廣藿香原生質(zhì)體制備、培養(yǎng)與融合技術(shù)優(yōu)化研究

嚴(yán)寒靜 李磊 張宏意 何夢(mèng)玲

摘 要：為建立高效穩(wěn)定的廣藿香原生質(zhì)體培養(yǎng)與融合技術(shù)體系，該研究以廣藿香愈傷組織懸浮細(xì)胞為材料，研究了原生質(zhì)體制備的酶解條件和培養(yǎng)方法、細(xì)胞密度、激素種類和濃度等因素對(duì)原生質(zhì)體培養(yǎng)的影響，并通過測(cè)定融合產(chǎn)物直徑確立融合細(xì)胞篩選范圍，進(jìn)一步研究聚乙二醇濃度、細(xì)胞密度、融合時(shí)間及融合液加入量等因素對(duì)原生質(zhì)體融合的影響。結(jié)果表明：制備原生質(zhì)體的適宜條件為pH5.8，酶解溫度25 ℃;原生質(zhì)體培養(yǎng)以銨鹽減半的MS1培養(yǎng)基進(jìn)行海藻酸鈉包埋、激素選用0.2 mg·L-1 NAA、2.0 mg·L-1 6-BA，培養(yǎng)密度2.0×105個(gè)·mL-1、蔗糖添加量1.0%、酸水解酪蛋白500 mg·L-1的條件下原生質(zhì)體分裂頻率、植板率均較高，且開始分裂時(shí)間和細(xì)胞團(tuán)形成時(shí)間都較短;雙細(xì)胞融合產(chǎn)物篩選范圍為69.33～87.35 μm;以40% PEG 6000化學(xué)促融30 min、加入0.5倍體積的融合液、細(xì)胞密度2.0×105個(gè)·mL-1的條件進(jìn)行原生質(zhì)體融合，聚合率可達(dá)57.19%;獲得的融合產(chǎn)物經(jīng)海藻酸鈉包埋培育2個(gè)月后可觀察到再生愈傷組織。

關(guān)鍵詞：廣藿香，聚乙二醇，原生質(zhì)體制備，原生質(zhì)體融合，新品種選育

中圖分類號(hào)：Q945

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3142（2018）10-1310-09

Abstract：For establishing a high efficient and stable protoplast culture and fusion technology system，the protoplasts obtained from Pogostemon cablins callus，were studied as the material for enzymatic hydrolysis conditions of protoplast preparation，and on this base，the effects of culture methods，cell density，hormone types and concentrations on the protoplast culture were studied. Screening range of fusion cells was determined by measuring the diameter of fusion products. The effects of PEG concentration，cell density，incubation time and amount of fusion fluid on the fusion rate of protoplasts were studied by single factor analysis. The results showed that? the vitality of protoplast reached the highest value at 25 ℃ and the optimal pH for enzymatically hydrolyzing was 5.8. The improved medium MS1，which consisted half of ammonium salt（NH4NO3 825 mg·L-1），added the hormones about 0.2 mg·L-1 NAA and 2.0 mg·L-1 6-BA was used to embed in sodium alginate. With the conditions of 2.0×105 protoplasts·mL-1 of the cell density，1% sucrose content and 500 mg·L-1 acid hydrolyzed casein，protoplasts got into division and formation of cell clusters earlier and had the higher division frequency and plating efficiency. The range of double cell fusion products was 69.33-87.35 μm; 40% PEG 6000 was selected to promote the chemical fusion. With the increase of fusion time，cell density and amount of fusion liquid，both polymerization rate and polycondensation rate increased. With 0.5 times volume of the fusion solution，2.0 × 105 protoplasts·mL-1 of the cell density and 30 min of fusion time，the polymerization rate was up to 57.19%. After two months embedding cultivation，the callus was observed.

