高效液相色譜法測(cè)定米酒中有機(jī)酸的含量

楊成聰，沈馨，馬雪偉，楊夢(mèng)麗，董蘊(yùn)，郭壯，*

（1.湖北文理學(xué)院食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北襄陽(yáng)441053；2.襄陽(yáng)出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合實(shí)驗(yàn)室，湖北襄陽(yáng)441003）

作為一種酸甜適口的傳統(tǒng)發(fā)酵食品，米酒通常以糯米為主要原料，接入酒曲發(fā)酵而成[1]。米酒中的有機(jī)酸包括草酸、乙酸、乳酸、蘋果酸、琥珀酸、檸檬酸和酒石酸等，其通常由微生物發(fā)酵或后期添加形成[2]。適量的酸可以在米酒中起到調(diào)節(jié)和緩沖諸味的作用，但當(dāng)酸度過(guò)高或過(guò)低時(shí)，均會(huì)造成米酒品質(zhì)下降[3]。由此可見(jiàn)，有機(jī)酸作為米酒中重要的呈味物質(zhì)，對(duì)米酒產(chǎn)品的滋味品質(zhì)有著較大的影響，因而明確米酒中有機(jī)酸的種類及含量是極為必要的。

除酸堿滴定法外[4]，研究人員亦可以采用旋光法[5]、氣相色譜法（Gas Chromatography，GC）[6]和高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）[7]對(duì)米酒中的有機(jī)酸含量進(jìn)行測(cè)定。值得一提的是，雖然旋光法和酸堿滴定法較為經(jīng)濟(jì)，但其準(zhǔn)確度較低，重復(fù)性亦較差[8]。此外，因有機(jī)酸具有較高的沸點(diǎn)，不容易氣化，因而在使用氣相色譜法對(duì)其測(cè)定時(shí)，需先對(duì)檢測(cè)物進(jìn)行衍生，方法較為復(fù)雜[9]。高效液相色譜法具有方法簡(jiǎn)便快捷、分離度高、結(jié)果準(zhǔn)確和對(duì)所測(cè)組分沸點(diǎn)沒(méi)有要求等優(yōu)點(diǎn)，因而廣泛的應(yīng)用于食品中有機(jī)酸的測(cè)定[10]。GB 5009.157-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品有機(jī)酸的測(cè)定》采用該方法約束了果汁飲料及果汁、果味碳酸飲料、果凍、水果罐頭、膠基糖果、固體飲料、面包、餅干、糕點(diǎn)、烘焙食品餡料和生濕面制品中有機(jī)酸的測(cè)試方法。然而令人遺憾的是，米酒并不在上述約束范圍內(nèi)。

本研究采用HPLC法對(duì)米酒中草酸、乙酸、乳酸、蘋果酸、琥珀酸、檸檬酸和酒石酸含量進(jìn)行了測(cè)定，通過(guò)色譜條件的優(yōu)化和方法性能的評(píng)價(jià)，實(shí)現(xiàn)了米酒中7種有機(jī)酸的快速分離和定量分析，為米酒生產(chǎn)廠家產(chǎn)品的自我檢測(cè)提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

米酒：市售；草酸、乙酸、乳酸、蘋果酸、琥珀酸、檸檬酸和酒石酸標(biāo)準(zhǔn)品：西隴科學(xué)股份有限公司；磷酸二氫鉀、磷酸氫二銨和磷酸（均為分析純）：天津市北辰方正試劑廠；甲醇和異丙醇（均為色譜純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；0.45 μm微孔濾膜：上海半島實(shí)業(yè)有限公司凈化器材廠。

LC-20ADXR高效液相色譜儀（配置有SIL-20A XR自動(dòng)進(jìn)樣器、LC-20AD XR四元低壓梯度泵、CTO-10AS vp柱溫箱、SPD-M20A二極管陣列紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)器）、Inertsil ODS-SP C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）：日本島津公司；PGJ-10-AS 品冠純水機(jī)：武漢品冠儀器設(shè)備有限公司；2-6E小型臺(tái)式離心機(jī)：德國(guó)Sigma實(shí)驗(yàn)室離心機(jī)股份有限公司；PHS-25型數(shù)顯pH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器有限公司；HHS-2數(shù)顯恒溫水浴鍋：長(zhǎng)豐儀器設(shè)備廠；PS-100A超聲波清洗機(jī)：深圳市潔匯超聲洗凈設(shè)備有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的處理方法

