壓力水平及氯化鈉濃度對(duì)兔肌球蛋白 凝膠保水性及其膠凝過程中 理化特性和結(jié)構(gòu)變化的影響

錢 暢,薛思雯,徐幸蓮,周光宏

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物健康與食品安全國際實(shí)驗(yàn)室，肉品加工與質(zhì)量控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，肉品加工農(nóng)業(yè)部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，國家肉品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心,江蘇南京 210095)

超高壓加工(High-pressure processing,HPP)技術(shù)作為近幾十年興起的非熱加工技術(shù)之一,已廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)。較傳統(tǒng)技術(shù)而言,其滅菌鈍酶效果更好,還可以最大程度地保持產(chǎn)品的風(fēng)味與色澤[1]。隨著近年來相關(guān)研究的不斷深入,人們發(fā)現(xiàn)HPP對(duì)蛋白還存在修飾作用,可以改變蛋白分子的空間構(gòu)象并引起其理化特性的變化。而畜禽肉作為高蛋白食品,在合適的參數(shù)下對(duì)其進(jìn)行高壓處理能夠顯著改善產(chǎn)品的保水性和質(zhì)構(gòu)等凝膠特性[2-3]。其中最主要且唯一能成膠的肌球蛋白在此過程中的重要性不言而喻[4]。有研究[5]顯示在非變性溫度下對(duì)肌球蛋白進(jìn)行高壓處理有利于其進(jìn)一步變性與聚集,但同時(shí)參數(shù)上的細(xì)微變化也會(huì)對(duì)形成的凝膠的功能特性產(chǎn)生顯著影響,Xue等[6]的研究顯示300 MPa的高壓處理會(huì)使肌球蛋白過度變性,Iwasaki等[7]也發(fā)現(xiàn)200 MPa以上的高壓處理會(huì)壓縮肌球蛋白分子的體積,導(dǎo)致凝膠強(qiáng)度和表面彈性下降。因此研究高壓處理對(duì)肌球蛋白的影響將有助于該技術(shù)在肉品加工領(lǐng)域的合理應(yīng)用。

凝膠類肉制品中的食鹽除調(diào)味防腐外,主要起促進(jìn)蛋白溶解的作用。但過量攝入食鹽會(huì)誘發(fā)高血壓和多種心血管疾病[8],因此如何有效降低肉制品中的食鹽添加量成了目前行業(yè)亟需解決的問題之一。許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)高壓處理可以在不改變或提高蛋白的功能特性的前提下,減少氯化鈉或磷酸鹽的添加量,即高壓可以促進(jìn)肌原纖維的斷裂與蛋白的溶解,改變其分子空間構(gòu)象并促進(jìn)交聯(lián)[9-10]。然而在非變性溫度下經(jīng)高壓處理后的蛋白在后續(xù)升溫過程中理化特性的變化尚不清晰,且該條件下氯化鈉濃度對(duì)蛋白的影響也鮮有研究。

本文通過研究不同氯化鈉濃度的兔肉肌球蛋白在非變性溫度下經(jīng)高壓處理后,在后續(xù)升溫過程中理化特性與凝膠保水性的變化,確定較優(yōu)的壓力水平與氯化鈉濃度,探討其機(jī)理變化,從而為低鹽功能性凝膠肉制品的開發(fā)及相關(guān)企業(yè)更好地利用HPP技術(shù)提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

3月齡新西蘭白兔(2.5～3.0 kg) 江蘇省農(nóng)科院畜牧所;腺苷-5′-三磷酸二鈉鹽(ATP)純度≥99%,二硫蘇糖醇(DTT)純度≥99.5% 美國Sigma公司;氯化鈉、焦磷酸鈉、三聚磷酸鈉、氯化鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、戊二醛(25%)、無水乙醇、叔丁醇等均為分析純 南京化學(xué)試劑有限公司;5,5-二硫代雙(DTNB)、8-苯胺基-1-萘磺酸(ANS)等均為分析純 上海阿拉丁公司。

Waring高速組織搗碎機(jī) 美國思伯明設(shè)備有限公司;Ultra Turrax T25高速勻漿器 德國IKA公司;Avanti J-E高速冷凍離心機(jī) 美國貝克曼有限公司;MicroMR微型核磁共振成像儀 上海紐邁電子有限公司;S-3000N掃描電鏡 日本日立公司;MCR 301流變儀 奧地利Physica公司;Spectra Max M2酶標(biāo)儀 美國分子設(shè)備有限公司;圓二色譜儀 英國Applied Physics有限公司;聚乙烯真空包裝袋 20 ℃透氧率為1 cm3/(m2·h)，南京瑞翼特生物科技有限公司;S-IL-100-850-9-W高壓設(shè)備 英國Stansted Fluid Power公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 肌球蛋白的提取 健康的新西蘭雄性白兔,宰前提供飲水和充分休息,減少應(yīng)激。

