陳啟航,朱秀花,俞 珺,余 娟,方旭波,*,陳小娥,,江旭華
(1.浙江海洋大學(xué)東海科學(xué)技術(shù)學(xué)院,浙江舟山 316000;2.浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院,浙江舟山 316022;3.浙江富丹旅游食品有限公司,浙江舟山 316104)
金槍魚,又叫鮪魚、吞拿魚,具有低脂肪、營(yíng)養(yǎng)豐富等優(yōu)點(diǎn)[1-2]。金槍魚在加工成魚柳及金槍魚罐頭時(shí),會(huì)產(chǎn)生大量蒸煮液,其蒸煮液仍含有大量蛋白質(zhì)、核苷酸、氨基酸等多種營(yíng)養(yǎng)成分和風(fēng)味物質(zhì),是生產(chǎn)調(diào)味品、蛋白營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑等食品的優(yōu)質(zhì)原料。而目前我國(guó)的金槍魚蒸煮液沒(méi)有得到良好的開(kāi)發(fā)利用,大都未經(jīng)處理直接排放,不僅極大地浪費(fèi)蛋白質(zhì)資源,而且污染環(huán)境。采用酶解技術(shù)酶解蒸煮液中的蛋白質(zhì),反應(yīng)條件溫和,不破壞或很少破壞原有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),并且工藝簡(jiǎn)單,設(shè)備要求不高[3]。
目前,國(guó)內(nèi)對(duì)蒸煮液的研究多集中在其他海產(chǎn)品上,趙華杰等[4]利用貽貝蒸煮液加工得到呈味良好、風(fēng)味獨(dú)特的發(fā)酵調(diào)味品;張露等[5]以鯖魚罐頭蒸煮液為原料,采用酶解工藝制備具有抗氧化功能的生物活性肽;鄭曉杰等[6]利用毛蝦蒸煮液加工成毛蝦粉水產(chǎn)調(diào)味料,并對(duì)其噴霧干燥工藝進(jìn)行了優(yōu)化;而關(guān)于金槍魚蒸煮液加工利用的研究報(bào)道基本處于空白階段。因此,如果以金槍魚蒸煮液為原料開(kāi)發(fā)成消費(fèi)者喜愛(ài)的、具有海鮮風(fēng)味的調(diào)味汁,既能夠增加原料附加值,同時(shí)又可解決廢水排放帶來(lái)的環(huán)境污染等問(wèn)題。
本實(shí)驗(yàn)以金槍魚蒸煮液為主要原料,以水解度[7-8]為指標(biāo),篩選出最合適的蛋白酶,在此基礎(chǔ)上,考察酶解時(shí)間、pH、溫度和加酶量對(duì)水解度的影響,結(jié)合響應(yīng)面分析[9-10]研究酶解最佳工藝條件,并對(duì)其脫腥和殺菌工藝進(jìn)行優(yōu)化[11-12],同時(shí)以白糖、食用鹽、蠟質(zhì)玉米變性淀粉為配料,制成風(fēng)味獨(dú)特的金槍魚蒸煮液調(diào)味汁,以便更合理地開(kāi)發(fā)利用蒸煮液,同時(shí)滿足市場(chǎng)對(duì)天然海鮮調(diào)味品的需求[13-17]。
鰹魚蒸煮液 經(jīng)測(cè)定其蛋白質(zhì)含量為3.71%,-20 ℃冰箱保存,取自浙江富丹旅游食品有限公司;食用鹽、白糖、醬油 市售;蠟質(zhì)玉米變性淀粉 東莞東美食品公司;安琪高活性干酵母 安琪酵母股份有限公司;木瓜蛋白酶(1×105U/g)、中性蛋白酶(1×105U/g)、堿性蛋白酶(1×105U/g)、胰蛋白酶(4×103U/g) 南寧龐博生物工程有限公司;胃蛋白酶(2.1×104U/g) 美國(guó)Sigma公司;其他試劑 均為分析純。
HHS型電熱恒溫水浴鍋 上海棱光技術(shù)有限公司;TGL-16C低速大容量離心機(jī) 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)儀器廠;Kjeltec400自動(dòng)定氮儀 丹麥FOSS公司;RE-52CS-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā) 上海亞榮生化儀器廠;BS110S電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;PHS-3B精密pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;YXQ-LS-50G壓力蒸汽滅菌器 上海科曉科學(xué)儀器有限公司。
1.2.1 風(fēng)味調(diào)味汁工藝流程 金槍魚蒸煮液→酶解→滅酶→離心→脫腥→濃縮→調(diào)配→滅菌→調(diào)味汁成品
1.2.2 操作要點(diǎn)
1.2.2.1 酶解處理 將蒸煮液調(diào)節(jié)到最適pH,置于一定溫度水浴鍋中,待其溫度讀數(shù)穩(wěn)定后添加一定量的酶,酶解一定時(shí)間后,并置于沸水中滅酶處理10 min,使蛋白酶鈍化,之后取出冷卻至室溫。
1.2.2.2 離心 滅酶后經(jīng)4000 r/min離心10 min,除去不溶物和懸浮物,去除上層油脂,取上清液即可得到金槍魚酶解液。
1.2.2.3 脫腥 采用酵母發(fā)酵法[18-19],在300 mL酶解液中分別添加0.25%~0.75%的酵母進(jìn)行發(fā)酵脫腥處理,在30~40 ℃條件下發(fā)酵50~70 min,以除去魚腥味。