Key words：Pogostemon cablin，PEG，protoplast preparation，protoplast fusion，breeding

廣藿香（Pogostemon cablin）為唇形科刺蕊草屬植物，是廣東的道地藥材，具芳香化濁、和中止嘔、發(fā)表解暑之功效（國家藥典委員會(huì)，2015）?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，廣藿香可以調(diào)節(jié)胃腸道功能并具有抗菌作用（羅集鵬等，2005;莫小路等，2004），是多種中成藥的主要原料。此外，廣藿香油中的百秋里醇?xì)馕丢?dú)特宜人，并可使香味持久，是法國標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)確定的香精香料中的標(biāo)志性成分，被廣泛應(yīng)用于日用品和化妝品中（吳友根等，2010）。廣藿香自引種到我國南亞熱帶地區(qū)種植后，很少或者根本沒有經(jīng)過遺傳改良，種質(zhì)退化嚴(yán)重，個(gè)體間藥用活性成分和產(chǎn)量差異極顯著，導(dǎo)致了藥材質(zhì)量不穩(wěn)定和不可控。解決問題的根本措施之一是開展品種改良或新品種的選育，但是，由于廣藿香在我國為無性繁殖，傳統(tǒng)育種舉步維艱，需要引入新技術(shù)和新方法，進(jìn)行種質(zhì)資源的創(chuàng)新工作。

原生質(zhì)體具有再生成完整植株的能力，是進(jìn)行細(xì)胞器分離、轉(zhuǎn)基因和基因功能分析等研究的理想材料，也是以細(xì)胞雜交方式培育新品種的必備材料（Eeckhaut et al，2013）。在中藥材品種篩選和種質(zhì)改良方面，原生質(zhì)體融合是誘導(dǎo)細(xì)胞雜交和增加染色體組倍性行之有效的途徑之一。目前植物原生質(zhì)體制備和融合大多以酶解法制備原生質(zhì)體、PEG誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合（Mackwska et al，2014; Mori et al，2014; 彭小群等，2015），而酶液組成、酶解時(shí)間和滲透劑組成是影響酶解法制備原生質(zhì)體的主要因素（Hongoh et al，2003），PEG濃度和融合時(shí)間是影響PEG誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合的主要因素（Durieu & Ochatt，2000）。探明這些因素對(duì)原生質(zhì)體制備和融合過程的影響，是系統(tǒng)建立起原生質(zhì)體制備和融合技術(shù)體系的重要保證。本研究以性狀優(yōu)良的石牌廣藿香為材料，在前期對(duì)廣藿香懸浮細(xì)胞原生質(zhì)體的分離與純化研究的基礎(chǔ)上（梁威等，2016），考察不同的培養(yǎng)方法、培養(yǎng)基組成等對(duì)廣藿香原生質(zhì)體培養(yǎng)的影響，并著重研究PEG濃度、孵育時(shí)間等對(duì)原生質(zhì)體融合的影響，以期篩選出PEG誘導(dǎo)廣藿香原生質(zhì)體融合的最適條件，為系統(tǒng)建立廣藿香的原生質(zhì)體融合技術(shù)體系奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

所用材料采自廣東藥科大學(xué)藥用植物園，由姬生國教授鑒定為唇形科刺蕊草屬植物廣藿香（Pogostemon cablin）。試劑：熒光素雙醋酸酯（fluorescein diacetate，F(xiàn)DA）為Solarbio公司產(chǎn)品，纖維素酶（cellulase）、半纖維素酶（hemicellulase）、果膠酶（pectinase）為Sigma公司產(chǎn)品，其它生化試劑為國產(chǎn)的分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制 混合酶液的配制參考梁威等（2016）的方法，原生質(zhì)體清洗液（CPW-4M）按朱至清（2003）的方法配制。以MS為基本培養(yǎng)基，此外添加0.4 mol·L-1甘露醇、0.1% 嗎啉乙磺酸（MES）、0.1%肌醇、不同濃度的蔗糖或葡萄糖、生長調(diào)節(jié)劑、酸水解酪蛋白等。低熔點(diǎn)瓊脂糖培養(yǎng)基：1.2%瓊脂糖、0.1% MES、pH 5.8。海藻酸鈉溶液：1.5%海藻酸鈉，以無鈣原生質(zhì)體培養(yǎng)液（不含CaCl2）為溶劑，90 ℃高壓滅菌20 min。PEG融合液：10 mmol·L-1 CaCl2·2H2O、0.7 mmol·L-1 KH2PO4、0.1 moL·L-1甘露醇、30%～50% PEG 6000，pH 5.8，溶液過0.45 μm微孔濾膜后4 ℃保存，使用前過0.22 μm微孔濾膜脫菌。高pH高鈣洗液參考Kao & Michayluk（1974）的方法配制。FDA母液：取5 mg FDA溶于1 mL丙酮中，0 ℃以下保存。以上試劑除特別提到，均在121 ℃下高壓滅菌后備用。