機(jī)械擊昏后切斷頸部血管放血,迅速剝皮,去頭,爪及內(nèi)臟,自來水沖洗去除血跡。瀝干后放入冰箱(4 ℃)15 min后取腰大肌并剔除可見脂肪及結(jié)締組織,切碎稱重。參照Cao等[11]的操作于0～4 ℃下提取肌球蛋白,用雙縮脲法檢測肌球蛋白濃度。最后用不同濃度的氯化鈉溶液(m/m,1.0%、1.5%、2.0%)將蛋白濃度調(diào)至20 mg/mL,并在相應(yīng)濃度的氯化鈉溶液中透析(20 h),期間每7 h更換1次透析液,共換3次。

1.2.2 高壓處理及肌球蛋白凝膠制備過程 將透析后的肌球蛋白溶液轉(zhuǎn)移至真空包裝袋中并封裝(每袋約50 g,去除氣泡),置于超高壓腔體中,在壓力100、200和300 MPa下保壓9 min,腔體溫度為25 ℃,分別取高壓處理后的肌球蛋白溶液于10 mL離心管、10 mL玻璃燒杯及玻璃小管(直徑15 mm)中,并置于水浴鍋中從20 ℃程序升溫(1 ℃/min)至85 ℃,保溫20 min。將凝膠置于0～4 ℃下過夜(12 h)。進(jìn)行保水性,水分分布及凝膠微觀結(jié)構(gòu)的測試。

1.2.3 保水性測試 保水性參照Kocher等[12]的方法,并做適當(dāng)改動(dòng)。準(zhǔn)確稱量加入蛋白溶液前的離心管重量(W1)及加入蛋白溶液后的總重(W2)。凝膠制備完成后將離心管兩兩配平,經(jīng)8000×g(4 ℃)離心10 min后取出去除水分,準(zhǔn)確稱量余下重量(W3)。

保水性(%)=(W3-W1)/(W2-W1)×100

1.2.4 NMR自旋-自旋弛豫時(shí)間(T2)測試 低場核磁測量參照Han等[13]的方法,并略做改動(dòng)。測試條件為:質(zhì)子共振頻率為22.6 MHz,測量溫度為 32 ℃。取2 g凝膠樣品(15 mm玻璃小管中)放入核磁管再置于分析儀中。用Carr-Purcell-Mebiboom-Gill(CPMG)序列進(jìn)行測量。所使用τ值為350 μs,重復(fù)掃描32次,間隔時(shí)間為7000 ms,得到12000個(gè)回波峰點(diǎn)數(shù)。利用儀器自帶的Multi Exp Inv Analysis軟件進(jìn)行反演,得到T2值及對(duì)應(yīng)的峰面積所占的比例(PT2)。

1.2.5 掃描電鏡測試 測試用凝膠樣品的準(zhǔn)備參照徐幸蓮等[14]的方法,用4%的戊二醛溶液(由25%的戊二醛溶液用相應(yīng)濃度的氯化鈉溶液稀釋而得,v/v)固定48 h,用雙面刀片切成均勻小塊(3 mm×3 mm×2 mm),再用不同濃度的乙醇(50%、70%、90%、95%、100%)進(jìn)行梯度脫水,放入叔丁醇中置換3次,每次30 min,再將其冷凍干燥并噴金(10 nm)。后利用掃描電鏡進(jìn)行觀察,加速電壓為10 kV,每個(gè)樣品觀察8個(gè)區(qū)域。

1.2.6 流變特性測定 流變特性的測定參照Chen等[15]的方法,將肌球蛋白溶液用相應(yīng)濃度的氯化鈉溶液稀釋至5 mg/mL。儀器采用平行板(上板直徑50 mm),參數(shù)設(shè)置如下:頻率為0.1 Hz,應(yīng)變?yōu)?.01,狹縫為0.5 mm,升溫條件從20～80 ℃(1 ℃/min),記錄G′(貯能模量)的變化情況。

1.2.7 表面疏水性測定 參照Chen等[15]的方法并做適當(dāng)修改,以ANS為熒光探針測定蛋白升溫過程中的表面疏水性變化。將蛋白溶液用相應(yīng)濃度的氯化鈉溶液稀釋至1 mg/mL,各取4 mL 稀釋蛋白液加入10 mL離心管中,每組處理含15個(gè)樣品,用于25、40、55、70、85 ℃下的表面疏水性測定。將樣品置于水浴鍋中,從20～85 ℃程序升溫(1 ℃/min),并在五個(gè)特定溫度下保溫5 min,后將對(duì)應(yīng)的樣品取出冰浴,防止溫度對(duì)蛋白的進(jìn)一步影響。向冷卻后的蛋白液中加入20 μL ANS溶液(15 mmol/L 溶解于0.1 mol/L 磷酸鉀緩沖液,pH7.0)。室溫下反應(yīng)20 min后使用酶標(biāo)儀檢測激發(fā)波長為375 nm,發(fā)射波長為470 nm條件下的熒光強(qiáng)度。

