has-miR-155-5p靶基因預測及其生物信息學分析

，

(南華大學公共衛(wèi)生學院，湖南 衡陽 421001)

成熟的miRNA (microRNA)是一類長約19-23nt內(nèi)源表達的非編碼單鏈小RNA分子，其作為基因表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子普遍存在于動植物體內(nèi)和病毒體內(nèi)[1]。miRNA通過并入到RNA誘導的沉默復合物(RISC)中并與其互補靶mRNA特異性結(jié)合來發(fā)揮沉默功能，其靶向mRNA的主要方式包括翻譯抑制、mRNA裂解、改變mRNA穩(wěn)定性。早期研究發(fā)現(xiàn)，miRNA對發(fā)育時間、細胞死亡、細胞增殖、免疫、神經(jīng)系統(tǒng)模式等生物學過程的調(diào)控至關(guān)重要[2]。

MiR-155-5p定位于人染色體 21q21.3，是一個典型的多功能miRNA，由 B 細胞整合簇(稱為BIC或miR-155HG)基因的高保守區(qū)13kb區(qū)域內(nèi) 3 個外顯子編碼組成[3]。在活化的B/T細胞、單核細胞、巨噬細胞中miR-155-5p均呈現(xiàn)顯著高表達。值得注意的是由于具有不同的表達譜,miR-155-5p在免疫反應、炎癥反應、造血譜系分化、病毒感染、心血管疾病以及癌癥等病理生理過程中起關(guān)鍵作用[4]。目前，對miR-155-5p的研究主要集中在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用，所以用生物信息學方法分析miR-155-5p的靶基因?qū)窈筇剿鱩iR-155-5p在癌癥診斷和治療中的功能作用十分重要。本文通過對預測得到的miR-155-5p靶基因集合進行基因本體論 (Gene ontology， GO)注釋和京都基因與基因組百科全書 (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes， KEGG)分析，了解其生物學特性及功能，為今后開展miR-155-5p研究提供方向和分子基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 miR-155-5p的序列保守性分析運用miRbase數(shù)據(jù)庫 (http://www.mirbase.org/)在線查找各物種已知的成熟miR155-5p 堿基序列，比對分析miR-155-5p序列在各物種之間的保守性。

1.2 miR-155-5p的靶基因預測采用miRanda (http://www.microrna.org/)，miRDB(http://www.mirdb.org/)，TargetScan(http://www.targetscan.org/)和Clip-Seq(http://mirtarclip.mbc.nctu.edu.tw/) 4個在線數(shù)據(jù)庫預測miR-155-5p的靶基因，用Venny2.1.0畫韋恩圖得到4個數(shù)據(jù)庫預測結(jié)果的交集。

1.3 miRNA-155-5p靶基因的GO功能注釋根據(jù)Gene ontology數(shù)據(jù)庫查找的基因GO注釋，以本物種的所有基因為背景基因，用超幾何分步法計算P值，顯著性閾值取P<0.05，獲得相對于背景基因具有統(tǒng)計意義的GO高頻率注釋。Gene ontology功能注釋由細胞組件(cellular component)、分子功能(molecular function)、生物過程(biological process) 3個部分組成。

1.4 miR-155-5p預測靶基因的KEGG Pathway分析用KOBAS 3.0軟件對預測到的miR-155-5p靶基因集合進行信號轉(zhuǎn)導通路富集分析。P值的計算采用DAVID (http://david.abcc.ncifcrf.gov/)數(shù)據(jù)庫中軟件附帶的 Fisher exact test計算，顯著性閾值取P<0.05，獲相對于背景基因具有統(tǒng)計學意義的基因集合信號轉(zhuǎn)導通路。