1.2.2 愈傷組織誘導(dǎo)與懸浮培養(yǎng) 以石牌廣藿香為外植體，接種于MS+0.05 2，4-D+0.5 KT（單位為mg·L-1，下同）固體培養(yǎng)基，光照12 h·d-1、光強(qiáng)1 500 lx、（25±2） ℃條件下培養(yǎng)，誘導(dǎo)廣藿香愈傷組織。選取疏松淡黃色愈傷組織，轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速135 r·min-1，接種量70 g FW·L-1，繼代周期24 d。

1.2.3 原生質(zhì)體制備

1.2.3.1 酶液pH和酶解溫度的篩選 懸浮細(xì)胞依次過40、100目篩網(wǎng)，收集后按1∶10（m/v）加入不同pH值的混合酶液以考察酸堿度對(duì)分離的影響;設(shè)置23、25、28、30 ℃ 4個(gè)溫度梯度，50 r·min-1避光振蕩酶解12 h，考察溫度對(duì)酶解制備原生質(zhì)體的影響。通過統(tǒng)計(jì)分析，確定廣藿香原生質(zhì)體制備的酶液pH和酶解溫度。

1.2.3.2 原生質(zhì)體純化收集 酶解液依次過40、100、200目篩網(wǎng)，收集濾液1 000 r·min-1離心3 min去上清，沉淀加適量CPW-4M液混勻后再次離心并去上清，重復(fù)3次后，沉淀轉(zhuǎn)移至原生質(zhì)體培養(yǎng)液中保存。

1.2.4 產(chǎn)量與活力的測(cè)定 將1.2.3.2中得到的原生質(zhì)體溶液滴加在血球計(jì)數(shù)板上，計(jì)算原生質(zhì)體數(shù)，其密度與產(chǎn)量計(jì)算公式如下。實(shí)驗(yàn)重復(fù)不少于3次，鏡檢時(shí)不同視野測(cè)量次數(shù)≥5，每個(gè)樣品測(cè)量值取5次測(cè)量的均值（下同）。

原生質(zhì)體密度（個(gè)·mL-1）=5個(gè)大格內(nèi)原生質(zhì)體總數(shù)×5×10 000×稀釋倍數(shù);原生質(zhì)體產(chǎn)量（個(gè)·g-1）的計(jì)算公式如下：

原生質(zhì)體產(chǎn)量=原生質(zhì)體密度×稀釋后體積細(xì)胞生物量（g）。

原生質(zhì)體活力參考Widholm（1972）的方法，在熒光顯微鏡下測(cè)定，公式如下：

原生質(zhì)體活力=暗視野下發(fā)熒光原生質(zhì)體數(shù)明視野下原生質(zhì)體數(shù)×100%。

1.2.5 原生質(zhì)體培養(yǎng) 考察液體淺層培養(yǎng)、瓊脂糖包埋培養(yǎng)、固液雙層培養(yǎng)、海藻酸鈉包埋培養(yǎng)4種方法對(duì)原生質(zhì)體培養(yǎng)的影響，培養(yǎng)密度為2×105個(gè)·mL-1，培養(yǎng)基為MS1+0.2 NAA+2.0 6-BA+1.0%蔗糖+500 mg·L-1酸水解酪蛋白。

