依托泊苷的高載藥量納米化制備及其體外血腦屏障穿透性

孟凡榮，王甲朋，范麗雪，劉梅梅，李萬華，劉大偉，隋 昕，駱 媛，楊 軍，王永安

（1.軍事科學院軍事醫(yī)學研究院毒物藥物研究所，北京 100850；2.濟南軍區(qū)疾病預防控制中心，山東濟南 250014；3.中國人民解放軍第32104部隊，內(nèi)蒙古阿拉善 735400；4.山東省昌邑市婦幼保健院，山東昌邑 261300）

近年來，納米技術得到了突飛猛進的發(fā)展，在光電子領域和生物領域由于其優(yōu)異的物理、化學性能和極大的潛在應用前景而引起了人們廣泛關注［1-6］。納米材料研究的范圍，由最初的量子點等0維材料，延伸至了一維材料（納米竿）和三維立體空間結(jié)構(gòu)，研究的領域也由最初的無機材料（硅線等）擴展到了有機小分子和高分子領域?，F(xiàn)階段已經(jīng)有大量成熟的納米材料制備手段［7］，能做到對納米材料形貌和尺寸的精密控制及大量制備。在生物領域，納米材料因其特殊的優(yōu)異的性能，在納米藥物載體，新型藥劑等方面，正得到大規(guī)模的研究和應用［1-2，8-11］。

鬼臼毒類化合物是作用于癌細胞DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅱ的非嵌入型抗腫瘤藥物，其衍生物依托泊苷（etoposide，VP-16）由于具有良好的廣譜抗腫瘤活性和低毒性而應用于臨床，對于小細胞肺癌有良好的療效［12-14］。此外，VP-16還對惡性淋巴瘤、惡性生殖細胞瘤、白血病、神經(jīng)母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、卵巢癌、非小細胞肺癌、胃癌和食管癌等有一定療效。VP-16為中性親酯類藥物，脂溶性高，在使用時存在著水溶性差的問題，限制了其應用［15］。在實際應用過程中，通常會加入增溶性輔助物質(zhì)改善其溶解性［16］。但增溶性添加物往往會引起低血壓和高過敏性的癥狀。為了改善其水溶性，傳統(tǒng)的做法是從藥物分子的角度入手，在分子水平上通過化學反應接入水溶性基團增加其溶解性［17-19］，這樣使合成步驟復雜，周期長，產(chǎn)量低，且藥物分子改構(gòu)后對其藥效產(chǎn)生不可預知的影響。

本研究旨在通過納米技術，將低水溶性藥物VP-16制備為140 nm尺寸的納米顆粒（nanoparti?cles，NP）懸濁液（VP-16 NP），鑒定其形貌和尺寸等物理表征、檢測其釋藥率和對腫瘤細胞的抑制率，考察其納米化后對藥效的影響。同時，構(gòu)建體外血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）模型，評價VP-16 NP的BBB穿透性，為以后該藥物治療如腦膠質(zhì)瘤等腦部腫瘤提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、細胞、試劑和儀器

新生2周的SD大鼠7～10只，雌雄不限，購自北京斯貝福實驗動物技術有限公司，許可證號SCXK（京）2016-0011。KB口腔上皮癌細胞購自中國科學院細胞庫。VP-16購于北京凱森萊公司；RPMI1640培養(yǎng)液購于美國Gibco公司；四甲基偶氮唑藍（MTT）購于美國Sigma公司；曲拉通（Trixon X100）購自國藥集團化學試劑有限公司；DMEM-HG、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液、Ⅱ型膠原酶購自美國Gibco公司；膠原酶/分散酶購自瑞士Roche公司；纖維粘連蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）、ECM專用培養(yǎng)液購自美國ScienceCell公司；D-Hank′s液購自上海捷瑞生物工程有限公司；大鼠內(nèi)皮細胞分離液購自天津市灝洋生物制品科技有限公司。熒光素鈉（flu?orescein disodium salt，F(xiàn)LU）購自美國 ACROS公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）購自美國Amresco公司；Transwell 6孔板（0.4 μm）、96孔板均購自美國Corning公司；三氯甲烷和四氫呋喃（THF）等試劑均為分析純，使用前未經(jīng)過純化處理，購自國藥集團化學試劑有限公司。

BI-9000AT動態(tài)散光儀，美國Brookhaven公司；BI-200SM光度計，美國Coherent公司；S4300掃描電子顯微鏡，日本日立公司；UV-Vis 2550紫外分光光度計，島津公司；Millicell?ERS-2，美國Milli?pore公司；CO2培養(yǎng)箱，日本Sanyo公司；細胞計數(shù)儀、550型酶標儀，美國Bio-Rad公司；H-7650透射電鏡，日本日立公司。