1.2.2.4 濃縮 采用真空濃縮方法對(duì)金槍魚酶解液進(jìn)行濃縮處理,將金槍魚酶解液裝入到旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中,濃縮溫度調(diào)為55 ℃,濃縮至原先體積的三分之一左右。
1.2.2.5 調(diào)配 經(jīng)過(guò)濃縮后可得到黃色液體,為進(jìn)一步提高鮮味,以酶解液為基料,按照以下配方進(jìn)行調(diào)配:白糖2%、食用鹽6%、蠟質(zhì)玉米變性淀粉1.5%,攪拌使其混勻。
1.2.2.6 滅菌 置于200 mL玻璃瓶中,密封,90 ℃下滅菌30 min或 121 ℃下滅菌20 min,冷卻,即金槍魚風(fēng)味海鮮調(diào)味汁。
1.2.3 最適蛋白酶的選擇 取100 mL蒸煮液,分別添加200 U/g的中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰酶,酶解2 h,其中胃蛋白酶酶解液pH2.5、溫度45 ℃,其余在自然pH、55 ℃溫度條件下進(jìn)行酶解,以水解度為指標(biāo),比較各蛋白酶對(duì)蒸煮液的酶解效果的差異。
1.2.4 金槍魚蒸煮液酶解單因素實(shí)驗(yàn) 蛋白酶添加量(100、200、300、400、500 U/g)、酶解溫度(45、50、55、60、65 ℃)、酶解時(shí)間(2、3、4、5、6 h)、pH(6、6.5、7、7.5、8)作為單因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn),研究單因素對(duì)水解度的影響,其余各因素的固定水平為加酶量300 U/g、溫度為55 ℃、酶解時(shí)間為3 h、pH為7。每組重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次,來(lái)確定酶解最佳工藝。
1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化酶解金槍魚蒸煮液實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,以水解度為響應(yīng)值,采用響應(yīng)面對(duì)酶添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間這三個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化,響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)編碼見(jiàn)表1。
表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment
1.2.6 酶解液脫腥工藝正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 為了優(yōu)化酵母發(fā)酵脫腥的工藝條件,本實(shí)驗(yàn)選用安琪高活性干酵母,在考察單因素(發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、酵母添加量)對(duì)腥味值影響的基礎(chǔ)上,對(duì)其進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)。正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及水平編碼見(jiàn)表2。
1.2.7 酶解液殺菌條件確定 將產(chǎn)品分別采用121 ℃/20 min高溫高壓殺菌、90 ℃/30 min巴氏殺菌兩種殺菌方式殺菌后,置于室溫陰涼處依次保存15、30、60 d后,以感官評(píng)價(jià)、大腸菌群和菌落總數(shù)為指標(biāo),考察這兩種殺菌方式對(duì)產(chǎn)品殺菌效果的影響,以此確定酶解液較佳的殺菌條件[3]。
1.3.1 蛋白質(zhì)含量 參照GB 5009.5-2016《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》[20]測(cè)定。
1.3.2 水解度的測(cè)定 甲醛滴定法測(cè)定,甲醛滴定法可以用來(lái)測(cè)定氨基氮,對(duì)于氨基氮含量以消耗的NaOH量為指標(biāo)。計(jì)算公式為:
1.3.3 腥味值測(cè)定 由10名對(duì)魚腥味比較敏感并經(jīng)過(guò)專門訓(xùn)練的食品科學(xué)與工程專業(yè)學(xué)生組成評(píng)判小組,將品嘗后感受到的腥味以分?jǐn)?shù)表示。0無(wú)腥味;1略有腥味;2腥味較弱;3有腥味;4腥味一般;5腥味偏重;6腥味較重;7腥味很重。分為7個(gè)級(jí)別進(jìn)行評(píng)分,滿分共7分,其中分值越低,則表示魚腥味越輕。
1.3.4 感官評(píng)定指標(biāo) 以金槍魚蒸煮液濃縮汁作為基料,選擇經(jīng)過(guò)培訓(xùn)且身體健康,味覺(jué)、視覺(jué)正常的具有感官評(píng)價(jià)知識(shí)的食品科學(xué)與工程專業(yè)學(xué)生10人,以滋味、色澤、氣味、形態(tài)為評(píng)價(jià)指標(biāo),確定最佳調(diào)配方式,先看再聞后嘗,對(duì)制備的調(diào)味汁進(jìn)行感官評(píng)定,滿分40分,滋味、色澤、氣味、形態(tài)各10分,分值越大,說(shuō)明調(diào)味汁風(fēng)味越好,最終結(jié)果剔除異常數(shù),求取平均值,打分標(biāo)準(zhǔn)如表3。