確定培養(yǎng)方法后，再考察培養(yǎng)密度（分別為1.0×105、2.0×105、4.0×105、6.0×105個(gè)·mL-1）和培養(yǎng)基組分（包括激素、銨鹽、碳源、酸水解酪蛋白）（表3和表4）對(duì)原生質(zhì)體培養(yǎng)的影響，以分裂頻率與植板率為考察指標(biāo)，計(jì)算公式如下：

分裂頻率=視野內(nèi)發(fā)生分裂的再生細(xì)胞數(shù)視野內(nèi)細(xì)胞總數(shù)×100%;

植板率=視野內(nèi)細(xì)胞團(tuán)數(shù)視野內(nèi)細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.6 原生質(zhì)體融合 采用高pH高鈣法融合原生質(zhì)體，將分離純化后的原生質(zhì)體懸浮于適量CPW-4M液中，離心洗滌并調(diào)整至不同密度（0.5、1.0、2.0、3.0×105個(gè)·mL-1），于培養(yǎng)皿中靜置15 min;緩慢滴加30%、40%、50%的PEG 6000融合液，加入量為原生質(zhì)體懸浮液體積的不同倍數(shù)（0.2、0.5、1.0、2.0倍），靜置5 min;再滴加融合液2倍量的高pH高鈣洗液，靜置時(shí)間為10～40 min;混合液離心后去上清，重復(fù)3次;鏡檢并測(cè)量正常形態(tài)的細(xì)胞直徑，計(jì)算聚合率、多聚率，公式如下：

聚合率=雙細(xì)胞聚合的原生質(zhì)體數(shù)總原生質(zhì)體數(shù)×100%;

多聚率=3個(gè)及3個(gè)以上細(xì)胞聚合的原生質(zhì)體數(shù)總原生質(zhì)體數(shù)×100%。

1.2.7 融合產(chǎn)物的篩選 參考Hao et al（2002）的方法得到剛分裂生成的子細(xì)胞（NDC）的直徑RD和中期細(xì)胞的直徑RM之間的關(guān)系為RD=0.793 7RM。分別在原生質(zhì)體培養(yǎng)6～7 d時(shí)（子細(xì)胞多），測(cè)量并統(tǒng)計(jì)NDC細(xì)胞直徑，計(jì)算RD平均值;培養(yǎng)10～12 d時(shí)（中期細(xì)胞多），測(cè)量并統(tǒng)計(jì)以計(jì)算RM平均值，每次觀察100個(gè)以上可準(zhǔn)確測(cè)量直徑的細(xì)胞。

參考劉劍鋒等（2010）的方法，可知2個(gè)原生質(zhì)體融合后產(chǎn)物最小直徑Rmin與最大直徑Rmax。比對(duì)細(xì)胞直徑，一般非融合單細(xì)胞直徑（RD-RM）<雙細(xì)胞融合產(chǎn)物直徑（Rmin-Rmax），若直徑大于Rmax，則為3個(gè)細(xì)胞以上的融合產(chǎn)物。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解條件對(duì)原生質(zhì)體制備的影響

在我們前期的實(shí)驗(yàn)中，已經(jīng)對(duì)廣藿香原生質(zhì)體制備的酶液組合、酶解時(shí)間、滲透壓調(diào)節(jié)劑甘露醇濃度等條件進(jìn)行了系統(tǒng)研究（梁威等，2016），本文在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察酶解溫度和酶液pH值對(duì)酶解后原生質(zhì)體活力和產(chǎn)量的影響（圖1）。結(jié)果表明，在pH 5.8時(shí)，酶解分離后獲得的廣藿香原生質(zhì)體產(chǎn)量最高;在pH 5.8～6.2時(shí)，原生質(zhì)體活力較高。結(jié)合產(chǎn)量與活力數(shù)據(jù)，選擇pH 5.8為廣藿香細(xì)胞壁酶解的最適pH值。

酶解溫度在23～28 ℃時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)量較高;在25 ℃時(shí)，原生質(zhì)體活力達(dá)到最高值，溫度過高或過低活力都有所下降。綜合產(chǎn)量與活力數(shù)據(jù)，選擇25 ℃為廣藿香細(xì)胞壁適宜的酶解溫度。