2 結(jié) 果

2.1各物種成熟miR-155-5p序列的保守性分析檢索在線數(shù)據(jù)庫miRBase發(fā)現(xiàn)人(has)miR-155-5p基因序列號為MIMAT0000646，其前體64個堿基定位于21號染色體25573980-25574044位。通過miRBase對小鼠(mmu)、大鼠 (rno)、野豬 (ssc)等10個物種的miR-155-5p序列比對分析，發(fā)現(xiàn)hsa-miR-155-5p的成熟序列“uuaaugcuaaucgugauaggggu”在各物種間高度保守(表1)。

2.2 miR-155-5p的靶基因預測結(jié)果閱讀miR-155靶基因相關(guān)文獻發(fā)現(xiàn)miR-155是最常見的參與腫瘤疾病的miRNA之一。miR-155-5p通過在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控其靶基因參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預后(表2)。miRanda、miRDB、TargetScan、Clip-Sep 4個在線數(shù)據(jù)庫預測miR-155-5p的靶基因個數(shù)分別是5 452、313、2 391、1 736，取交集后得到預測靶基因202個，占各預測軟件預測的靶基因總和的3.6%(圖1)。

2.3 miR-155-5p預測靶基因的GO功能注釋將4個數(shù)據(jù)庫均能預測到的靶基因202個作GO分析，發(fā)現(xiàn)miR-155-5p的靶基因主要富集在細胞核、細胞質(zhì)、細胞膜、細胞器等88個細胞組件 (P<0.05)；參與蛋白結(jié)合、雜環(huán)化合物結(jié)合、核酸結(jié)合、DNA結(jié)合、酶結(jié)合等153個分子功能 (P<0.05)；靶基因的生物學過程顯著富集于細胞進程、細胞大分子代謝過程、生物調(diào)節(jié)、有機物代謝過程等537個生物過程 (P<0.05，表3)。

表1 各物種miR-155-5p的成熟序列

*注：其中大鼠的成熟miR-155-5p序列是通過預測得到，尚無實驗證明

2.4靶基因KEGG信號通路富集分析將4個數(shù)據(jù)庫都能預測到的miR-155-5p的靶基因集合作KEGG Pathway分析，發(fā)現(xiàn)miR-155-5p的靶基因顯著富集在癌癥通路、HTLV-I感染、內(nèi)分泌抵抗、MAPK信號通路、FoxO信號通路、雌激素信號通路等(P<0.05，表4)。

3 討 論

MiRNA通過堿基互補配對與其靶基因特異性結(jié)合，進而形成一個巨大的調(diào)控網(wǎng)絡，廣泛參與人類生命活動和疾病的各個方面[1]。近年來已有大量研究證實miR-155-5p在人類生命活動各個方面扮演著重要的角色，miR-155-5p通過調(diào)控其靶基因的方式，在免疫反應、腫瘤發(fā)生、炎癥等生物學過程和信號轉(zhuǎn)導通路中發(fā)揮重要作用。

然而對miR-155-5p靶基因及其功能的認識還只是冰山一角，因此，預測其靶基因和認識它們的相互作用，是了解miR-155-5p在不同的生理過程中的功能的關(guān)鍵?？紤]到靶基因預測過程中miRNA與mRNA雙鏈特異結(jié)合的熱穩(wěn)定性、miRNA與靶基因結(jié)合位點的序列匹配、序列的保守性等因素，本研究選用4種miRNA靶基因預測軟件，用不同的計算方法預測靶基因，取交集作為進一步分析的miR-155-5p靶基因集合。這種預測方法具有高特異性和低假陽性率的優(yōu)點，用作分析的靶基因集合具有良好的代表性。

表2 miR-155-5p調(diào)控靶基因參與人類的腫瘤

*注：相對于正常細胞或鄰近癌組織細胞miR-155-5p在癌細胞中的表達情況

圖1 miR-155-5p的預測靶基因個數(shù)