1.2.8 活性巰基含量測定 參照Ellman[16]的方法并做適當(dāng)修改,利用DTNB測定蛋白升溫過程中的活性巰基含量變化,蛋白溶液樣品準(zhǔn)備及升溫過程同表面疏水性測定。向冷卻后的蛋白液中加入20 μL DTNB溶液(10 mmol/L 溶解于0.1 mol/L 磷酸鉀緩沖液,pH7.0)?；靹蚝笤诎堤幏磻?yīng)1 h(4 ℃),取上清液并用酶標(biāo)儀測定其在412 nm處的吸光值,并按以下公式計(jì)算蛋白中活性巰基的含量。

活性巰基含量C0(μmol/100 mg)=[(A/ε)·D]/C

其中:C0-巰基的摩爾濃度(μmol/100 mg);A-吸光值;ε-吸光系數(shù)13600 L×(mol×cm)-1;D-稀釋倍數(shù);C-肌球蛋白濃度(mg/mL)。

1.2.9 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)測定 參照薛思雯等[17]的方法,測定蛋白質(zhì)在升溫過程中二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。將蛋白溶液用相應(yīng)的氯化鈉溶液稀釋至0.3 mg/mL,在200～260 nm波長下測量分子橢圓率,采用20～90 ℃程序升溫(1 ℃/min),計(jì)算25、40、55、70、85 ℃下肌球蛋白分子二級(jí)結(jié)構(gòu)(α-螺旋,β-折疊,β-轉(zhuǎn)角以及無規(guī)則卷曲)的含量,并以百分?jǐn)?shù)形式表示。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)采用3×3雙因素完全隨機(jī)設(shè)計(jì),壓力水平和氯化鈉濃度兩個(gè)因素各設(shè)3個(gè)水平,以含2%氯化鈉的未經(jīng)高壓處理的肌球蛋白作為對(duì)照。保水性、T2弛豫時(shí)間、表面疏水性以及活性巰基含量等指標(biāo)的測量均重復(fù)三次,其結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。結(jié)果用SAS V8統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,壓力水平及氯化鈉濃度對(duì)其余變量的主效應(yīng)和互作效應(yīng)采用混合模型方差分析,最小二乘均數(shù)間的成對(duì)差異用多重比較(Bonferroni t-test)進(jìn)行事后檢驗(yàn),當(dāng)p<0.05時(shí)表示差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 壓力水平、氯化鈉濃度及兩者間的交互作用情況

壓力水平、氯化鈉濃度及兩者間的交互作用對(duì)經(jīng)高壓處理的兔骨骼肌肌球蛋白升溫過程中的三級(jí)結(jié)構(gòu)以及形成熱凝膠的水分特征(凝膠保水性、凝膠中水分的弛豫時(shí)間和峰面積占比、五個(gè)特定溫度下的蛋白表面疏水性和活性巰基含量)的影響差異性情況分析見表1。由表1可知,壓力水平、氯化鈉濃度以及兩者間的交互作用對(duì)除了凝膠中結(jié)合水的T2弛豫時(shí)間的峰面積占比(PT2b)以外的其他指標(biāo)均有極顯著影響(p<0.01),對(duì)PT2b則有顯著影響(p<0.05)。這與Villamonte等學(xué)者的研究結(jié)果[18]相似,說明壓力水平和體系中氯化鈉濃度的變化均會(huì)改變高壓肌球蛋白的結(jié)構(gòu),影響其在加熱過程中形成的凝膠基質(zhì)中的水分分布,從而導(dǎo)致最終凝膠保水性的變化。而作為緊密結(jié)合在蛋白親水基團(tuán)上的最內(nèi)層水分[19],結(jié)合水的含量在此過程中的變化幅度或許小于另外兩種水分,且其占比較低。因此主效應(yīng)及其交互作用對(duì)PT2b的影響的顯著性水平相對(duì)較高。

表1 壓力水平、氯化鈉濃度及其交互作用對(duì)經(jīng)高壓處理的 兔骨骼肌肌球蛋白升溫過程中的三級(jí)結(jié)構(gòu)以及形成熱凝膠的水分特征的影響Table 1 Effects of pressure levels,sodium chloride content and their interaction on the tertiary structures of rabbit myosin and water characteristics of formed gel during heating