2.2 不同因素對(duì)原生質(zhì)體培養(yǎng)的影響

2.2.1 不同培養(yǎng)方法對(duì)原生質(zhì)體培養(yǎng)的影響 采用液體淺層、固液雙層、瓊脂糖包埋與海藻酸鈉包埋4種方法對(duì)原生質(zhì)體進(jìn)行培養(yǎng)。每天鏡檢觀測(cè)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。從表1可以看出，液體淺層與固液雙層培養(yǎng)雖然分裂頻率與植板率都較高，但最終并未觀察到愈傷組織形成;瓊脂糖包埋與海藻酸鈉包埋的培養(yǎng)方法最終都形成了愈傷組織，其中海藻酸鈉包埋開始分裂時(shí)間較早，分裂頻率與植板率較高，因而選擇海藻酸鈉包埋法進(jìn)行廣藿香原生質(zhì)體培養(yǎng)。

2.2.2 不同細(xì)胞密度對(duì)原生質(zhì)體培養(yǎng)的影響 設(shè)計(jì)1.0×105、2.0×105、4.0×105、6.0×105個(gè)·mL-1? 4個(gè)不同的細(xì)胞密度進(jìn)行原生質(zhì)體培養(yǎng)，結(jié)果見表2。當(dāng)細(xì)胞密度為2.0×105個(gè)·mL-1時(shí)，分裂頻率與植板率都達(dá)到最高，且未出現(xiàn)褐化情況。因此，可選擇細(xì)胞密度為2.0×105個(gè)·mL-1。

2.2.3 不同激素對(duì)原生質(zhì)體培養(yǎng)的影響 考察了NAA、2，4-D、6-BA不同組合、不同濃度對(duì)原生質(zhì)體培養(yǎng)的影響，結(jié)果見表3。當(dāng)6-BA為2.0 mg·L-1、NAA為0.2 mg·L-1時(shí)，原生質(zhì)體分裂頻率與植板率最高，為最適激素濃度與配比。

2.2.4 其它因素對(duì)原生質(zhì)體培養(yǎng)的影響 考察了銨鹽、碳源及水解酪蛋白濃度對(duì)原生質(zhì)體培養(yǎng)的影響，結(jié)果見表4。銨鹽分別取MS培養(yǎng)基原銨鹽濃度（MS：NH4NO3 1 650 mg·L-1）、減半濃度（MS1）和不加銨鹽（MS0）3個(gè)梯度進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MS1培養(yǎng)基中原生質(zhì)體分裂頻率、 植板率均較高，且開始分裂時(shí)間和細(xì)胞團(tuán)形成時(shí)間都較短，因此最佳銨鹽濃度為NH4NO3 825 mg·L-1（MS1）。碳源分別選擇了0.5%、1.0%、2.0%的蔗糖與1.0%的葡萄糖，以MS1培養(yǎng)基進(jìn)行海藻酸鈉包埋培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，葡萄糖作為碳源未觀察到細(xì)胞分裂;而蔗糖含量為1.0%時(shí)，細(xì)胞開始分裂時(shí)間與形成細(xì)胞團(tuán)時(shí)間均較早，分裂頻率與植板率都較高，為最佳濃度。酸水解酪蛋白對(duì)原生質(zhì)體培養(yǎng)起一定促進(jìn)作用，本研究設(shè)定了0、200、500、800 mg·L-1 4個(gè)濃度梯度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酸水解酪蛋白濃度為500 mg·L-1時(shí)，細(xì)胞分裂時(shí)間較早，分裂頻率與植板率較高，為最適濃度。

2.3 不同因素對(duì)原生質(zhì)體融合的影響

2.3.1 融合產(chǎn)物篩選范圍 經(jīng)測(cè)量與統(tǒng)計(jì)，單個(gè)廣藿香原生質(zhì)體直徑為51.74～69.33 μm;經(jīng)公式推導(dǎo)，融合產(chǎn)物直徑為65.19～87.35 μm;剔除交集部分，雙細(xì)胞融合產(chǎn)物篩選范圍為69.33～87.35 μm。