表3 風(fēng)味海鮮調(diào)味汁感官評(píng)價(jià)表Table 3 The sensory evaluation table of flavor seafood sauce
1.3.5 氨基酸態(tài)氮含量 參照GB 5009.39-2016《醬油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》[21]測(cè)定。
1.3.6 可溶性固形物、鹽分測(cè)定 參照王曉賓等[22]測(cè)定。
1.3.7 微生物指標(biāo) 參照GB 4789.2-2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn):菌落總數(shù)測(cè)定》[23]和GB 4789.3-2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn):大腸菌群計(jì)數(shù)》[24]測(cè)定、GB 4789.4-2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn):沙門氏菌檢驗(yàn)》[25]、GB 4789.5-2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn):志賀氏菌檢驗(yàn)》[26]、GB 4789.10-2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn):金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》[27]。
采用Origin Pro 8.5軟件繪圖,響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)通過(guò)Design Expert8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面分析。
2.1.1 不同蛋白酶對(duì)金槍魚蒸煮液酶解效果的篩選 酶具有高效、專一性,在很大程度上會(huì)影響產(chǎn)品的質(zhì)量和風(fēng)味,所以需要選擇最合適的酶來(lái)進(jìn)行酶解。由圖1可見(jiàn),木瓜蛋白酶的水解度最高,水解度達(dá)到17.16%,胰蛋白酶和中性蛋白酶較好,堿性蛋白酶次之,胃蛋白酶效果最差。就木瓜蛋白酶而言,該酶對(duì)動(dòng)物蛋白的水解效果較好,且水解物苦味較弱[28],所以本實(shí)驗(yàn)選用木瓜蛋白酶進(jìn)行水解。
圖1 不同蛋白酶對(duì)金槍魚蒸煮液水解效果比較Fig.1 Comparison of hydrolysis effect of different proteases on Skipjack Tuna cooking liquor
2.1.2 金槍魚蒸煮液酶解的單因素實(shí)驗(yàn)
2.1.2.1 蛋白酶添加量對(duì)蒸煮液酶解效果的影響 圖2表明,當(dāng)酶用量在100~300 U/g時(shí),水解度隨著酶用量的增加而呈現(xiàn)增大的趨勢(shì),當(dāng)酶用量達(dá)到300 U/g后,酶用量繼續(xù)增加,水解度增加逐漸減緩,是由于底物逐漸消耗,酶趨于飽和狀態(tài)。綜合經(jīng)濟(jì)效益,加酶量為300 U/g比較適宜。
2.1.2.2 酶解溫度對(duì)蒸煮液酶解效果的影響 由圖3可見(jiàn),隨著酶解溫度的升高,水解度增加,酶解溫度為55 ℃時(shí),水解度達(dá)到最大值,其后逐漸下降。這是因?yàn)殡S著溫度升高,蛋白酶活力也逐漸增加,酶促反應(yīng)也加快,但當(dāng)超過(guò)最適溫度,酶活力逐漸下降,反應(yīng)速率也隨之降低。故本實(shí)驗(yàn)酶解溫度為55 ℃左右較為適宜,與姚芳等[15]研究結(jié)果相似。
圖3 酶解溫度對(duì)金槍魚蒸煮液酶解效果的影響Fig.3 Effect of enzymolysis temperature on enzymatic hydrolysis of Skipjack Tuna cooking liquor
2.1.2.3 酶解時(shí)間對(duì)蒸煮液酶解效果的影響 圖4表明,水解度隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,酶解時(shí)間在4 h以內(nèi),水解度逐漸增加。超過(guò)4 h,隨著時(shí)間的增加,水解度則增長(zhǎng)緩慢,是由于隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),可能會(huì)導(dǎo)致酶失活,酶活力下降,而且過(guò)度水解導(dǎo)致氨基酸的破壞,使蛋白質(zhì)含量降低[29]。綜合經(jīng)濟(jì)效益,酶解時(shí)間為4 h比較適宜,該結(jié)果與李陽(yáng)等[30]研究結(jié)果相似。