2.2 保水性

圖1顯示的是壓力水平和氯化鈉濃度對(duì)高壓肌球蛋白凝膠保水性的影響情況。從圖1可以看出,經(jīng)100或200 MPa 高壓處理的蛋白經(jīng)加熱后形成的凝膠的保水性較對(duì)照組有顯著提升(p<0.05),而在300 MPa下,凝膠的保水性則顯著下降(p<0.05)。這與曹瑩瑩等[20]的發(fā)現(xiàn)相一致。蛋白凝膠的保水性與蛋白在體系中的溶解情況,蛋白與水之間的作用力以及形成的凝膠三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)等因素息息相關(guān)[13]。有研究顯示,適當(dāng)?shù)母邏禾幚砜梢愿淖兊鞍卓臻g構(gòu)象,重排分子間相互作用并強(qiáng)化基團(tuán)的親水性,使蛋白與水的結(jié)合能力增強(qiáng),加熱后形成的致密凝膠基質(zhì)也會(huì)容納更多的水分子[21]。而過高的壓力則會(huì)使蛋白過度變性,導(dǎo)致其溶解度下降,從而影響蛋白的成膠能力及形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),其保水性也隨之變差[6]。

圖1 氯化鈉含量不同的肌球蛋白在不同壓力水平下經(jīng)處理后加熱形成的凝膠保水性的變化Fig.1 Changes in water holding capacity of heat-induced gels formed by myosin with various sodium chloride contents after pressurized under different levels注:不同小寫字母表示同一指標(biāo)不同處理間有 顯著性差異(p<0.05),相同小寫字母表示同一指標(biāo) 不同處理間無顯著性差異(p>0.05)。

肌球蛋白作為一種鹽溶蛋白,體系中氯化鈉濃度的升高不僅可以促進(jìn)其溶解,更能通過增強(qiáng)分子間靜電斥力的方式加劇其解折疊及結(jié)構(gòu)的擴(kuò)張,從而提高其熱誘導(dǎo)凝膠的保水性[22]。但在本研究中,100及200 MPa處理組的蛋白凝膠的保水性隨氯化鈉濃度的升高無顯著變化(p>0.05)。這可能是經(jīng)高壓修飾的肌球蛋白的性質(zhì)發(fā)生變化所致。肌球蛋白在氯化鈉濃度達(dá)到2% 或以上的溶液體系中一般可完全溶解[23],但100或200 MPa的高壓處理已使蛋白的空間構(gòu)象發(fā)生變化,蛋白-蛋白,蛋白-水之間的相互作用也發(fā)生了改變,因此推測蛋白在氯化鈉濃度為1%的體系中已可完全溶解。此時(shí)氯化鈉濃度的升高并不會(huì)促進(jìn)蛋白的溶解,故凝膠的保水性基本不變。而在300 MPa下,隨著氯化鈉濃度的升高,蛋白凝膠的保水性又呈上升趨勢。這可能是由于離子強(qiáng)度的提高使因過度變性而下降的蛋白溶解度再次升高[24],且增大了蛋白分子間的距離,加熱后形成的凝膠結(jié)構(gòu)擴(kuò)張并包裹住更多的水分[25],凝膠的保水性也隨之升高。

2.3 低場NMR T2弛豫時(shí)間

作為一種快速無損檢測技術(shù),低場核磁共振(low-field NMR)可以通過觀察水分中氫質(zhì)子的流動(dòng)與分布,探測凝膠結(jié)構(gòu)中的水分動(dòng)態(tài)分布情況[26]。通過對(duì)CPMG序列得到的衰減曲線進(jìn)行多指數(shù)擬合,發(fā)現(xiàn)蛋白凝膠中水分的T2弛豫時(shí)間在1～10000 ms內(nèi)存在3個(gè)峰,按照其值的大小可能分別對(duì)應(yīng)結(jié)合水(T2b)、不易流動(dòng)水(T21)以及自由水(T22),而對(duì)應(yīng)的指數(shù)分布PT2b、PT21、PT22則分別代表著它們所占的比例。從圖2可以看出,與其他處理組相比,經(jīng)300 MPa處理后的蛋白形成的凝膠中水分的T2b、T21和T22值均顯著上升(p<0.05),說明凝膠中保持水分的毛細(xì)作用力減弱了[13],這可能是由于該壓力水平下蛋白凝膠結(jié)構(gòu)的孔徑增大了,導(dǎo)致其束縛水分的能力下降[27]。但相應(yīng)地,孔徑的增大也會(huì)使凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中可以容納的水分更多。Xue等人[28]的研究顯示過高的壓力水平會(huì)影響蛋白形成的凝膠結(jié)構(gòu),從而使不易流動(dòng)水向自由水轉(zhuǎn)化,PT21的顯著下降以及PT22的上升(p<0.05)也證實(shí)了這點(diǎn)。有研究[29]顯示PT21的大小與凝膠保水性間存在高度相關(guān)性,這也部分解釋了300 MPa下保水性的下降。

