾本科植物發(fā)現(xiàn)，第3位堿基T的使用頻率高于A，G和C的使用頻率相當(dāng)。說明不同植物的葉綠體基因組的堿基組成存在一定差異，密碼子偏好的影響因素也不同。

ENC值指基因序列中，同義密碼子平均使用頻率與密碼子使用頻率，兩者偏差的量化值，取值范圍20～61。參照F.Wright[28]等的研究，以35作為偏性強(qiáng)弱的區(qū)分標(biāo)準(zhǔn)，據(jù)此判斷大花香水月季葉綠體基因組密碼子偏性較弱。本研究中，確定高表達(dá)優(yōu)越密碼子時(shí)，基于ENC值建立了高低表達(dá)基因庫(kù)。依據(jù)△RSCU值劃分等級(jí)，△RSCU>0.08、0.3和0.5的分別有32、17個(gè)和6個(gè)。其中，△RSCU>0.5的6個(gè)密碼子全是以A或T結(jié)尾的密碼子。結(jié)合高頻密碼子和高表達(dá)優(yōu)越密碼子得到的13個(gè)最有密碼子均以A或T結(jié)尾，這與蝴蝶蘭(Phalaenopsisaphroditesubsp.formosana)[36]、刺五加(Eleutherococcussenticosus)[37]、陸地棉[32]和苦蕎(Fagopyrumtataricum)[38]等植物葉綠體基因的密碼子偏性分析結(jié)果一致，說明大花香水月季與其他雙子葉植物一樣偏愛使用以AT結(jié)尾的密碼子。

參考文獻(xiàn)：

[1] RéDEI G P.Encyclopedia of genetics,genomics,proteomics and informatics[M].Berlin:Springer,2008:383.

[2] DURET L.Evolution of synonymous codon usage in metazoan[J].Current Opinion in Genetics & Devolopment,2002,12(6):640-649.

[3] ROMERO H,ZAVALA A,MUSTO H.Codon usage inChlamydiatrachomatisis the result of strand-specific mutational biases and a complex pattern of selective forces[J].Nucleic Acids Research,2000,28(10):2084.

[4] KARLIN S,MRZEK J.What drives codon choices in human genes[J].Journal of Molecular Biology,1996,262(4):459-472.

[5] SHARP P M,LI W H.An evolutionary perspective on synonymous codon usage in unicellular organisms[J].Journal of Molecular Evolution,1986,24(1/2):28-38.

[6] SHARP P M,COWE E.Synonymous codon usage inSaccharomycescerevisiae[J].Yeast,1991,7(7):657-678.

[7] MORIYAMA E N,POWELL J R.Codon usage bias and tRNA abundance inDrosophila[J].Journal of Molecular Evolution,1997,45(5):514.

[8] IKEMURA T.Correlation between the abundance ofEscherichiacolitransfer RNAs and the occurrence of the respective codons in its protein genes:a proposal for a synonymous codon choice that is optimal for theE.colitranslational system [J].Journal of Molecular Biology,1981,146(1):1-21.

[9] PERCUDANI R,PAVESI A,OTTONELLO S.Transfer RNA gene redundancy and translational selection inSaccharomycescerevisiae[J].Journal of Molecular Biology,1997,268(2):322-330.

[10] DURET L.tRNA gene number and codon usage in theC.elegansgenome are co-adapted for optimal translation of highly expressed genes [J].Trends in Genetics,2000,16(7):287.

[11] GU W,ZHOU T,MA J,etal.Folding type specific secondary structure propensities of synonymous codons[J].IEEE Transactions on Nanobioscience,2003,2(3):150-157.

[12] GU W,ZHOU T,MA J,etal.The relationship between synonymous codon usage and protein structure inEscherichiacoliandHomosapiens[J].Biosystems,2004,73(2):89-97.

[13] 白錦榮,張啟翔,潘會(huì)堂,等.薔薇屬分子生物技術(shù)研究進(jìn)展[J].西北林學(xué)院學(xué)報(bào),2009,24(6):43-49.

BAI J R,ZHANG Q X,PAN H T,etal.Recent advances in molecular biotechnology of the genusRosaL[J].Journal of Northwest Forestry University,2009,24(6):43-49.(in Chinese)

[14] WYLIE A P.The history of garden roses [M].London:Joural of the Royal Horticultural Society,1954:555-571.

[15] 張非亞,羅玉蘭,有祥亮,等.基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的月季SSR標(biāo)記開發(fā)及花色遺傳性分析[J].西北林學(xué)院學(xué)報(bào),2017,32(4):81-86.

ZHANG F Y,LUO Y L,YOU X L,etal.Development of SSR markers based on the transcriptome data of rose and analysis of flower color inheritance[J] Journal of Northwest Forestry University,2017,32(4):81-86.(in Chinese)

[16] GU C Z,ROBERTSON K P.Rosa (Rosaceae):Vol.9.[M].Beijing & St.Louis:Science Press & Missouri Botanical Garden Press,2003:339-381.

[17] 蹇洪英,張顥,張婷,等.香水月季(RosaodorataSweet)不同變種的染色體及核型分析[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào),2010,11(4):457-461.

JIAN H Y,ZHANG H,ZHANG T,etal.Karyotype analysis of different varieties onRosaodorataSweet[J].Journal of Plant Genetic Resources,2010,11(4):457-461.(in Chinese)

[18] 王其剛,劉紅明,晏慧君,等.大花香水月季的授粉率及花粉管生長(zhǎng)途徑[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2012,27(3):391-395.

WANG Q G,LIU H M,YAN H J,etal.Pollination rate and pollen tube growth in the gynoecium ofRosaodorataSweet var.gigantea[J].Journal of Yunnan Agricultural University,2012,27(3):391-395.(in Chinese)

[19] 孟令寧,晏慧君,張顥,等.大花香水月季再生體系的初步建立[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2012,27(6):870-874.