用天平稱取20.00 g試樣置于培養(yǎng)皿中，然后轉(zhuǎn)移至研缽中磨至粉碎，之后轉(zhuǎn)移至100 mL的容量瓶中，用流動(dòng)相定容后靜置一段時(shí)間。將定容后的樣品轉(zhuǎn)移至離心杯中，12 000 r/min離心10 min，取上清液過(guò)0.45 μm微孔纖維素濾膜，濾液備用。

1.2.2 色譜條件的優(yōu)化

1.2.2.1 供試樣品的制備

分別稱取草酸0.15g、蘋果酸0.30 g、檸檬酸0.60 g、酒石酸0.75 g以及乳酸、醋酸和琥珀酸各1.50 g溶解后于50 mL的容量瓶中定容，制成母液待用。

分別取各母液1.0 mL，再加入0.2 mL 1.0 mol/L的磷酸，用超純水定容至10 mL，混勻后作為供試樣品待用。

1.2.2.2 流動(dòng)相中磷酸鹽的選擇

流動(dòng)相：分別配制濃度均為0.01 mol/L的磷酸二氫鉀和磷酸氫二銨溶液，流動(dòng)相中不添加乙腈，調(diào)節(jié)pH 值為 2.30；進(jìn)樣量：20 μL；檢測(cè)器：SPD-M20A；色譜柱：InertsilODS-SPC18 色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30℃；流速：0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：215 nm。

1.2.2.3 流動(dòng)相中磷酸鹽濃度選擇

流動(dòng)相：分別配制0.01、0.05 mol/L和0.08 mol/L的磷酸二氫鉀溶液，流動(dòng)相中不添加乙腈，調(diào)節(jié)pH值為 2.30；進(jìn)樣量：20 μL；檢測(cè)器：SPD-M20A；色譜柱：InertsilODS-SPC18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30℃；流速：0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：215 nm。

1.2.2.4 流動(dòng)相pH值的選擇

流動(dòng)相：分別配制pH值為2.30、2.50和2.90，濃度為0.01 mol/L的磷酸二氫鉀溶液，流動(dòng)相中不添加乙腈；進(jìn)樣量：20 μL；檢測(cè)器：SPD-M20A；色譜柱：In ertsilODS-SPC18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30℃；流速：0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：215 nm。

1.2.2.5 流動(dòng)相中乙腈比例的選擇

流動(dòng)相：濃度為0.01 mol/L的磷酸二氫鉀溶液，分別設(shè)置乙腈和水相的體積比為0∶100、5∶95和10∶90；調(diào)節(jié)pH值為2.30；進(jìn)樣量：20 μL；檢測(cè)器：SPDM20A；色譜柱：InertsilODS-SPC18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；流速：0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：215 nm。

1.2.2.6 柱溫的選擇

分別設(shè)置柱溫為 25、30、35、40 ℃，流動(dòng)相：濃度為0.01 mol/L的磷酸二氫鉀溶液，流動(dòng)相中不添加乙腈，調(diào)節(jié)pH值為 2.30；進(jìn)樣量：20 μL；檢測(cè)器：SPD-M20A；色譜柱：InertsilODS-SPC18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流速：0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：215 nm。

1.2.2.7 流速的選擇

分別設(shè)置流動(dòng)相流速為0.5、0.8、1.0 mL/min和1.2 mL/min；流動(dòng)相：濃度為0.01 mol/L的磷酸二氫鉀溶液，流動(dòng)相中不添加乙腈，調(diào)節(jié)pH值為2.30；柱溫為 25 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；檢測(cè)器：SPD-M20A；色譜柱：InertsilODS-SPC18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)：215 nm。