圖2 氯化鈉含量不同的肌球蛋白在不同壓力水平下經(jīng)處理后加熱形成的凝膠中水分弛豫時(shí)間的變化Fig.2 Changes in water relaxation time of heat-induced gels formed by myosin with various sodium chloride contents after pressurized under different levels注:不同小寫字母表示同一指標(biāo)不同處理間 顯著性差異(p<0.05),圖3、圖6～圖8同。其中100-1% 代表經(jīng)100 MPa高壓處理的含1%氯化鈉的蛋白處理組，以此類推。其他圖標(biāo)涉及處類同。

在100或200 MPa下,含1% 或1.5% 氯化鈉的蛋白形成的凝膠的T21值顯著低于對(duì)照組(p<0.05),而T22值呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢,說明此時(shí)壓力和氯化鈉濃度的交互作用會(huì)使凝膠結(jié)構(gòu)的束水能力得到提升。但當(dāng)氯化鈉濃度升高到2%時(shí),T21和T22值均顯著增大(p<0.05),這可能是由于體系離子強(qiáng)度的變化影響了蛋白的結(jié)構(gòu)及分子間的相互作用,帶電基團(tuán)的數(shù)目和分布也隨之改變,導(dǎo)致水分子所受的斥力變大,不易流動(dòng)水和自由水的流動(dòng)性也增強(qiáng)了。

圖3 氯化鈉含量不同的肌球蛋白在不同壓力水平下經(jīng)處理后加熱形成的凝膠中水分峰面積占比的變化Fig.3 Changes in peak areas of heat-induced gels formed by myosin with various sodium chloride contents after pressurized under different levels

但同時(shí)PT21卻顯著降低而PT22則隨之升高(p<0.05),說明此時(shí)存在著由自由水向不易流動(dòng)水的遷移,這也許在一定程度上彌補(bǔ)了流動(dòng)性增強(qiáng)可能帶來的水分損失,故保水性沒有發(fā)生顯著變化。

2.4 凝膠微觀結(jié)構(gòu)

凝膠功能特性的優(yōu)劣受其微觀結(jié)構(gòu)的影響較大,對(duì)凝膠三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),孔洞大小以及蛋白的交聯(lián)特性的分析有助于對(duì)凝膠形成過程的研究[13]。圖4是利用掃描電鏡觀察的經(jīng)高壓處理后的肌球蛋白溶液加熱形成的凝膠的微觀結(jié)構(gòu),可以看出,對(duì)照組的蛋白形成的凝膠表面較粗糙,多有不規(guī)則或斷裂的細(xì)絲,且蛋白聚集分布不均,這可能與肌球蛋白不能完全溶解有關(guān)。而經(jīng)100 MPa 高壓處理后的凝膠由許多有序的絲狀鏈接組成,具有連續(xù)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),其表面較光滑,孔洞的大小及分布也較為均勻。在200 MPa下,這些細(xì)絲的聚集程度加強(qiáng)了,但凝膠的多孔性卻有所下降,這與Wang等[30]觀察到的相一致,可能是由于蛋白間的相互作用加強(qiáng)所致。當(dāng)壓力水平升高到300 MPa時(shí),原本致密均一的絲狀結(jié)構(gòu)消失了,取而代之的是由蛋白球狀聚集體組成的無序結(jié)構(gòu),其孔洞形狀不規(guī)則且大小不一。Van等[31]的研究顯示此時(shí)蛋白側(cè)鏈基團(tuán)的活性增加,疏水作用和巰基的增強(qiáng)促進(jìn)了更多分子內(nèi)交聯(lián)的形成,加速了蛋白的聚集并導(dǎo)致蛋白與水間相互作用的減弱。因此凝膠的保水性降低。

圖4 氯化鈉含量不同的肌球蛋白在不同壓力水平下經(jīng)處理后加熱形成的凝膠微觀結(jié)構(gòu)的變化Fig.4 Changes in microstructure of heat-induced gels formed by myosin with various sodium chloride contents after pressurized under different levels注:A:對(duì)照;B:100-1%;C:100-1.5%;D:100-2%;E:200-1%;F:200-1.5%;G:200-2%;H:300-1%;I:300-1.5%;J:300-2%。