圖4 酶解時(shí)間對(duì)金槍魚蒸煮液酶解效果的影響Fig.4 Effect of enzymolysis time on enzymatic hydrolysis of Skipjack Tuna cooking liquor
2.1.2.4 pH對(duì)蒸煮液酶解效果的影響 由圖5可見(jiàn),pH對(duì)酶水解也會(huì)造成一定影響,在pH為7.0,水解度達(dá)到最大,為27.24%,是由于木瓜蛋白酶的最適合pH6.5~7.5,pH在此范圍內(nèi)有利于酶解反應(yīng)的進(jìn)行。綜合考慮,本實(shí)驗(yàn)pH最佳為7.0。
圖5 pH對(duì)金槍魚蒸煮液酶解效果的影響Fig.5 Effect of pH on enzymatic hydrolysis of Skipjack Tuna cooking liquor
2.2.1 回歸模型的確定及響應(yīng)面分析 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4,通過(guò)軟件處理,除去不顯著項(xiàng)得到水解度模型的二次多項(xiàng)回歸方程為:
表4 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 4 Design and results of response surface analysis
Y=27.05+1.17A+1.70B-0.53C+0.19AB+1.31AC-0.44BC-2.26A2-3.40B2-3.04C2
方差分析結(jié)果見(jiàn)表5,由表5可知,模型p<0.0001,而失擬項(xiàng)不顯著p=0.6772>0.05,表明模型顯著,二次模型選擇合適。因素A、B、AC以及A2、B2、C2對(duì)結(jié)果影響極顯著(p<0.01),因素C對(duì)結(jié)果影響顯著(p<0.05),AB對(duì)結(jié)果影響不顯著(p>0.05),該數(shù)學(xué)模型F值反映出該方程在實(shí)驗(yàn)點(diǎn)與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合。失擬性檢驗(yàn)F值表明回歸方程擬合的較好,方程沒(méi)有失擬因素存在。同時(shí),軟件分析中R2為0.9909,變異系數(shù)為2.03%,說(shuō)明模型能夠反映真實(shí)情況。從因素分析可知,反應(yīng)條件對(duì)水解度影響大小排序?yàn)槊附鉁囟?酶添加量>酶解時(shí)間,這與蘇偉等[31]研究結(jié)果相似。
表5 方差分析結(jié)果Table 5 Variance analysis result
2.2.2 響應(yīng)曲面圖分析 圖6中酶解時(shí)間固定為4 h,可見(jiàn)酶解溫度軸上響應(yīng)面值更陡峭,可見(jiàn)酶解溫度因素比酶添加量因素對(duì)水解度影響大;圖7中酶解溫度固定為55 ℃,酶添加量較酶解時(shí)間的響應(yīng)面較陡峭,因此酶添加量較酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響更大;圖8酶添加量固定為300 U/g,可見(jiàn)酶解溫度軸上響應(yīng)面值較陡峭,所以酶解溫度因素比酶解時(shí)間因素對(duì)水解度影響大。從坡度上分析,圖7響應(yīng)面坡度大于圖6和圖8,說(shuō)明酶添加量和酶解時(shí)間對(duì)水解度影響較大。由此可見(jiàn),得出的結(jié)論與方差分析結(jié)果一樣。
圖6 酶添加量與酶解溫度對(duì)水解影響的等高線與響應(yīng)面Fig.6 Three-dimensional curved and contour plot for effect of enzyme dosage and enzymolysis temperature on degree of hydrolysis
圖7 酶添加量與酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響的等高線和響應(yīng)面Fig.7 Three-dimensional curved and contour plot for effect of enzyme dosage and enzymolysis time on degree of hydrolysis
圖8 酶解溫度與酶解時(shí)間對(duì)水解度影響的等高線與響應(yīng)面Fig.8 Three-dimensional curved and contour plot for effect of enzymolysis temperature and enzymolysis time on degree of hydrolysis
2.2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果 通過(guò)Design-Expert 8.0.6得到二次多項(xiàng)回歸方程,針對(duì)水解度取得最大值進(jìn)行條件優(yōu)選,得出在實(shí)驗(yàn)因素水平范圍內(nèi)預(yù)測(cè)金槍魚酶解液最佳工藝條件為,酶添加量312.04 U/g,酶解溫度56.26 ℃,酶解時(shí)間3.96 h,水解度預(yù)測(cè)值為27.4335%。結(jié)合實(shí)驗(yàn)的可行性,選取酶添加量300 U/g,酶解溫度56 ℃,酶解時(shí)間4 h,在最優(yōu)條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),實(shí)際測(cè)得的水解度為27.44%±0.04%,指標(biāo)獲得了相應(yīng)的提高且與理論值相差較小,因此模型設(shè)計(jì)合理。