1.2.3 米酒中7種有機(jī)酸的測(cè)定

1.2.3.1 米酒樣品的采集

從襄陽(yáng)市武商廣場(chǎng)購(gòu)物中心購(gòu)買10種品名的米酒樣品，依次編號(hào)為MJ1～MJ10。

1.2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

分別稱取草酸0.15 g、蘋果酸0.30 g、檸檬酸0.60 g、酒石酸0.75 g以及乳酸、醋酸和琥珀酸各1.50 g分別溶解后于50 mL的容量瓶中定容，制成母液待用。分別吸取 0.1、0.2、0.5、1.0、1.4 mL，在加入 0.2 mL 1.0 mol/L 磷酸后，用流動(dòng)相定容至10 mL。分別配制各個(gè)梯度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，溶液過(guò)0.45 μm濾膜待用。每個(gè)濃度重復(fù)進(jìn)樣，分別以7種有機(jī)酸的濃度為自變量x，色譜峰面積的均值為因變量y，采用外標(biāo)法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算。

色譜條件：流動(dòng)相：濃度為0.01 mol/L的磷酸二氫鉀溶液，流動(dòng)相中不添加乙腈，調(diào)節(jié)pH值為2.30；進(jìn)樣量：20 μL；檢測(cè)器：SPD-M20A；色譜柱：InertsilODSSPC18 色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：25℃；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：215 nm。

1.2.3.3 結(jié)果計(jì)算

米酒樣品中的有機(jī)酸含量按照以下公式進(jìn)行計(jì)算：

式中：X為樣品中有機(jī)酸的含量，g/kg；C為由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣品中某有機(jī)酸的濃度，μg/mL；V為樣品的最后定容體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g。

1.2.3.4 米酒中7種有機(jī)酸含量的測(cè)定

所有的試樣均按照1.2.1中的處理方法進(jìn)行處理，按照1.2.3.2中的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，按照1.2.3.3中的計(jì)算方法進(jìn)行計(jì)算。

1.2.4 方法性能評(píng)價(jià)

1.2.4.1 重復(fù)性試驗(yàn)

取MJ5樣品2 mL于10 mL容量瓶中，加入0.2 mL 1 mol/L磷酸后定容。12 000 r/min離心10 min，上清液過(guò)0.45 μm濾膜后，按照1.2.3.1中的色譜條件進(jìn)行7種有機(jī)酸峰面積的測(cè)定，試驗(yàn)重復(fù)5次，同時(shí)對(duì)其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值（relative standard deviation，RSD）進(jìn)行計(jì)算。

1.2.4.2 精密度試驗(yàn)

將1.2.2.1中的供試樣品，不間斷進(jìn)樣5次，色譜條件同1.2.3.2，分別對(duì)7種有機(jī)酸的峰面積進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)對(duì)其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）進(jìn)行計(jì)算。

1.2.4.3 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

取MJ5樣品2 mL于10 mL容量瓶中，加入0.2 mL 1 mol/L磷酸后定容。12 000 r/min離心10 min，上清液過(guò)0.45 μm濾膜備用。濾液分為4份，1份不做任何處理，另外3份添加一定量的7種有機(jī)酸的混合溶液。色譜條件同1.2.3.2。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析

使用島津高效液相色譜自帶軟件Labsolution將色譜圖轉(zhuǎn)化為數(shù)據(jù)矩陣后，利用Origin 8.5軟件（O－riginLab，MA，USA）作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 流動(dòng)相中磷酸鹽種類的選擇

在色譜柱為Inertsil ODS-SP C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm），柱溫為 30℃，流動(dòng)相流速為0.8mL/min，pH值為2.30，流動(dòng)相中不添加乙腈，磷酸鹽濃度為0.01 mol/L的固定條件下，分別選擇磷酸二氫鉀和磷酸氫二銨作為流動(dòng)相中的磷酸鹽，探討了磷酸鹽種類對(duì)7種有機(jī)酸分離效果的影響，其結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，磷酸二氫鉀和磷酸氫二銨對(duì)7種有機(jī)酸分離效果的影響不大，但當(dāng)緩沖鹽的種類選擇磷酸二氫鉀時(shí)，其基線要比磷酸氫二銨更平整，且噪音較小。綜上所述，本研究選擇磷酸二氫鉀作為流動(dòng)相中的緩沖鹽。

2.1.2 流動(dòng)相中磷酸鹽濃度選擇

在色譜柱為Inertsil ODS-SP C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm），柱溫為 30℃，流動(dòng)相流速為0.8mL/min，pH值為2.30，流動(dòng)相中不添加乙腈的固定條件下，分別配制磷酸二氫鉀的濃度為0.01、0.05、0.08mol/L，探討了磷酸二氫鉀濃度對(duì)7種有機(jī)酸分離效果的影響，其結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，磷酸鹽的濃度對(duì)7種有機(jī)酸的保留時(shí)間沒(méi)有較大的影響，但較高的鹽濃度會(huì)對(duì)色譜柱和整個(gè)流路系統(tǒng)造成損害，因此在其分離效果相同的條件下選擇磷酸二氫鉀的濃度為0.01 mol/L。

