小麥淀粉加工廢液制備 葡萄糖漿的糖化工藝優(yōu)化

劉露露,王若蘭,*,吳 遠,2,唐開梁

(1.河南工業(yè)大學糧油食品學院,河南鄭州 450001;2.福建中儲糧糧油質監(jiān)中心,福建福州 350008;3.中國儲備糧管理集團有限公司北京分公司,北京 100037)

在小麥深加工過程中,主要生產出小麥淀粉和谷朊粉等產品,而小麥淀粉因顆粒直徑和組成成分不同,可分為A淀粉和B淀粉[1]。B淀粉大多是以戊糖類為代表的非淀粉多糖、結構性蛋白質等混雜物,難以分離,造成小麥在深加工過程中因利用不徹底而造成浪費。

小麥加工廢液是一種戊聚糖含量和淀粉含量都較高的物質,隨著小麥生產淀粉工藝的成熟和發(fā)展,副產物廢液的產量也隨之增長,大部分廢液作為動物飼料,在不能及時銷售的情況下直接進入污水處理系統(tǒng),導致小麥的綜合利用率低,影響了企業(yè)的經濟效益[2]。副產物中含有淀粉、戊聚糖、蛋白質、纖維素等營養(yǎng)成分,可以將廢液中的小麥淀粉制備為葡萄糖漿,提高小麥產品附加值和綜合利用率。工業(yè)生產葡萄糖是以淀粉為原料,通過水解淀粉的α-1,4-糖苷鍵和α-1,6糖苷鍵,游離出單糖得到的[3]?？v觀葡萄糖生產技術的發(fā)展歷程,淀粉制糖的主要方法按時間的發(fā)展主要有三種:酸解法、酸酶聯(lián)用法和雙酶法[4]。早在19世紀初德國化學家用淀粉進行酸水解來制備葡萄糖[5],拉開了酸解法的序幕。但酸解法的缺點是葡萄糖產率低,副產物多,精制難度大。1940年,隨著酶制劑的產生,酸酶聯(lián)用的制糖方法開始出現(xiàn)[6]。之后酶制劑研發(fā)水平的不斷發(fā)展,可以用酶替代強酸生產葡萄糖,至此開始了雙酶法制取葡萄糖,大大簡化淀粉制糖工藝。

目前我國普遍采取雙酶法制取葡萄糖[7],主要工藝分為液化及糖化兩部分:小麥淀粉經液化酶液化以后,大分子淀粉顆粒水解為小分子的糊精等物質,在糖化酶的催化作用下水解成葡萄糖等單糖。雙酶法具有對設備耐酸耐堿的要求較低,酶催化效率高且酶來源廣泛,酶制劑成本較低等優(yōu)點。液化酶最常用的是α-淀粉酶,它從底物內部隨機水解α-1,4-糖苷鍵,生成少量葡萄糖和質量不等的低聚糖和糊精[8]。糖化酶常用的是葡萄糖淀粉酶和普魯蘭酶,葡萄糖淀粉酶是外切酶,水解短鏈糊精時是從非還原性末端的α-1,4鍵開始;普魯蘭酶即支鏈淀粉酶,能夠水解α-1,6-糖苷鍵[9],因此糖化的工業(yè)生產常使用雙酶法,優(yōu)點是糖化時間短、轉化效率高等[10]。本實驗綜合效率和成本的考慮,選擇使用雙酶糖化法,研究了葡萄糖淀粉酶添加量、普魯蘭酶添加量、糖化溫度和糖化pH各單因素對糖化液還原糖含量的影響,并通過響應面實驗得出最優(yōu)工藝參數。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小麥加工廢液 鄲城財鑫糖業(yè)有限責任公司;葡萄糖淀粉酶 北京索萊寶科技有限公司;普魯蘭酶 杰能科(中國)生物工程有限公司;酒石酸鉀鈉 國藥集團化學試劑有限公司;可溶性淀粉 天津市科密歐化學試劑有限公司;乙腈 天津市四友精密化學品有限公司。