1.2 VP-16 NP的制備與表征觀察

配制含VP-165 mmol·L-1的三氯甲烷溶液，用微量注射器取300 μL注入5 mL濃度為2%曲拉通水溶液中，勻速攪拌形成乳白色乳濁液，敞口攪拌使三氯甲烷緩慢揮發(fā)至溶液變澄清為止。離心3次（850×g，10 min）除去表面活性劑曲拉通。然后將NP分散于去離子水中，超聲30 min后得分散良好的懸濁液；進一步將其滴于清潔硅片上，待水干后將硅片粘于樣品臺上，用掃描電子顯微鏡觀測其形態(tài)；最后，再將該懸濁液滴于銅網(wǎng)上，待水干后將銅網(wǎng)放置于樣品竿上，用透射電鏡觀測其內(nèi)部結(jié)構(gòu)；吸取部分懸濁液采用0.22 μm膜過濾后，用動態(tài)散光儀測粒徑。

1.3 VP-16粉末及VP-16 NP釋放曲線的測定［20］

VP-16標準曲線的建立：精密稱取6.4 mg VP-16，用H2O∶THF（1∶1）配制成0.128 g ·L-1的溶液50 mL，分別取0.2，0.5，0.8，1.1，1.4，1.7，2.0，3.0 mL置于10 mL容量瓶中，用H2O∶THF（1∶1）稀釋，得到一系列標準溶液，測285 nm吸光度值，做出其標準曲線。

VP-16 NP濃度的測定：將VP-16 NP超聲，振蕩均勻后，取1 mL溶液，加入1 mL THF，密封超聲1 h后，測285 nm處吸光度值，代入標準曲線，計算出濃度。以生理鹽水為釋放介質(zhì)，體積200 mL，將待測物裝入透析袋中后置于釋放介質(zhì)中。每隔一定時間取3 mL溶液，然后補充3 mL相應緩沖溶液，保證透析袋外溶液體積恒定。測定溶液在285 nm處的吸光度值，通過VP-16的標準曲線計算出累積藥物釋放率。VP-16粉末濃度的測定方法同VP-16 NP。

1.4 MTT比色法［21-23］檢測KB細胞存活

將細胞密度調(diào)整為每孔1×104細胞，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL。實驗組每組重復4孔，加入測試藥物分別為VP-16飽和水溶液、VP-16 DMSO溶液、VP-16 NP和VP-16粉末，初始濃度分別為0.5 g·L-1，加樣時稀釋成梯度濃度1～48 μg·L-1。以只加培養(yǎng)液的細胞孔作為對照組，另設完全只加培養(yǎng)液無細胞的組為調(diào)零組，在37oC，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，每孔加入MTT（1g·L-1）10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸出每孔培養(yǎng)液，加入150 μL DMSO，用酶聯(lián)免疫檢測570 nm處吸光度值（A570nm），計算細胞存活率和半數(shù)抑制濃度（IC50）。細胞存活率（%）=（實驗組A570nm-調(diào)零組A570nm）/對照組A570nm-調(diào)零組A570nm×100%。

1.5 VP-16 NP的BBB穿透性評價

1.5.1 腦微血管內(nèi)皮細胞的分離、提取和培養(yǎng)

取新生2周齡的SD大鼠10只，頸椎脫臼處死后75%乙醇消毒1～2 min后迅速斷頭，置冰塊上盛有冷D-Hank′s液的培養(yǎng)皿中，剪開頭皮與顱骨取出鼠腦，去除軟腦膜、腦干和海馬等，只留取腦皮質(zhì)用冷D-Hank′s液清洗3次后剪碎致1 mm3大小，再將其轉(zhuǎn)移到15 mL離心管，加入0.1%濃度Ⅱ型膠原酶（含DNaseⅠ）放置到37℃水浴鍋消化，1.5 h后離心（100×g，8 min，室溫），棄上清。加入20%BSA重懸后離心（1000×g，20 min，4℃），留取底部沉淀。再加入0.1%濃度的膠原酶/分散酶（含DNaseⅠ）消化1 h后離心（100×g，8 min，室溫），棄上清［24］。加入大鼠內(nèi)皮細胞分離液制成梯度界面，離心（1000×g，10 min，4℃）。吸取環(huán)狀乳白色層的細胞，將細胞清洗后加入內(nèi)皮細胞專用培養(yǎng)液重懸，接種到FN包被的25 cm2培養(yǎng)瓶中，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育，16 h后換全液，以后2～3 d換液。待細胞長滿瓶底約70%時，每天換1次培養(yǎng)液直至細胞長滿培養(yǎng)瓶。