圖1 流動(dòng)相磷酸鹽種類對(duì)7種有機(jī)酸分離效果的影響Fig.1 Effect of phosphate type of mobile phase on the separation of 7 kinds organic acids

圖2 流動(dòng)相磷酸二氫鉀濃度對(duì)7種有機(jī)酸分離效果的影響Fig.2 Effect of monopotassium phosphate concentration in mobile phase on the separation of 7 kinds organic acids

2.1.3 流動(dòng)相pH值的選擇

在色譜柱為Inertsil ODS-SP C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm），柱溫為30℃，流動(dòng)相流速為0.8mL/min，流動(dòng)相中不添加乙腈，磷酸二氫鉀濃度為0.01 mol/L的固定條件下，分別設(shè)置流動(dòng)相的pH值為2.30、2.50和2.90，探討了流動(dòng)相pH值對(duì)7種有機(jī)酸分離效果的影響，其結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，流動(dòng)相的pH值會(huì)對(duì)7種有機(jī)酸的保留時(shí)間造成影響，當(dāng)pH值為2.30時(shí)7種有機(jī)酸均可被較好的分離，但當(dāng)pH值為2.50或2.90時(shí)，草酸和酒石酸的峰均不能很好的分開(kāi)。值得一提的是，隨著流動(dòng)相pH值的升高，部分有機(jī)酸的出峰時(shí)間出現(xiàn)縮短的情況。綜上所述，本研究選擇流動(dòng)相pH值為2.30。

2.1.4 流動(dòng)相中乙腈比例的選擇

在色譜柱為Inertsil ODS-SP C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm），柱溫為30℃，流動(dòng)相流速為0.8mL/min，pH值為2.30，磷酸二氫鉀濃度為0.01 mol/L，分別設(shè)置乙腈與緩沖鹽溶液的體積比為0∶100、5∶95和10∶90，探討了流動(dòng)相中乙腈比例對(duì)7種有機(jī)酸分離效果的影響，其結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，隨著乙腈體積比例的增加，各個(gè)有機(jī)酸的保留時(shí)間均相應(yīng)縮短，當(dāng)乙腈與緩沖鹽溶液的體積比是5∶95時(shí)，草酸、酒石酸、乳酸和乙酸均不能達(dá)到基線分離，當(dāng)乙腈與緩沖鹽溶液的體積比是10∶90時(shí)，7種有機(jī)酸均不能達(dá)到基線分離。綜上所述，本研究選擇流動(dòng)相中不添加乙腈。

圖3 流動(dòng)相pH值對(duì)7種有機(jī)酸分離效果的影響Fig.3 Effect of pH of mobile phase on the separation of 7 kinds organic acids

圖4 流動(dòng)相中乙腈比例對(duì)7種有機(jī)酸分離效果的影響Fig.4 The effect of acetonitrile percentage in mobile phase on the separation of 7 kinds organic acids

2.1.5 柱溫的選擇

在色譜柱為Inertsil ODS-SP C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm），流動(dòng)相流速為0.8mL/min，pH值為2.30，流動(dòng)相中不添加乙腈，磷酸二氫鉀濃度為0.01 mol/L的固定條件下，分別設(shè)置柱溫為25、30℃和35℃，探討了柱溫對(duì)7種有機(jī)酸分離效果的影響，其結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，柱溫的改變對(duì)7種有機(jī)酸分離效果的影響并不大，但隨著溫度的升高，色譜柱損傷亦隨之增大。綜上所述，本試驗(yàn)最后選擇的柱溫為25℃。

2.1.6 流動(dòng)相流速的選擇

在色譜柱為Inertsil ODS-SP C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫為 25 ℃，pH 值為 2.30，流動(dòng)相中不添加乙腈，磷酸二氫鉀濃度為0.01 mol/L的固定條件下，分別設(shè)置流速 0.5、0.8、1.0、1.2 mL/min，探討了流動(dòng)相流速對(duì)7種有機(jī)酸分離效果的影響，其結(jié)果如圖6所示。

