牦牛SCD基因的克隆和生物信息學分析

付東海，吳曉云，王宏博，褚 敏，郭 憲，裴 杰，包鵬甲，丁學智，閻 萍，梁春年

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所，蘭州 730050；2.甘肅省牦牛繁育重點實驗室，蘭州 730050）

硬脂酰輔酶A去飽和酶（Stearoyl-CoA desaturase，SCD）是調(diào)控乳中不飽和脂肪酸合成的限速酶，也是反芻動物肉奶中共軛亞油酸內(nèi)源合成的關鍵酶［1-2］。在參與脂肪代謝的基因中，SCD能夠催化C14到C19的脂肪酸乙酰-CoA底物上Δ9位加一個雙鍵，在反芻動物的乳腺和肝臟脂類代謝過程中發(fā)揮重要作用［3-5］。SCD負責SFA向單不飽和脂肪酸 （Monounsaturated fatty acids，MUFA）的轉(zhuǎn)變［3，6］。哺乳動物 SCD cDNA 首次在老鼠肝臟中發(fā)現(xiàn)［7］。隨后，SCD 基因在大鼠［8］、豬［9］、綿羊［10］、山羊［11］、牛［12］、人［13］等主要哺乳動物體內(nèi)相繼被分離。牛SCD基因位于26號染色體（26q21），整個基因長17 088 bp，轉(zhuǎn)錄所得的cDNA全長5 287 bp，CDS序列共1 080 bp，編碼 359個氨基酸［14］。研究發(fā)現(xiàn)，SCD可能影響牛奶中SFAs/MUFAs比率、肌間脂肪沉積和成分，是改善牛奶和牛肉質(zhì)量的主要候選基因［15］。無角牦牛新品種是中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所“牦牛資源與育種”創(chuàng)新團隊與青海大通種牛場經(jīng)過20余年密切合作培育的牦牛新品種，因產(chǎn)于海拔4 380 m的阿什旦雪山腳下而得名。由于SCD在不飽和脂肪酸合成過程中起關鍵作用，因此，深入了解牦牛SCD基因的結(jié)構(gòu)和功能，對無角牦牛新品種的培育和乳肉品質(zhì)的改良都有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

選取屠宰后健康母牦牛，迅速取乳腺組織，液氮保存，帶回實驗室，-70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

RNA提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒購自大連寶生物有限公司；TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒、200 bp ladder DNA marker、pMD19-T克隆載體試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；Trans-5α感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；2×Power Taq PCR MasterMix購自大連寶生物有限公司。

1.3 方法

1.3.1 無角牦牛乳腺組織總RNA提取及RT-PCR反應用RNA試劑盒對牦牛乳腺組織總RNA進行提取，去除基因組中殘留的DNA，用紫外分光光度計與1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取物質(zhì)量。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作步驟反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-70℃保存?zhèn)溆谩?.3.2 引物設計 根據(jù)GenBank中普通牛SCD基因mRNA序列（登錄號：NM_173959.4），利用NCBI網(wǎng)站的pick Primer在線程序設計特異性引物，預計擴增大小為1 000 bp。擴增引物由蘭州勵合生物有限公司合成。引物序列為上游 F：5′-TCTACACTCAGTTTGGACTGCC-3′；下游 R：3′-GCTTTTGGAAAAGGAACCCAAG-5′。

1.3.3 PCR擴增反應 總反應體系20 μL：上下游引物各 1 μL，RNase-Free ddH2O 7 μL，2×Power Taq PCR ，MasterMix 10 μL，cDNA 模板 1 μL。PCR 反應條件：99℃預變性 5 min；99℃變性 30 s，57℃退火 30 s，65℃ 延伸1 min，30個循環(huán)；65℃終延伸 10 min，4℃保存。PCR 產(chǎn)物用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.4 目的片段TA克隆與鑒定 使用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的片段，與pMD19-T克隆載體在 4℃條件下連接30 mins；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至50 μL Trans-5α感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化后加900 μL LB培養(yǎng)液搖勻復蘇10 mins，將復蘇后的菌液涂布于含0.1 mg/mL Amp的LB平板培養(yǎng)皿表面，37℃避光培養(yǎng)10 h；挑取白色陽性單克隆菌落，用LB（Amp+）培養(yǎng)液37℃擴大培養(yǎng)，之后進行菌液 PCR鑒定。PCR 反應體系為 20 μL：菌液 1 μL，上下游引物各 1 μL，2×Power Taq PCR MasterMix 10 μL，水 7 μL。PCR 反應條件：99℃預變性 5 min；99℃變性 30 s，57℃退火 30 s，65℃延伸 1 min，30個循環(huán)；65℃延伸 10 min，4℃保存，產(chǎn)物用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，篩選陽性菌液送北京擎合生物有限公司測序。