2.3.2 PEG濃度對(duì)原生質(zhì)體融合的影響 考察30%、40%、50%的PEG 6000對(duì)原生質(zhì)體融合的影響，結(jié)果表明當(dāng)PEG 6000濃度為40%、50%時(shí)，聚合率較高，分別為56.24%和57.44%，兩者間差異不顯著;但當(dāng)濃度為50%時(shí)，多聚率達(dá)到13.74%，明顯高于前者，且該處理較多原生質(zhì)體融合為三聚體、多聚體及樹枝狀結(jié)構(gòu)（表5）。因此，PEG 6000的濃度選擇40%為宜。

2.3.3 細(xì)胞密度、融合時(shí)間及融合液加入量對(duì)原生質(zhì)體融合的影響 融合時(shí)間、細(xì)胞密度和融合液加入量對(duì)原生質(zhì)體融合的影響見表6。表6結(jié)果表明，隨著融合時(shí)間的增加，聚合率與多聚率都隨之增加，融合30 min與40 min的聚合率沒有顯著差異，但40 min時(shí)多聚率明顯增加，因此融合時(shí)間以30 min為宜;而隨著細(xì)胞密度的增加，聚合率與多聚率都隨之增高，以較高聚合率與較低多聚率為考察標(biāo)準(zhǔn)，選擇2.0×105個(gè)·mL-1作為最適融合細(xì)胞密度;隨著融合液加入量的增加，多聚率不斷提高，從統(tǒng)計(jì)分析比較結(jié)果來看，融合液與細(xì)胞液體積比選擇0.5或1.0較為合理，按照最佳效果最低濃度原則，選擇0.5倍融合液為最適加入量，此條件下聚合率達(dá)57.19%，多聚率為9.2%。

按照上述原生質(zhì)體的最適制備、最適培養(yǎng)及融合條件，進(jìn)行廣藿香廣藿香原生質(zhì)體制備、培養(yǎng)及融合，得到了形態(tài)及生長發(fā)育良好的單細(xì)胞及雙細(xì)胞融合原生質(zhì)體（圖版Ⅰ）。融合產(chǎn)物經(jīng)海藻酸鈉包埋培育2個(gè)月，觀察到愈傷組織再生。

3 討論

3.1 原生質(zhì)體培養(yǎng)

本研究考察了多種培養(yǎng)方法對(duì)廣藿香原生質(zhì)體培養(yǎng)的影響，結(jié)果表明海藻酸鈉包埋培養(yǎng)的方法最好。此方法屬于固體培養(yǎng)，能避免液體培養(yǎng)原生質(zhì)體不固定、不易跟蹤觀察的缺點(diǎn)。作為一種高分子化合物，海藻酸鈉質(zhì)地柔軟、均一，相對(duì)于瓊脂糖，屬于軟包埋原生質(zhì)體的培養(yǎng)方式，可以避免瓊脂糖包埋時(shí)熱激（heat shock）對(duì)原生質(zhì)體的傷害（賈士榮等，1988）。雖然液體培養(yǎng)與固液雙層培養(yǎng)的原生質(zhì)體更早分裂，并有較高的分裂頻率和植板率，但最終都未形成愈傷組織，可能是隨著原生質(zhì)體分裂后細(xì)胞數(shù)量增多，間距顯著減小，代謝產(chǎn)物所產(chǎn)生的相互毒害作用愈加嚴(yán)重所致。

本研究中，廣藿香原生質(zhì)體培養(yǎng)時(shí)的最佳細(xì)胞密度為2.0×105個(gè)·mL-1，楊茹（2010）認(rèn)為細(xì)胞密度一般應(yīng)控制在104～105個(gè)·mL-1，與本研究結(jié)果一致。原生質(zhì)體生長受到細(xì)胞密度影響往往是雙向的，若密度過低，促進(jìn)原生質(zhì)體分裂的內(nèi)源性物質(zhì)濃度較低，將導(dǎo)致原生質(zhì)體不能持續(xù)分裂（陳名紅等，2007）;若密度過高，由于養(yǎng)分缺失或有害細(xì)胞代謝物積累，將會(huì)阻礙再生細(xì)胞正常生長。