除了壓力水平,氯化鈉濃度的變化同樣也會(huì)使經(jīng)高壓處理的蛋白加熱后形成的凝膠的微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。在100 MPa下,當(dāng)氯化鈉濃度從1%升高到1.5%時(shí),凝膠中的絲狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)消失,其表面出現(xiàn)層狀分布的蛋白聚集。隨著氯化鈉濃度進(jìn)一步升高到2%,蛋白聚集的程度不斷加劇,并開始形成立體結(jié)構(gòu)。200 MPa各處理組的情況與100 MPa各組相似,但含2%氯化鈉的蛋白經(jīng)加熱后形成的凝膠是由均勻顆粒交聯(lián)形成的三維網(wǎng)絡(luò),其凝膠結(jié)構(gòu)致密有序,多孔性好。經(jīng)300 MPa處理的含2%氯化鈉的凝膠表面出現(xiàn)層狀聚集,且小孔的分布更為均勻,這也導(dǎo)致了其保水性的上升。肌球蛋白在離子強(qiáng)度不同的環(huán)境下會(huì)形成完全不同的凝膠結(jié)構(gòu),低離子強(qiáng)度(0.25 mol/L)下會(huì)形成細(xì)絲網(wǎng)狀三維凝膠結(jié)構(gòu),而在高離子強(qiáng)度(0.6 mol/L)下由于鹽溶效應(yīng),纖絲會(huì)解離成單體,最終形成球狀顆粒凝聚的凝膠立體結(jié)構(gòu)[14]。這在經(jīng)高壓處理的肌球蛋白體系中依然存在,但由于高壓處理的促溶作用,這種變化所需的離子強(qiáng)度也許降低了,且隨著壓力水平的變化而變化,但添加適量的鹽使蛋白完全溶出仍是肌球蛋白在超高壓條件下形成較好凝膠的必要條件[32]。

2.5 蛋白流變特性

蛋白在加熱過程中的流變特性變化可以較全面的反映其在逐步變性與成膠過程中的狀態(tài)[33]。圖5是經(jīng)高壓處理后的肌球蛋白溶液(5 mg/mL)在20～80 ℃條件下的貯能模量(G′)的變化情況?？梢钥闯?經(jīng)100 MPa處理后的蛋白的貯能模量在40～55 ℃的升溫區(qū)間內(nèi)的增長幅度顯著高于對(duì)照組,且其頭部變性峰的峰值與最終的G′值也較高,說明100 MPa的高壓處理能夠促進(jìn)蛋白在初始加熱階段的頭-頭交聯(lián)并有助于最終凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成。隨著壓力水平升高到200 MPa,蛋白頭部變性峰的峰值與峰值出現(xiàn)的溫度均有所降低,這說明蛋白頭部的聚集能力有了一定程度的下降且蛋白尾部的熱敏性上升,有研究顯示蛋白在弱凝膠形成階段(43～57 ℃)頭部聚集能力的適當(dāng)下降有利于后續(xù)升溫過程中的尾-尾交聯(lián)[30]。而尾部熱敏性的提高也會(huì)促進(jìn)其在加熱過程的展開與進(jìn)一步交聯(lián),這也許是200-1%組的蛋白的最終G′值高于100-1%組的原因之一。300 MPa各處理組的蛋白在升溫過程中未表現(xiàn)出弱凝膠形成階段,且300-1%組的蛋白在加熱前的初始G′值最高,可能是由于之前的高壓處理已經(jīng)使蛋白變性并產(chǎn)生了一定程度的聚集與交聯(lián)[34],而蛋白的過早聚集也導(dǎo)致其在后續(xù)升溫過程中貯能模量的變化幅度較低,不能形成彈性良好的凝膠。

圖5 不同氯化鈉含量的肌球蛋白在不同壓力水平下經(jīng)處理后在加熱過程中貯能模量的變化Fig.5 Changes in storage modulus of myosin with various sodium chloride contents after pressurized under different levels during heating

氯化鈉濃度為1%的各處理組蛋白的貯能模量在頭部變性峰出現(xiàn)后開始降低,這主要是由于肌球蛋白的尾部變性展開,形成的弱凝膠結(jié)構(gòu)被破壞[35]。有學(xué)者認(rèn)為此時(shí)蛋白分子間相互作用的減弱會(huì)促進(jìn)肌球蛋白聚集前的展開,從而有助于之后升溫過程中的蛋白交聯(lián)與凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成[6]。但隨著氯化鈉濃度的升高,這一過程消失了,這可能是由于離子強(qiáng)度的變化影響了蛋白間的相互作用,蛋白尾部的變性以及構(gòu)象的變化被抑制,包埋基團(tuán)的暴露程度降低,蛋白分子內(nèi)或分子間的疏水作用和二硫鍵減少,從而導(dǎo)致蛋白交聯(lián)減少減弱以及最終貯能模量的下降。前人的研究[14]也顯示蛋白在低離子強(qiáng)度下的絲狀結(jié)構(gòu)可能更利于交聯(lián)的形成,故最終形成的凝膠結(jié)構(gòu)更為有序。因此,經(jīng)100或200 MPa處理的蛋白在1%的氯化鈉濃度下形成的凝膠性質(zhì)更為穩(wěn)定,且黏彈特性優(yōu)于其它處理組。