1.5.2 體外BBB模型的建立及評價

將第1～2代原代腦微血管內(nèi)皮細胞以每孔1.0×106個的密度接種到Transwell 6孔板上室，待生長2～4 d后細胞融合［25］，通過4 h滲漏實驗、TEER實驗和FLU穿透性實驗評價BBB模型，確認符合后續(xù)實驗要求。

1.5.2.1 4 h滲漏實驗

在Transwell的上室和下室分別加入一定體積的細胞培養(yǎng)液，使之形成＞0.5 cm明顯的液面差，4 h后觀察是否還能維持＞0.5 cm明顯的液面差。

1.5.2.2 TEER實驗

使用Millicell?ERS-2對模型進行跨內(nèi)皮電阻值測量。按照其說明書進行操作，計算出有效電阻值（Ω·cm2）=（細胞孔電阻值-空白孔電阻值）×膜面積（cm2）［26］。

1.5.2.3 FLU穿透性實驗

使用酶標儀測定濃度分別為0，0.1，1，10和100 mg ·L-1的FLU的熒光強度，每個樣品設4個復孔，然后繪制標準曲線。上室加入FLU，按15，30和60 min采集下室液體。根據(jù)文獻記載的方法，測定并計算FLU穿透腦微血管內(nèi)皮細胞的單層量。根據(jù)公式V清（mL）=（CA×VA）/C初，CA為下室液體濃度；VA為下室液體體積；C初為上室液體初使?jié)舛取Ｒ郧宄w積對時間作圖，斜率表示清除率（mL·min-1），清除率=P×S，P為穿透性，S為穿透膜的面積。按本實驗分組的設定，Pt為空白無細胞的穿透系數(shù)，Pf為體外BBB模型組的穿透系數(shù)，Pe為最終待測藥物的穿透系數(shù)，S為細胞培養(yǎng)室的膜面積，本實驗的S為4.67cm2。根據(jù)公式1/PeS=1/PtS-1/PfS推導出PeS=PfS×PtS/PfS-PtS，最終計算出穿透系數(shù)Pe［27］。

1.5.3 VP-16 NP的BBB穿透性測試

將VP-16 NP充分分散后加入Transwell上室1 mL（濃度10 mg ·L-1），下室加入2 mL D-Hank′s液，按30 min時間點采集，從下室采集200 μL，同時補給200 μL D-Hank′s液。按上述FLU穿透系數(shù)的計算方法，計算出VP-16 NP跨體外BBB的穿透系數(shù)。此外，將樣品用PBS離心清洗后，滴于清潔硅片上，小心放入銅網(wǎng)，待水干后用于透射電鏡觀察。

1.6 統(tǒng)計學分析

實驗結(jié)果數(shù)據(jù)以±s表示，采用GraphPad Prism5軟件對數(shù)據(jù)進行分析，組間比較采用t檢驗。濃度效應曲線采用Sigmoidal dose-response（variable slope）方程Y=Bottom+（Top-Bottom）/｛1+10〔^（LogIC50-X）×HillSlope〕｝擬合。

2 結(jié)果

2.1 制備的VP-16 NP表征

用高濃度表面活性劑可得到粒徑分布均勻的VP-16 NP。隨三氯甲烷的全部揮發(fā)，體系由乳白色乳濁液變澄清，即可獲得大量VP-16 NP。得到的VP-16 NP能在水溶液中良好分散，形成較為穩(wěn)定的懸濁液。掃描電子顯微鏡顯示，VP-16 NP近球形（圖1）；透射電鏡可見其內(nèi)部結(jié)構(gòu)為實心結(jié)構(gòu)（圖2）；經(jīng)動態(tài)光散射向儀測其粒子直徑為140 nm（圖3）。

Fig.1 Image of etoposide nanoparticles（VP-16 NP）by scanning electron microscope.

Fig.2 Image of VP-16 NP by transmission electron mi?croscope.

Fig.3 Image of VP-16 NP by dynamic light scattering.

2.2 VP-16粉末和NP懸濁液釋放率

在H2O∶THF溶劑中，VP-16的標準曲線為A=6.51353c-2.83685×10-4，A為285 nm處吸收峰值，c為濃度（g ·L-1），r=0.999。利用該標準曲線測試藥物的累計釋放率（圖4），VP-16 NP的累計釋放率為VP-16粉末狀藥物的3倍。因為VP-16 NP直徑為140 nm，尺寸的減小使得顆粒的比表面積增大，處于表面的分子數(shù)增多。

Fig.4 Cumulative release rate of VP-16 powder and VP-16 NP.The VP-16 standard curve determined the absor?bance of VP-16 NP and VP-16 powder at 285 nm in UV，and the concentration was brought into the standard curve to calcu?late the cumulative release rate of the drug.This was the result of one experiment.