1.3.5 生物信息學分析 試驗所用的分析網(wǎng)站和軟件如下。

基因開放閱讀框（ORF）：DNASTAR 和 Lasergene；理化性質(zhì)分析：http：//web.expasy.org/protparam；二級結(jié)構(gòu)預測：http：//www.predictprotein.org；亞細胞定位：https：//wolfpsort.hgc.jp/； 同 源 性 比 較 ：https：//www.ebi.ac.uk/Tools/emboss；系統(tǒng)發(fā)生樹：MEGA5.1軟件中的Phylogeny程序；信號肽預測：http：//cbs.dtu.dk/service/SignalIP；功能結(jié)構(gòu)域預測：http：//cbs.dtu.dk/service/TMHMM Signal IP。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛SCD基因總RNA檢測

提取無角牦牛新品種乳房組織總RNA，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測到帶型完整的3條帶，分別為28 S、18 S和5 S rRNA；測定的A260/A280比值在1.8～2.0之間，說明RNA完整性較好，無蛋白質(zhì)和DNA污染，適合下一步RT-PCR反應。

2.2 牦牛SCD基因目的片段擴增與TA克隆

RT-PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并做兩個平行。如圖1所示。出現(xiàn)單一DNA條帶，片段長度介于1 000～1 300 bp，與預擴增片段長短一致，可用于克隆測序。將克隆后的陽性菌液送公司測序，獲得無角牦牛SCD基因CDS區(qū)序列。

2.3 牦牛SCD基因CDS區(qū)核苷酸序列及氨基酸序列分析

應用Lasargene的edit squence程序分析無角牦牛SCD基因序列，獲得長1 271 bp的ORF，起始密碼子ATG位于122 bp處，終止密碼子TAG位于1 202 bp處，由此得出，無角牦牛SCD基因CDS區(qū)全長1 080 bp。軟件分析其堿基組成分別為A=24.7%、G=23.6%、T=24.2%、C=27.5%，共編碼359個氨基酸殘基（圖2）。G+C（51.1%），高于A+T（48.9%），說明SCD基因編碼區(qū)的DNA雙鏈比較穩(wěn)定，變異較少。

圖1 牦牛SCD基因RT-PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

圖2 牦牛SCD基因CDS區(qū)核苷酸及編碼氨基酸序列

2.4 牦牛與普通牛SCD基因序列及氨基酸序列比對

使 用 Pairwise Sequence Alignment（https：//www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/）在線網(wǎng)站分析程序，對無角牦牛新品種測定序列的CDS區(qū)與普通牛的SCD核酸序列（登錄號：NM_173959）進行比對，結(jié)果表明，兩者相似性99.35%。相比普通牛，無角牦牛新品種SCD基因的擴增片段共檢測出7個堿基差異，分別為：ATC→CTC、CGG→AGG、CCA →CCG、CTG →TTG、TCC→TCA、GCG →GTG、TAC→AAC。對氨基酸序列進行比對發(fā)現(xiàn)：第1、第6、第7處的差異使得對應的氨基酸發(fā)生變化，而其他4處的核苷酸差異未引起編碼的氨基酸改變。用SPBDV軟件對普通牛的SCD蛋白結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)：與無角牦牛存在的3個氨基酸差異均未發(fā)生在SCD蛋白的核心區(qū)域，而是出現(xiàn)在SCD蛋白質(zhì)的中層至外層結(jié)構(gòu)之間。這表明兩者的SCD生物學功能可能相同，不存在差異。

2.5 牦牛SCD的理化性質(zhì)分析

蛋白質(zhì)理化性質(zhì)包括相對氨基酸組成、分子質(zhì)量、等電點及消光系數(shù)等數(shù)據(jù)［10］。用ProtParam與Protean軟件預測牦牛SCD的理化性質(zhì)。結(jié)果顯示：無角牦牛新品種SCD由359個氨基酸殘基組成，分子式為C1922H2912N506O514S11，分子量 41.7 kD，理論等電點（pI）9.37，說明該蛋白為堿性蛋白質(zhì)。其中氨基酸殘基中Leu=11.6%、Thr=7.0%的頻率較高，極性氨基酸占56.5%，疏水性氨基酸占43.5%，帶電荷氨基酸占20.9%，其包括11.7%的堿性氨基酸及9.2%的酸性氨基酸。其水溶液在280 nm處的消光系數(shù)83 895，不穩(wěn)定系數(shù)44.41，屬不穩(wěn)定類蛋白質(zhì)。而且預計在哺乳動物網(wǎng)織紅細胞內(nèi)的半衰期為30 h。疏水指數(shù)86.96，平均親水性-0.235，屬不可溶性蛋白。

2.6 牦牛SCD二級結(jié)構(gòu)預測

蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)主要指多肽鏈主鏈骨架中局部的構(gòu)象，對其進行預測分析有助于認識蛋白的空間結(jié)構(gòu)［11］。使用Predict Protein軟件預測牦牛SCD的二級結(jié)構(gòu)，見圖3。結(jié)果表明：螺旋所占例最大，為40.8%，其次為無規(guī)則卷曲比例，為35.3%，延伸鏈和折疊所占比例較低，分別為14%和10.2%。