DZF型電熱鼓風恒溫干燥箱 上海實驗儀器總廠;PHS-3C型精密酸度計 上海大普儀器有限公司;752型紫外可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司;1260Infinity型高效液相色譜儀 美國Agilent公司;ELSD2000型蒸發(fā)光散射檢測器 美國奧泰科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 前處理實驗 稱取30 g小麥加工廢液,將其混合搖勻,再使用木聚糖酶和耐高溫α-淀粉酶進行降黏和液化[11],從而得到了糖化工藝的原料。木聚糖酶處理條件如下:木聚糖酶添加量18 U/g、反應溫度50 ℃、反應pH5.5、反應時間為90 min。耐高溫α-淀粉酶處理條件如下:耐高溫α-淀粉酶添加量30 U/g,液化溫度92 ℃,pH6.60,粉漿濃度25.0%。

1.2.2 糖化實驗 向液化后的原料內加入一定量的葡萄糖淀粉酶和普魯蘭酶,在一定溫度和pH的條件下,糖化一定時間。糖化結束后于100 ℃中水浴10 min滅酶,離心機(5000 r/min)離心20 min。取上清液測定還原糖含量(DE值)。

1.2.3 單因素實驗 采用1.2.2下方法對原料進行糖化,糖化條件為:固定反應條件為pH4.0、普魯蘭酶添加量0.15 U/g、糖化溫度60 ℃、糖化時間48 h,考察不同葡萄糖淀粉酶添加量(150、200、250、300、350、400 U/g)對糖化液DE值的影響;固定反應條件為pH4.0、葡萄糖淀粉酶添加量250 U/g、糖化溫度為60 ℃、糖化時間48 h,考察不同普魯蘭酶添加量(0.00、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 U/g)對糖化液DE值的影響;固定反應條件為pH4.0、葡萄糖淀粉酶添加量250 U/g、普魯蘭酶添加量0.15 U/g、糖化溫度60 ℃,考察不同糖化時間(12、24、36、48、60、78 h)對糖化液DE值的影響;固定反應條件為pH4.0、葡萄糖淀粉酶添加量為250 U/g、普魯蘭酶添加量為0.15 U/g、糖化時間為36 h,考察不同糖化溫度(45、50、55、60、65、70 ℃)對糖化液DE值的影響;固定反應條件為葡萄糖淀粉酶添加量250 U/g、普魯蘭酶添加量0.15 U/g、糖化時間36 h、糖化溫度60 ℃,考察不同pH(3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5)對糖化液DE值的影響。進行單因素實驗,考察各因素變量對糖化液DE值的影響。

1.2.4 響應面實驗 由單因素的實驗結果,探究葡萄糖淀粉酶和普魯蘭酶協(xié)同糖化效果,以糖化液DE值為響應值(Y),選擇了對DE值影響較大的四個因素為變量,分別為葡萄糖淀粉酶添加量(X1)、普魯蘭酶添加量(X2)、糖化溫度(X3)和糖化pH(X4),采用Design-Expert 8.0.6軟件Box-Behnken中心組合實驗設計四因素三水平響應面實驗優(yōu)化糖化工藝,選定最優(yōu)組合。因素水平設計如表1。

表1 糖化工藝Box-Behnken實驗因素水平表Table 1 Specification of Box-Behnken test design

1.2.5 DE值的測定 參照GB/T 5009.7-2008 直接滴定法進行測定。

1.2.6 葡萄糖相對含量的測定 采用高效液相-蒸發(fā)光散射檢測法測定葡萄糖的相對含量[12-14]。具體步驟如下:采用Agilent 1260 Infinity高效液相色譜儀對葡萄糖相對含量進行測定,檢測器為1260 Infinity ELSD蒸發(fā)光散射檢測器,色譜柱為ZORBAX SB-C 18分析柱(5 μm,250 mm×4.6 mm ID),流動相:V(乙腈)∶V(水)=50∶50,柱溫為室溫,進樣量:5 μL;ELSD漂移管溫度:90 ℃,載氣為氮氣,流速:1.5 L/min。