表3 miR-155-5p靶基因的GO功能分析

表4 miR-155-5p靶基因KEGG信號通路富集分析結(jié)果

本研究采用生物信息學方法，共預測得到202個miR-155-5p的靶基因, 對獲得的靶基因集合進行GO注釋和KEGG分析，發(fā)現(xiàn)靶基因主要存在于細胞核、細胞質(zhì)、細胞膜、細胞器等各個組分中，參與蛋白結(jié)合、雜環(huán)化合物結(jié)合、核酸結(jié)合、DNA結(jié)合、酶結(jié)合等分子功能，顯著富集于細胞進程、細胞大分子代謝過程、生物調(diào)節(jié)、有機物代謝過程等生物過程以及癌癥通路、HTLV-I感染、內(nèi)分泌抵抗、MAPK信號通路、FoxO信號通路、雌激素信號通路等。

分析結(jié)果顯示，已知的成熟miR-155-5p序列在人、小鼠、鴨嘴獸等物種間具有高度保守性和同源性，表明miR-155-5p可能與多種生物的某些共同功能有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)miR-155-5p通過下調(diào)腫瘤抑制基因如CDC73[14]、TP53INP1[3, 15]和DMTF1[16]發(fā)揮促癌作用，也可通過靶向腫瘤原癌基因如claudin-1[17]和c-Myc[13]發(fā)揮抑癌作用[6](見表2)。這可能是因為miRNA與靶基因之間具有復雜的調(diào)控網(wǎng)絡(同一miRNA能夠調(diào)控多個靶基因，同一靶基因又能同時被多個miRNA調(diào)控[21])，或可能是因為miRNA在不同組織中參與的信號轉(zhuǎn)導通路不同[1]，從而導致了這種功能上的巨大差異。另外大量研究也發(fā)現(xiàn)miR-155在活化的B/T細胞、樹突細胞和巨噬細胞中高表達，是涉及腫瘤疾病最常見的miRNA之一[4]。大量研究表明不僅在活化的B細胞來源的淋巴瘤(霍奇金淋巴瘤和彌漫性大B細胞淋巴瘤)中miRNA-155-5p高度過表達[14]，而且在不同來源的實體腫瘤(食管癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、肝癌)中也呈現(xiàn)出過表達，因此miRNA-155-5p可作為多種腫瘤早期診斷、分期和預后判斷的重要生物標志物。此外，研究還發(fā)現(xiàn)miR-155在炎癥(類風濕關(guān)節(jié)炎)的發(fā)生發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用[22]，突出了炎癥與癌癥之間的潛在聯(lián)系，但目前miR-155-5p參與非腫瘤性疾病的潛在致癌機制和發(fā)病機制還沒有完全闡明。

本文采用生物信息學方法預測miRNA-155-5p靶基因，對全面認識miR-155-5p靶基因所參與的細胞組成、分子功能、生物學過程，以及進一步研究miR-155-5p生物功能機制可提供參考依據(jù)。但預測所得到的靶基因不可避免的存在假陽性，所以對靶基因功能和其所參與的生物學過程研究還需進一步的實驗驗證。

參考文獻：

[1] DONG H, LEI J, DING L, et al. MicroRNA: function, detection, and bioanalysis[J]. Chem Rev, 2013, 113(8): 6207-33.

[2] MO YY. MicroRNA regulatory networks and human disease[J]. Cell Mol Life Sci, 2012, 69(21): 3529-31.

[3] ZHANG CM, ZHAO J, DENG HY. MiR-155 promotes proliferation of human breast cancer MCF-7 cells through targeting tumor protein 53-induced nuclear protein1[J]. J Biomed Sci, 2013, 20: 79.

[4] ELTON TS, SELEMON H, ELTON SM, et al. Regulation of the MIR155 host gene in physiological and pathological processes[J]. Gene, 2013, 532(1): 1-12.

[5] FU X, WEN H, JING L, et al. MicroRNA-155-5p promotes hepatocellular carcinoma progression by suppressing PTEN through the PI3K/Akt pathway[J]. Cancer Sci, 2017, 108(4): 620-31.

[6] ZHU M, WANG M, YANG F, et al. MiR-155-5p inhibition promotes the transition of bone marrow mesenchymal stem cells to gastric cancer tissue derived MSC-like cells via NF-κB p65 activation[J]. Oncotarget, 2016, 7(13): 16567-80.