圖3 SCD蛋白二級結(jié)構(gòu)預測

2.7 牦牛SCD亞細胞定位預測分析

利用WoLF PSORT在線程序?qū)CD的亞細胞定位進行預測分析。結(jié)果顯示，SCD在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、液泡、細胞膜、分線粒體中均有分布，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中分布的可能性最大。

2.8 牦牛SCD信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域預測

利用SignalP和TMHMM sever v2.0對其信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域分析，見圖4和圖5。信號肽預測結(jié)果表明：該蛋白的C值最大，為0.130，最大Y值（0.018）以及最大S值（0.163）均小于閾值0.5，說明無角牦牛新品種SCD無信號肽?？缒そY(jié)構(gòu)域預測結(jié)果表明：該蛋白的期望跨膜螺旋數(shù)值為4，均為跨膜蛋白。使用SMART對無角牦牛SCD功能結(jié)構(gòu)域預測，見圖6，結(jié)果表明，無角牦牛SCD蛋白包含一個低復雜區(qū)域和4個跨膜結(jié)構(gòu)。

圖4 信號肽預測

圖5 跨膜結(jié)構(gòu)域預測

2.9 牦牛SCD同源性及系統(tǒng)發(fā)育分析

利用Mega軟件5.1版本中Align和Pylogeny程序?qū)o角牦牛新品種、黑猩猩、普通牛、大鼠、小鼠、原雞、野豬、野馬、人等物種的SCD氨基酸序列進行同源性比較并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（表2、圖7）。結(jié)果表明：無角牦牛新品種SCD氨基酸序列與普通牛親緣關系最近，同源性達99.4%；其他依次為人、黑猩猩、野馬、野豬、大鼠、小鼠，同源性達89.4%～94.2%，與原雞親緣關系較遠。并且SCD發(fā)育樹與生物進化的物種樹基本一致，符合物種進化規(guī)律，說明SCD基因編碼區(qū)在哺乳動物種間比較保守。

表2 牦牛與8個物種SCD氨基酸序列同源性比較%

圖7 牦牛與其他8個物種的SCD進化發(fā)生樹

圖6 SCD結(jié)構(gòu)域預測

3 討論

本次試驗對無角牦牛新品種SCD基因進行克隆和編碼蛋白分析，發(fā)現(xiàn)其編碼長度為359個氨基酸殘基，且與普通牛、人等物種的SCD蛋白質(zhì)的氨基酸數(shù)量相差很少，與個別物種如原雞和小鼠差異較大。這些差異與物種間的親緣關系差異以及物種演化關系差異是保持高度一致的。無角牦牛的SCD核苷酸序列與普通牛的相比，兩者存在7個堿基差異，導致編碼的氨基酸發(fā)生3處改變。這3個氨基酸差異位點未出現(xiàn)在核心編碼位點，而是發(fā)生在蛋白結(jié)構(gòu)的中層至外層。表明無角牦牛與普通牛的SCD之間可能并不存在生物學功能上的差異。

蛋白質(zhì)半衰期與其穩(wěn)定性之間存在密切聯(lián)系，一般來說，半衰期長則蛋白質(zhì)穩(wěn)定性高。本試驗分析結(jié)果顯示，SCD具有較長的半衰期，但卻屬于不穩(wěn)定蛋白，這需要進一步的驗證。蛋白同源性在一定程度上反映物種間親緣關系的遠近。牦牛、普通牛、黑猩猩、大鼠、小鼠、野豬、野馬、人7個物種的氨基酸親緣關系較近，同源性均在89%～100%，而與原雞相差較遠，差異達20.8%。而且牦牛SCD氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)生樹與生物進化的物種樹以及動物分類學觀點也近乎保持一致。說明SCD基因編碼區(qū)在長期生物進化過程中具有較強的保守性。

本研究采用RT-PCR技術(shù)與TA克隆技術(shù)，從無角牦牛新品種乳腺組織獲得了SCD基因的cDNA序列，全長1 080 bp，編碼359個氨基酸殘基，這與羅毅浩等［16］對玉樹牦牛的研究結(jié)果相吻合。對無角牦牛新品種SCD基因的生物信息學分析結(jié)果表明，牦牛SCD基因編碼的為可溶堿性蛋白質(zhì)，且大部分定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在能量代謝和飽和脂肪酸脫氫途徑中起重要作用。SCD氨基酸序列與普通牛、黑猩猩、人等物種間同源性較高，與其親緣關系的遠近一致，說明SCD基因編碼區(qū)在長期生物進化過程中具有較強的保守性［17］。該基因的成功克隆及相關信息分析為揭示牦牛脂蛋白代謝和細胞信號的轉(zhuǎn)導提供了一定的理論依據(jù)。

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