2.6 表面疏水性

疏水作用對(duì)維持蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定及蛋白凝膠的形成具有重要作用[36],利用ANS探針的熒光特性,可以測定疏水基團(tuán)的暴露程度,從而研究蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化[37]。從圖6中可以看出,經(jīng)高壓處理后的蛋白的表面疏水性顯著升高(p<0.05),且隨著壓力水平的增大而增大。這與文獻(xiàn)報(bào)道[11,30]相一致,可能是因?yàn)楦邏禾幚泶龠M(jìn)了蛋白結(jié)構(gòu)的解折疊,導(dǎo)致包埋的疏水基團(tuán)暴露,或是蛋白結(jié)構(gòu)的打開使ANS探針得以與蛋白的疏水內(nèi)核相結(jié)合[38]。氯化鈉的加入同樣會(huì)對(duì)蛋白的原始構(gòu)象產(chǎn)生影響,同一壓力水平下氯化鈉濃度越高,蛋白的構(gòu)象變化越劇烈,表面疏水性也越高(p<0.05)。

圖6 氯化鈉含量不同的肌球蛋白在不同壓力水平下經(jīng)處理后在加熱過程中表面疏水性的變化Fig.6 Changes in surface hydrophobicity of myosin with various sodium chloride contents after pressurized under different levels during heating

隨著溫度的升高,各處理組蛋白的疏水作用在40 ℃前均有輕微的上升,可能是因?yàn)樵诘蜏貭顟B(tài)下大多數(shù)的疏水基團(tuán)還包埋在蛋白的內(nèi)部[39],故上升幅度不大。而在40～55 ℃的升溫區(qū)間內(nèi)則呈現(xiàn)大幅增長,說明此時(shí)蛋白表面有大量的疏水基團(tuán)被暴露,促進(jìn)其進(jìn)一步聚集與交聯(lián)[40],其中以200-1%處理組的蛋白的熒光強(qiáng)度的上升速率最高(37.5 a.u./℃)而100-1%處理組的其次(31.1 a.u./℃),Xue的研究[6]顯示在40～55 ℃間較高的疏水基團(tuán)暴露速率可能是獲得保水性較高的凝膠的關(guān)鍵,這可能是因?yàn)楫?dāng)?shù)鞍椎淖冃运俾矢哂谄渚奂俾蕰r(shí),蛋白分子結(jié)構(gòu)得以充分解折疊與相互作用,從而形成均一有序的凝膠結(jié)構(gòu)[41]。300-2%處理組的疏水作用在整個(gè)升溫過程中均顯著高于其他處理組(p<0.05),但疏水基團(tuán)的過度暴露可能反而會(huì)使凝膠過程中的作用力失衡,不利于水分子與蛋白的結(jié)合,從而導(dǎo)致保水性的下降[17]。

2.7 活性巰基含量

作為肌球蛋白中的強(qiáng)還原性基團(tuán)之一,巰基能夠維持蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定,且對(duì)蛋白的功能特性具有重要影響[42]。圖7的結(jié)果顯示,壓力水平及氯化鈉濃度的升高均使經(jīng)高壓處理后的蛋白中活性巰基的含量增大(p<0.05)。這與疏水作用的變化相似,說明高壓處理可以通過改變蛋白的分子構(gòu)象使頭部包埋的巰基基團(tuán)暴露并活化[15],而離子強(qiáng)度的升高會(huì)加速這一構(gòu)象變化。在加熱過程中,除300 MPa各處理組外,其余處理組的活性巰基含量在40～55 ℃時(shí)均大幅上升,其中100-1%處理組的變化速率最快(21.76 μmol·100 mg-1/℃),說明此時(shí)蛋白的解折疊程度較高,其空間結(jié)構(gòu)變化劇烈,大量的巰基基團(tuán)被暴露,而疏水作用的同時(shí)增強(qiáng)會(huì)縮短分子間巰基的距離,加速二硫鍵的形成[43],從而促進(jìn)蛋白的聚集。有研究顯示蛋白在加熱過程中包埋基團(tuán)的快速暴露有助于對(duì)水分子的吸引和成膠階段的包裹[6],這也與其較高的保水相一致。300 MPa各處理組的活性巰基含量變化幅度較小,這可能是因?yàn)榧訜崆暗鞍滓研纬梢欢ǔ潭鹊木奂?阻礙了基團(tuán)的進(jìn)一步暴露[28]。蛋白的熱變性程度與聚集能力也因此下降了。

圖7 氯化鈉含量不同的肌球蛋白在不同壓力水平下經(jīng)處理后在加熱過程中活性巰基含量的變化Fig.7 Changes in reactive sulfhydryl groups content of myosin with various sodium chloride contents after pressurized under different levels during heating

70 ℃后,含1% NaCl的各處理組蛋白的活性巰基含量均呈現(xiàn)下降趨勢,說明此時(shí)已不再發(fā)生巰基的暴露參與作用,而已暴露的活性巰基也逐漸轉(zhuǎn)化為二硫鍵參與凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成[39],而其他處理組蛋白的活性巰基含量則基本保持不變甚至略有上升。故推斷隨著氯化鈉濃度的升高,最終形成的蛋白凝膠中二硫鍵參與的比例有所降低,蛋白的交聯(lián)程度下降,這也部分解釋了含1% NaCl處理組蛋白的形成凝膠的流變特性優(yōu)于同一壓力水平下其他處理組的原因。