培養(yǎng)基組分中氮源的種類和濃度對(duì)原生質(zhì)體培養(yǎng)有重要影響，普遍認(rèn)為銨態(tài)氮對(duì)原生質(zhì)體是有一定毒害作用的，應(yīng)盡量減少以避免傷害。廣泛應(yīng)用于組織培養(yǎng)的MS培養(yǎng)基中NH4NO3含量為1 650 mg·L-1，而常用于原生質(zhì)體培養(yǎng)的KM8P培養(yǎng)基NH4NO3含量為600 mg·L-1（Kai & Michayluk，1975），以及NT培養(yǎng)基NH4NO3含量為825 mg·L-1（Nagata & Takebe，1971），銨鹽含量都有所調(diào)低;本實(shí)驗(yàn)在進(jìn)行銨鹽含量考察時(shí)，設(shè)置了不添加NH4NO3的比較梯度，結(jié)果顯示無銨態(tài)氮的培養(yǎng)基并不利于原生質(zhì)體生長，說明銨態(tài)氮對(duì)于廣藿香原生質(zhì)體培養(yǎng)仍然是必不可少的，其濃度可能需要根據(jù)物種的不同進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整;而當(dāng)NH4NO3濃度為825 mg·L-1，廣藿香原生質(zhì)體生長較好，與NT培養(yǎng)基中銨態(tài)氮含量一致。

3.2 原生質(zhì)體融合

本研究采用了PEG-高pH高鈣法進(jìn)行廣藿香的原生質(zhì)體融合，同時(shí)研究了細(xì)胞密度、融合時(shí)間及融合液加入量對(duì)融合的影響。PEG-高pH高鈣法是已有的原生質(zhì)體融合方法中應(yīng)用較多的一種，含有醚鍵的PEG具有負(fù)極性，與水、蛋白質(zhì)、糖等正極化基團(tuán)形成氫鍵，鏈狀的PEG聚合物可充當(dāng)相鄰原生質(zhì)體表面間的分子橋而使其粘連（Kao & Michayluk，1974）;植物原生質(zhì)體表面電荷在-10～-30 mV之間，高pH高濃度鈣離子可以中和膜表面負(fù)電荷（李浚明，2005）;洗滌過程中，含有較高濃度Ca2+的洗液可以使原生質(zhì)體膜上具有負(fù)極性的PEG分子洗脫，原生質(zhì)體表面電荷因而重新分配，促進(jìn)了原生質(zhì)體融合。PEG濃度、細(xì)胞密度、融合液加入量對(duì)原生質(zhì)體融合有著相似的影響作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著PEG濃度、融合時(shí)間、細(xì)胞密度和融合液加入量的增加，聚合率與多聚率都隨之增加;推測(cè)一開始作用較弱時(shí)，原生質(zhì)體融合不徹底，融合率低;各影響因素增強(qiáng)后，較多原生質(zhì)體融合為三聚體、多聚體與樹枝狀結(jié)構(gòu)，多聚率偏高。因此需要對(duì)影響原生質(zhì)體融合的各因素進(jìn)行篩選。

本研究以物理選擇法進(jìn)行了融合產(chǎn)物篩選，在測(cè)量中期細(xì)胞直徑時(shí)，參考熊洋等（2013）的方法處理廣藿香原生質(zhì)體，未觀察到細(xì)胞分裂中期的細(xì)胞，可能是由于懸浮細(xì)胞全日光照培養(yǎng)，擾亂了細(xì)胞正常生長規(guī)律，細(xì)胞個(gè)體間分裂同步性差，從而使短暫的分裂中期時(shí)刻不易被大量捕獲。為了得到單個(gè)廣藿香懸浮細(xì)胞直徑范圍，最后選用了以測(cè)量NDC細(xì)胞直徑與驗(yàn)證公式相結(jié)合的方法來使中期細(xì)胞直徑測(cè)量值在準(zhǔn)確范圍內(nèi)。