MENG L N,YAN H J,ZHANG H,etal.Prelimary establishment of the regeneration system ofRosaodoratavar.gigantea[J].Journal of Yunnan Agricultural University,2012,27(6):870-874.(in Chinese)

[20] 李純佳,張顥,周寧寧,等.大花香水月季(Rosaodoratavar.gigantea)莖段組織培養(yǎng)的抗褐化研究[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2012,25(3):1047-1050.

LI C J,ZHANG H,ZHOU N N,etal.Study on anti-browning in shoots tissue culture ofRosaodoratavar.gigantea[J].Southwest China Journal of Agriculture Sciences,2012,25(3):1047-1050.(in Chinese)

[21] 邱顯欽,唐開學(xué),蹇洪英,等.云南大花香水月季居群遺傳多樣性的SSR分析[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2011,30(3):300-304.

QIU X Q,TANG K X,JIAN H Y,etal.SSR markers based genetic diversity of populations ofRosaodorataSweet var.giganteain Yunnan Province[J].Journal of Huazhong Agricultural University,2011,30(3):300-304.(in Chinese)

[22] 邵珠華,李名揚(yáng),邱顯欽,等.大花香水月季天然群體表型多樣性研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2010(2):184-187.

SHAO Z H,LI M Y,QIU X Q,etal.Study on phenotypic diversity ofR.Odoratasweetvar.giganteaunder natural population[J].Jiangsu Agricultural Sciences,2010(2):184-187.(in Chinese)

[23] 邵珠華.大花香水月季與長(zhǎng)尖葉薔薇的遺傳多樣性研究[D].重慶:西南大學(xué),2010.

[24] MENG J,LI D,YI T,etal.Development and characterization of microsatellite loci forRosaodoratavar.giganteaRehder & E.H.Wilson (Rosaceae)[J].Conservation Genetics,2009,10(6):1973-1976.

[25] MENG J,HE S L,LI D Z,etal.Nuclear genetic variation ofRosaodoratavar.gigantea(Rosaceae):population structure and conservation implications[J].Tree Genetics & Genomes,2016,12(4):65.

[26] GUO X L,YU C,LUO L,etal.Comparative transcriptome analysis of the floral transition inRosachinensis‘Old Blush’ andR.odoratavar.gigantea[J].Scientific Reports,2017,7(1):6068.

[27] SUEOKA N.Directional mutation pressure and neutral molecular evolution[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1988,85(8):2653.

[28] WRIGHT F.The 'effective number of codons' used in a gene[J].Gene,1990,87(1):23.

[29] MCINERNEY J O.Replicational and transcriptional selection on codon usage inBorreliaburgdorferi[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1998,95(18):10698-10703.

[30] SUEOKA N.Two aspects of DNA base composition:G+C content and translation-coupled deviation from intra-strand rule of A = T and G = C.[J].Journal of Molecular Evolution,1999,49(1):49.

[31] DURET L,MOUCHIROUD D.Expression pattern and,surprisingly,gene length shape codon usage inCaenorhabditis,Drosophila,andArabidopsis[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1999,96(8):4482-4487.

[32] 尚明照,劉方,華金平,等.陸地棉葉綠體基因組密碼子使用偏性的分析[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,44(2):245-253.

SHANG M Z,LIU F,HUA J P,etal.Analysis on codon usage of chloroplast genome ofGossypiumhirsutum[J].Scientia Agricultura Sinica,2011,44(2):245-253.(in Chinese)

[33] ZHANG W J,ZHOU J,LI Z F,etal.Comparative analysis of codon usage patterns among mitochondrion,chloroplast and nuclear genes inTriticumaestivumL[J].植物學(xué)報(bào):英文版,2007,49(2):246-254.

[34] 楊國(guó)鋒,蘇昆龍,趙怡然,等.蒺藜苜蓿葉綠體密碼子偏好性分析[J].草業(yè)學(xué)報(bào),2015,24(12):171-179.

YANG G F,SU K L,ZHAO Y R,elal.Analysis of codon usage in the chloroplast genome ofMedicagotruncatula[J].Acta Prataculturae Sinica,2015,24(12):171-179.(in Chinese)

[35] 張?jiān)聵s.禾本科葉綠體基因組密碼子使用模式及紫莖澤蘭葉綠體RNA編輯分析[D].陜西楊陵:西北農(nóng)林科技大學(xué),2013.

[36] 續(xù)晨,賁愛玲,蔡曉寧.蝴蝶蘭葉綠體基因組密碼子使用的相關(guān)分析[J].分子植物育種,2010,8(5):945-950.

XU C,BEN A L,CAI X N.Analysis of synonymous codon usage in chloroplast genome ofPhalaenopsisaphroditesubsp.formosana[J].Molecular Plant Breeding,2010,8(5):945-950.(in Chinese)

[37] 邢朝斌,曹蕾,周秘,等.刺五加葉綠體基因組密碼子的用法分析[J].中國(guó)中藥雜志,2013,38(5):661-665.

XING Z B,CAO L,ZHOU M,etal.Analysis on codon usage of chloroplast genome ofEleutherococcussenticosus.[J].China Journal of Chinese Materia Medica,2013,38(5):661-665.(in Chinese)

[38] 胡莎莎,羅洪,吳琦,等.苦蕎葉綠體基因組密碼子偏愛性分析[J].分子植物育種,2016,14(2):309-317.

HU S S,LUO H,WU Q,etal.Analysis of codon bias of chloroplast genome of Tartary Buckwheat[J].Molecular Plant Breeding,2016,14(2):309-317.(in Chinese)