2.8 二級(jí)結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化常會(huì)引起其功能特性的改變[44],利用圓二色譜技術(shù)可以較為準(zhǔn)確的估算這種變化。圖8是不同氯化鈉濃度條件下的高壓處理蛋白在加熱過程中二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化?？梢钥闯?在加熱前(25 ℃),經(jīng)高壓處理后的肌球蛋白中α-螺旋結(jié)構(gòu)的比例顯著低于對(duì)照組,且隨著壓力水平的升高而不斷降低,而β-折疊的比例則不斷升高。氫鍵和靜電作用是維持蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的主要作用力[45],這種變化可能是由于高壓處理使得分子內(nèi)氫鍵減弱而分子間氫鍵增強(qiáng)所引起[21,43]。而在同一壓力水平下隨著氯化鈉濃度的升高,α-螺旋結(jié)構(gòu)的初始比例也不斷增大,也許是離子強(qiáng)度變化引起的分子間靜電作用改變所致。

圖8 氯化鈉含量不同的肌球蛋白在不同壓力水平下經(jīng)處理后在加熱過程中二級(jí)結(jié)構(gòu)比例的變化Fig.8 Changes in secondary structures proportion of myosin with various sodium chloride contents after pressurized under different levels during heating注：a:Control;b:100-1%;c:100-1.5%;d:100-2%;e:200-1%;f:200-1.5%;g:200-2%;h:300-1%;i:300-1.5%;j:300-2%。

有研究顯示,加熱前蛋白中α-螺旋結(jié)構(gòu)的比例越高,加熱后β-折疊結(jié)構(gòu)的比例越高,則形成的凝膠的保水性也越好[46-47],其中的原因包括蛋白質(zhì)分子折疊時(shí)與呈α-螺旋狀相比擁有更多容納水分的空隙[32]。但在本研究中100和200 MPa各處理組的蛋白在加熱前α-螺旋的比例均低于對(duì)照組,最終形成的凝膠的保水性卻有提高,這主要是因?yàn)榻?jīng)高壓處理后的蛋白結(jié)構(gòu)被打開,蛋白分子間距離增加,使更多的水分子可以穿透進(jìn)入并保留在凝膠的網(wǎng)孔中,凝膠的保水性也得到提升[25]。

隨著溫度的升高,各處理組蛋白中的α-螺旋結(jié)構(gòu)的比例開始減少而β-折疊及無規(guī)則卷曲的比例隨之增加。在40～55 ℃的升溫區(qū)間內(nèi),100-1%處理組蛋白的α-螺旋比例下降速度最快而200-1%處理組其次,說明此時(shí)蛋白尾部的解折疊程度較高,包埋基團(tuán)的暴露速度也較快,這與疏水作用和活性巰基的變化情況相符,疏水作用的增強(qiáng)和二硫鍵的形成也有利于蛋白的進(jìn)一步聚集與交聯(lián)。而經(jīng)同等壓力水平處理的含1.5%或2%氯化鈉的蛋白雖然呈現(xiàn)相似的構(gòu)象變化趨勢,但幅度減小,說明在加熱過程中蛋白解折疊的程度減弱了,這種變性方式和速率上的不同最終導(dǎo)致了形成的蛋白凝膠功能特性上的變化[6,45]。300 MPa各處理組的蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)在升溫過程中的變化幅度較小,最終α-螺旋結(jié)構(gòu)的比例也較高。說明蛋白尾部的解折疊能力被抑制了。Wang等[30]認(rèn)為經(jīng)高壓處理的蛋白分子間的氫鍵隨著壓力水平(大于200 MPa)的升高不斷變?nèi)?使蛋白與水間相互作用減小,故最終形成凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)較弱,保水性也較差。

3 結(jié)論

含1%氯化鈉的兔肉肌球蛋白經(jīng)100或200 MPa的高壓處理(9 min,25 ℃)后,在升溫過程中充分解折疊,包埋的疏水基團(tuán)和巰基快速暴露,促進(jìn)了蛋白的聚集與交聯(lián)。最終形成具有均勻網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),保水性好的凝膠。而氯化鈉濃度的增大會(huì)改變蛋白的熱變性速率,降低其解折疊程度;壓力水平的升高則會(huì)使蛋白在加熱前過度變性,這些均不利于其形成良好的熱凝膠。因此,1%的氯化鈉濃度是經(jīng)200 MPa及以下高壓處理的兔肉肌球蛋白形成良好凝膠的最適濃度。該研究結(jié)果可為利用超高壓技術(shù)生產(chǎn)低鈉鹽肉制品提供參考。

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