[7] AL-HAIDARI AA, SYK I, THORLACIUS H. MiR-155-5p positively regulates CCL17-induced colon cancer cell migration by targeting RhoA[J]. Oncotarget, 2017, 8(9): 14887-96.

[8] WANG Q, LI C, ZHU Z, et al. MiR-155-5p antagonizes the apoptotic effect of bufalin in triple-negative breast cancer cells[J]. Anticancer drugs, 2016, 27(1): 9-16.

[9] LING N, GU J, LEI Z, et al. MicroRNA-155 regulates cell proliferation and invasion by targeting FOXO3a in glioma[J]. Oncol Rep, 2013, 30(5): 2111-8.

[10] LEI K, DU W, LIN S, et al. 3B, a novel photosensitizer, inhibits glycolysis and inflammation via miR-155-5p and breaks the JAK/STAT3/SOCS1 feedback loop in human breast cancer cells[J]. Biomed Pharmacother, 2016, 82: 141-50.

[11] BABA O, HASEQAWA S, NAGAI H, et al. MicroRNA-155-5p is associated with oral squamous cell carcinoma metastasis and poor prognosis[J]. J Oral Pathol Med, 2016, 45(4): 248-55.

[12] BHATTACHARYAS, CHAIK AM, NG AJ, et al. Increased miR-155-5p and reduced miR-148a-3p contribute to the suppression of osteosarcoma cell death[J]. Oncogene, 2016, 35(40): 5282-94.

[13] SUN S, SUN P, WANG C, et al. Downregulation of microRNA-155 accelerates cell growth and invasion by targeting c-myc in human gastric carcinoma cells[J]. Oncol Rep, 2014, 32(3): 951-6.

[14] RATHER MI, NAGASHRI MN, SWAMY SS, et al. Oncogenic microRNA-155 down-regulates tumor suppressor CDC73 and promotes oral squamous cell carcinoma cell proliferation: implications for cancer therapeutics[J]. J Biol Chem, 2013, 288(1): 608-18.

[15] GIRONELLA M, SEUX M, XIE MJ, et al. Tumor protein 53-induced nuclear protein 1 expression is repressed by miR-155, and its restoration inhibits pancreatic tumor development[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007, 104(41): 16170-5.

[16] PENG Y, DONG W, LIN TX, et al. MicroRNA-155 promotes bladder cancer growth by repressing the tumor suppressor DMTF1[J]. Oncotarget, 2015, 6(18): 16043-58.

[17] QIN W, REN Q, LIU T, et al. MicroRNA-155 is a novel suppressor of ovarian cancer-initiating cells that targets CLDN1[J]. FEBS lett, 2013, 587(9): 1434-9.

[18] CAI ZK, CHEN Q, CHEN YB, et al. MicroRNA-155 promotes the proliferation of prostate cancer cells by targeting annexin 7[J]. Mol Med Rep, 2015, 11(1): 533-8.

[19] GU J, LU Z, JI C, et al. Melatonin inhibits proliferation and invasion via repression of miRNA-155 in glioma cells[J]. Biomed Pharmacother, 2017, 93:969-75.

[20] LIU F, SONG D, WU Y, et al. MiR-155 inhibits proliferation and invasion by directly targeting PDCD4 in non-small cell lung cancer[J]. Thorac Cancer, 2017, 8(6):613-9.

[21] 陳蓓蓓, 馬睿玲, 孫少伯,等. 當歸對自發(fā)性高血壓大鼠心肌miR-122的影響及其生物信息學分析[J]. 中國動脈硬化雜志, 2016, 24(4): 345-49.

[22] LI X, TIAN F, WANG F. Rheumatoid arthritis-associated microRNA-155 targets SOCS1 and upregulatesTNF-α and IL-1β in PBMCs[J]. Int J Mol Sci, 2013, 14 (12): 23910-21.