由圖6可知，隨著流速的增加，有機(jī)酸的保留時(shí)間隨之提前。在保證分離效果和壓力適中的前提下，應(yīng)盡可能快的使待檢測(cè)組分被檢出，進(jìn)而達(dá)到縮短檢測(cè)時(shí)間的目的。綜上所述，本試驗(yàn)最后選擇的流動(dòng)相流速為1.0 mL/min。

圖5 柱溫對(duì)7種有機(jī)酸分離效果的影響Fig.5 Effect of column temperature on the separation of 7 kinds organic acids

圖6 流動(dòng)相流速對(duì)7種有機(jī)酸分離效果的影響Fig.6 Effect of flow rate of mobile phase on the separation of 7 kinds organic acids

2.2 米酒中7種有機(jī)酸含量的測(cè)定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)回歸方程

按照1.2.3.2中方法，分別以草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸7種有機(jī)酸的濃度為自變量x，色譜峰面積為因變量y，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的計(jì)算，結(jié)果如表1。

由表1可知，7種有機(jī)酸線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)均在0.9960以上。由此可見(jiàn)，各有機(jī)酸的濃度和峰面積之間具有良好的線性關(guān)系，這亦可間接證明本研究所采用的色譜條件可以實(shí)現(xiàn)米酒樣品中7種有機(jī)酸的精確定量。

表1 7種有機(jī)酸的回歸方程Table 1 Linear regression equations of detection for 7 kinds organic acids

2.2.2 米酒中7種有機(jī)酸含量的測(cè)定

取2 mL樣品加入0.2 mL 1 mol/L磷酸后，用流動(dòng)相定容，12 000 r/min離心10 min后，上清液過(guò)0.45 μm濾膜后上機(jī)，按照1.2.3.2中的色譜條件對(duì)米酒中7種有機(jī)酸的含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表2所示。

2.3 方法性能研究

2.3.1 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

按照1.2.1制作MJ5米酒樣品5份，5份樣品分別進(jìn)樣，色譜條件同1.2.3.2，測(cè)定樣品中7種有機(jī)酸的含量，同時(shí)計(jì)算RSD。結(jié)果如表3所示。

表2 10個(gè)米酒樣品中7種有機(jī)酸的含量（n=3）Table 2 Contents of 7 kinds organic acids in 10 rice wine samples（n=3）

表3 重復(fù)性試驗(yàn)Table 3 Result of repetitive test

由表3可知，7種有機(jī)酸的RSD值均在1.0%以下，由此可知，本試驗(yàn)所采用的研究方法在測(cè)定上述7種有機(jī)酸時(shí)具有良好的重復(fù)性。

2.3.2 精密度試驗(yàn)結(jié)果

準(zhǔn)確吸取1.2.2.1節(jié)中7種有機(jī)酸的混合供試溶液，按照1.2.3.2節(jié)中的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，不間斷進(jìn)樣5次，分別測(cè)量7種有機(jī)酸的峰面積和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值，其結(jié)果如表4。

由表4可知，7種有機(jī)酸的RSD值均在1.0%以下，由此可知，本試驗(yàn)具有較好的精密性，可以滿足試驗(yàn)要求。

表4 精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of precision test

2.3.3 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果

按照1.2.4.3的樣品處理方法制作MJ5米酒供試樣品，同時(shí)按1.2.3.2中的色譜條件對(duì)樣品中7種有機(jī)酸的含量進(jìn)行測(cè)定，其含量和加樣回收率結(jié)果如表5所示。

表5 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of spike recovery test

由表5可知，7種有機(jī)酸的平均回收率在98.74%和101.00%之間，由此可見(jiàn)，HPLC法對(duì)米酒中7種有機(jī)酸含量測(cè)定時(shí)回收率較高，在試驗(yàn)允許的范圍內(nèi)，可以很好的滿足定量分析的要求。

3 結(jié)論

本研究建立了高效液相色譜法測(cè)定米酒中草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸7種有機(jī)酸的方法，其中檢測(cè)器為二極管陣列紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)215 nm，Inertsil ODS-SP C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫為 25℃，流動(dòng)相為0.01 mol/L的磷酸二氫鉀溶液，pH值為2.30，流速為1.0 mL/min。

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