葡萄糖標準曲線的繪制:配制0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL經0.45 μm濾膜過濾后的葡萄糖標準溶液,在選取的液相條件下獲得色譜圖,以葡萄糖濃度為X軸,目標峰面積為Y軸所作標準曲線,葡萄糖標準品濃度(x)和峰面積(y)間的線性擬合方程為y=10485.73459x-307.16873,R2=0.9733，說明擬合良好,標準曲線可用。

1.2.7 計算方法

1.2.8 數據處理 對實驗數據采用SPSS 12.0.1統(tǒng)計軟件進行處理,用Origin 8.6軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果分析

2.1.1 葡萄糖淀粉酶添加量對DE值的影響 由圖1可以看出,DE值隨葡萄糖淀粉酶添加量的增加而升高,可能是因為葡萄糖淀粉酶是外切酶,水解短鏈糊精時是從非還原性末端的α-1,4鍵開始,能夠進一步促進淀粉水解。葡萄糖淀粉酶對糖化液的DE值影響較大,葡萄糖淀粉酶添加量為150～250 U/g時,DE值從46%迅速增加至62%,葡萄糖淀粉酶添加量大于250 U/g，DE值增值不明顯。可能是底物濃度一定時,酶濃度在250 U/g后達到飽和,繼續(xù)增加酶濃度不會再促進DE值的升高,反而會造成酶的浪費和引入蛋白過多影響后期精制,因此選擇葡萄糖淀粉酶添加量為250 U/g較適宜。

圖1 葡萄糖淀粉酶添加量對DE值的影響Fig.1 Effect of glucose amylase on DE value

2.1.2 普魯蘭酶添加量對DE值的影響 普魯蘭酶主要作用于α-1,6-糖苷鍵,是一種脫支酶,可以彌補葡萄糖淀粉酶不能水解α-1,6-糖苷鍵的缺陷[15]。單獨用于糖化時水解效率低于葡萄糖淀粉酶,若兩種酶共同作用,則能極大縮短糖化時間,提高效率。

由圖2可以看出,糖化液的初始DE值為56.63%,普魯蘭酶添加量至0.15 U/g時,DE值增加至61%左右,繼續(xù)增加普魯蘭酶濃度,DE值增速緩慢,原因是普魯蘭酶濃度達到飽和,繼續(xù)添加不再水解底物,因此普魯蘭酶添加量選擇0.15 U/g較適宜。

圖2 普魯蘭酶添加量對DE值的影響Fig.2 Effect of the amount of pullulanase on DE value

2.1.3 糖化時間對DE值的影響 酸酶法的糖化工藝時間較長[16],隨著雙酶法的普遍使用,糖化工藝的時間大大縮短。糖化時間不足,會導致酶與底物無法充分反應,反之則會導致糖化液黏度增加,微生物的生長,也會增加生產成本。由圖3可以看出,隨著糖化時間的延長，糖化液DE值由59.84%逐漸增加至63.93%;36 h以后,糖化液的DE值增幅不大,實驗中還發(fā)現(xiàn),糖化時間大于60 h時,糖化液的黏度變大且開始發(fā)黃，影響產品品質。因此,糖化時間選擇36 h較為適宜。

圖3 糖化時間對DE值的影響Fig.3 Effect of saccharification time on DE value

2.1.4 糖化溫度對DE值的影響 由圖4可以看出,糖化溫度在45～60 ℃,糖化液DE 值由63.53%明顯升至68.42%,60 ℃以后,糖化液DE值達到拐點,DE值開始下降。當糖化溫度為70 ℃時,糖化液DE值下降至65.98%。原因是溫度對糖化液DE值的作用主要體現(xiàn)在對兩種糖化酶活性的影響,葡萄糖淀粉酶的最適溫度為50～60 ℃[17],普魯蘭酶的最適溫度為58～62 ℃[18],因此當溫度高于60 ℃時,兩種酶的活性下降,糖化液的DE值不會再隨著溫度升高而升高。糖化溫度的適宜取值為60 ℃。