酵母發(fā)酵除腥是指通過(guò)酵母的新陳代謝作用,去除水產(chǎn)品的腥味和異味。酵母粉去腥速度快并且徹底;酵母發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的中間代謝產(chǎn)物對(duì)腥味有掩蔽作用;適用于液態(tài)魚制品條件下使用[32]。本實(shí)驗(yàn)采用酵母發(fā)酵脫腥法,以腥味值為評(píng)價(jià)指標(biāo),對(duì)酵母發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、添加量這三個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化篩選。正交結(jié)果見(jiàn)表6。可以看出,脫腥效果為A>B>C,最佳脫腥的條件是發(fā)酵時(shí)間60 min,發(fā)酵溫度35 ℃,酵母添加量0.75%。由K值可以得出實(shí)驗(yàn)的最佳組合為A2B2C3。在酶解液最佳脫腥工藝下進(jìn)行正交驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),腥味值3次測(cè)定,分別為0.85、0.95、0.80,平均值為0.867,低于正交表中的任一數(shù)據(jù),說(shuō)明正交實(shí)驗(yàn)得到的酵母脫腥工藝優(yōu)化參數(shù)具有可靠性和適用性。
表6 酵母發(fā)酵脫腥正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 6 Results of orthogonal experiment of deodorization by yeast fermentation
由表7可知,經(jīng)過(guò)121 ℃/20 min高溫高壓殺菌條件的樣品,雖然殺菌時(shí)間較短,但溫度過(guò)高會(huì)影響其原有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和風(fēng)味[33],造成魚香味消失,也會(huì)使酶解液中的氨基酸、蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)受到破壞,組織結(jié)構(gòu)造成一定影響,口感下降。而90 ℃/30 min的巴氏殺菌條件使調(diào)味汁中產(chǎn)生了濃郁的魚香味,呈黃棕色、鮮亮有光澤,既達(dá)到商業(yè)無(wú)菌的目標(biāo),又極大的保留原有的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)成分,在此條件下,調(diào)味汁口感細(xì)膩,有魚鮮味。殺菌后,置于常溫條件下保存,由表8可知,兩種殺菌條件均可達(dá)到延長(zhǎng)保質(zhì)期的目的,殺菌效果良好,未檢出菌落總數(shù)和大腸菌群。結(jié)合感官評(píng)價(jià)和殺菌效果指標(biāo),兩種條件相比較,最終選擇90 ℃/30 min的殺菌條件,與張井等[33]研究結(jié)果相似。
表7 達(dá)到殺菌目標(biāo)的風(fēng)味海鮮調(diào)味汁感官評(píng)價(jià)Table 7 Results of sensory evaluation of flavor seafood sauce with desired sterilization effect
表8 不同殺菌條件殺菌效果的比較Table 8 Comparison of sterilization condition effects
經(jīng)檢驗(yàn)該調(diào)味汁呈流體狀、黃棕色、味道鮮美,魚香味濃郁,致病菌未檢出,產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)見(jiàn)表9。
表9 風(fēng)味海鮮調(diào)味汁質(zhì)量指標(biāo)分析Table 9 Analysis of quality index on flavor seafood sauce
本實(shí)驗(yàn)以水解度為指標(biāo),通過(guò)響應(yīng)面法得到金槍魚蒸煮液的最佳酶解方式為:在56 ℃、添加量為300 U/g條件下酶解4 h,此時(shí)水解度為27.44%±0.04%。利用正交實(shí)驗(yàn)得到最佳脫腥參數(shù)組合為酵母0.75%、發(fā)酵溫度35 ℃、發(fā)酵60 min,在90 ℃條件下巴氏殺菌30 min,最終得到金槍魚風(fēng)味海鮮調(diào)味汁口感較佳,有魚鮮味,風(fēng)味宜人。本文為金槍魚蒸煮液的高值化利用提供了理論依據(jù)。
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