2.3 VP-16 NP對KB細胞存活的影響

MTT結(jié)果顯示（圖5），VP-16粉末對KB細胞存活無明顯抑制作用，而VP-16 NP對KB細胞存活的抑制率遠遠高于同濃度的VP-16粉末和溶解分散狀態(tài)的VP-16溶液（P＜0.01）。并且隨著時間的延長，VP-16 NP對KB細胞存活的抑制率增強，其半數(shù)抑制濃度（IC50）明顯降低。在不加入增（助）溶劑的情況下，VP-16 NP能有效抑制KB細胞存活。

2.4 VP-16 NP的體外BBB模型穿透性

Fig.5 Effects of VP-16 solution，VP-16 NP and VP-16 powder on survival of KB cells in 24 h（A），48 h（B）and 72 h（C）.VP-16 solution，VP-16 NP，and VP-16 powder concentration（1-48 μg·L-1）were added to the cells.±s，n=4.＊＊P＜0.01，compared with VP-16 powder group;##P＜0.01，com?pared with VP-16 solution group.

腦微血管內(nèi)皮細胞以每孔1×106個密度接種到Transwell上室，在培養(yǎng)至2～4 d時，4 h滲漏實驗觀察Transwell上室與下室能夠維持＞0.5 cm的液面差；TEER有效電阻值可達到223 Ω·cm2；FLU穿透性實驗可得知，在15，30和60 min時，穿透系數(shù)分別為（0.33±0.04）×10-3，（0.42±0.07）×10-3和（0.52±0.06）×10-3cm·min-1，與文獻報道的范圍接近［27］。VP-16 NP在30 min時穿透系數(shù)為（1.87±0.03）×10-3cm·min-1，較相同時間點的FLU顯示出較高的穿透性（P＜0.01）。TEM可清晰地觀察到VP-16 NP，說明VP-16 NP能夠穿透體外BBB模型（圖6）。

Fig.6 Images of VP-16 NP penetrating blood-brain barrier model in vitro by transmission electron microscope.Arrows show the penetration of VP-16 NP to BBB.

本研究通過乳液溶劑交換法［28-29］，制備得到了大量140 nm粒徑，粒徑分布均勻、呈典型球形的VP-16 NP，其制備工藝簡便易行。經(jīng)以上實驗數(shù)據(jù)研究顯示，①VP-16 NP的藥物釋放率高于其粉末形態(tài)。相對于VP-16粉末，VP-16 NP由于其處于納米尺度，體積小，比表面積大，能與溶液有更多的接觸，固體的溶解量與溶解速度都比常規(guī)尺寸下的粉末高，所以其藥物釋放效率更高。并且在相同的體積下，VP-16 NP能與水有更大的有效接觸面積，使得顆粒的溶解速率和溶解量都大大增加，很快達到藥物的飽和濃度。而且藥物在體內(nèi)是一個不斷消耗的過程，VP-16 NP相比普通的粉末，能迅速溶解釋放出藥物分子，并持續(xù)維持藥物的飽和濃度。②VP-16 NP對癌細胞的抑制效果優(yōu)于其粉末形態(tài)和在DMSO中的溶解分散狀態(tài)。抗癌藥物一般是以分子的形式進入細胞，然后殺滅細胞或阻斷細胞有絲分裂。當藥物分子被消耗，溶液變成未飽合狀態(tài)，VP-16 NP較高的溶解速率能保證體系迅速恢復至飽和濃度，維持藥物的高濃度狀態(tài)，提供充足的藥物分子殺傷癌細胞。大量的文獻也已證明，由于納米材料具有合適的尺寸，能作為優(yōu)秀的藥物載體［30］。VP-16 NP尺寸為140 nm，小于細胞膜孔道（200 nm），又由于其親脂性高，粒徑小，能直接通過細胞膜上的孔道進入細胞，在細胞內(nèi)釋放出藥物分子殺死癌細胞，從而使其細胞殺傷率高于溶解狀態(tài)的藥物分子。

此外，通過原代培養(yǎng)腦微血管內(nèi)皮細胞，經(jīng)Transwell構(gòu)建體外BBB模型，采用經(jīng)典的4 h的滲漏實驗、TEER實驗及FLU穿透性實驗對模型進行驗證。在建模成功的基礎上，評價VP-16 NP穿透體

3 結(jié)論

外BBB模型的穿透性。經(jīng)計算，30min時，VP-16 NP的穿透系數(shù)為（1.87±0.03）×10-3cm·min-1，相對于穿透系數(shù)為（0.42±0.07）×10-3cm·min-1的FLU，顯示出很好的穿透性。由此可見，經(jīng)過納米技術的處理，大大地拓展了傳統(tǒng)化療藥物的應用范圍和療效，尤其針對因水溶性極差而限制其應用的抗癌藥物具有良好的應用前景。

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