圖4 糖化溫度對DE值的影響Fig.4 Effect of saccharification temperature on DE value

2.1.5 糖化pH對DE值的影響 由圖5可以看出,隨糖化pH的增大，DE值呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。糖化pH范圍在3.0～4.0時,糖化液DE值由59.5%升至65.06%,之后開始下降,當pH為5.5時,糖化液DE值下降至60.23%。原因是糖化pH對DE值的影響也是通過影響酶活而實現(xiàn)的。葡萄糖淀粉酶的最適pH為3.5～5.0,普魯蘭酶的最適pH為4.4～5.5。pH過低或過高都會影響普魯蘭酶和葡萄糖淀粉酶的活性。因此糖化pH的最適取值為4.0左右。

圖5 糖化pH對DE值的影響Fig.5 Effect of saccharification pH on DE value

2.2 響應面法實驗結果與分析

表2 響應面分析方案與實驗結果Table 2 Response surface analysis scheme and test results

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Regression equation analysis of variance

表4 回歸模型可信度分析Table 4 Analysis of credibility of regression model

2.2.2 響應面分析與優(yōu)化 回歸方程一次項X1、X2的p<0.01,說明葡萄糖淀粉酶添加量(X1)、普魯蘭酶添加量(X2)對糖化液的DE值影響極顯著,在交互作用上,X2X3對糖化液DE值的影響顯著(p<0.05),X3X4對糖化液DE值影響極顯著(p<0.01)。二次項p值均小于0.05,說明四個因素的二次項對糖化液的DE值的影響顯著(p<0.05),4個因素影響順序為X1>X2>X4>X3。圖6為交互作用顯著的三維圖線及等高線圖。

圖6 各因素交互作用對糖化液DE值的影響Fig.6 Effects of interaction of various factors on DE value of saccharification solution

2.2.3 響應面優(yōu)化與驗證實驗 由該模型得到的最優(yōu)工藝水平為葡萄糖淀粉酶添加量為300 U/g、普魯蘭酶添加量為0.17 U/g、糖化溫度為61.2 ℃、糖化pH為3.87,糖化液預測DE值為68.92%。根據實際實驗情況,修正各因素水平條件為葡萄糖淀粉酶為300 U/g、普魯蘭酶添加量為0.17 U/g、糖化溫度為62 ℃、糖化pH為3.9,為了檢驗最優(yōu)工藝的可靠性,按修正后的水平條件進行驗證實驗,糖化時間均定為36 h,得到糖化液DE值為69.45%。與模型預測結果相近,進一步驗證了該模型的可靠性。

2.2.4 葡萄糖含量的測定 葡萄糖含量的測定采用HPLC-ELSD外標法,圖8是實驗所得的高效液相色譜圖,與圖7葡萄糖標準樣品的高效液相色譜圖比較可以看出,1.662 min出現(xiàn)的溶劑峰在1.662 min時出現(xiàn),葡萄糖峰在1.923 min時出現(xiàn),峰面積為2190.423 mV·s,占比99.1242%,帶入標準曲線中計算可得樣品中總葡萄糖總回收率為23.82%,淀粉轉化率為78.70%。研究表明,將小麥加工廢液制備為葡萄糖漿的糖化工藝是可行的,可以運用到實際生產中。

圖7 葡萄糖標準品HPLC圖Fig.7 Glucose Standard HPLC

圖8 樣品HPLC圖Fig.8 Sample HPLC

3 結論

使用葡萄糖淀粉酶和普魯蘭酶協(xié)同糖化小麥加工廢液中的淀粉從而制得葡萄糖漿,并通過響應面實驗確定了糖化工藝的最優(yōu)工藝參數。理論最優(yōu)糖化工藝水平為糖化溫度為61.2 ℃、糖化pH為3.87、葡萄糖淀粉酶添加量為300 U/g、普魯蘭酶添加量為0.17 U/g,糖化液預測DE值為68.92%。經修正后的最佳糖化工藝水平為糖化溫度62 ℃、糖化pH3.9、葡萄糖淀粉酶添加量300 U/g,普魯蘭酶添加量0.17 U/g,得到的DE值為69.45%。經高效液相色譜測定,淀粉轉化率為78.70%。說明從小麥加工廢液中制取葡萄糖漿是切實可行的,通過響應面探究出了最佳糖化工藝水平參數,對實際生產有著重要的指導意義。

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