不同沉水植物根際微域中菲和芘的降解行為

孟凡波，于田田，遲 杰，劉宏艷

(天津大學環(huán)境科學與工程學院，天津 300350)

多環(huán)芳烴(PAHs)是一類典型的持久性有機污染物[1]，在環(huán)境中普遍存在，具有慢性毒性和潛在的致畸、致癌和致突變的“三致”作用.美國環(huán)境保護局(U.S.EPA)早在 20世紀 80年代初就將其中的 16種列為優(yōu)先控制污染物.PAHs通過廢水排放、大氣沉降等途徑進入水體后，會強烈地分配到非水相并吸附在顆粒物上，進而沉降到底泥中，使沉積物成為其主要的環(huán)境歸宿[2].

微生物降解是沉積物中PAHs去除的主要途徑，而植物修復因能促進沉積物中微生物降解而成為一種綠色環(huán)保、具有發(fā)展前景的原位修復技術.沉水植物在水生態(tài)系統(tǒng)中具有非常重要的生態(tài)功能，它們可以吸收水體中的有害物質凈化水質，為水體中的生物提供營養(yǎng)物質和棲息地，根系還可以固定底質防止再懸浮[3].常見的沉水植物有苦草、狐尾藻、黑藻和菹草等.不同沉水植物根系發(fā)達程度不同，對沉積物中PAHs降解的促進作用也不同.目前利用沉水植物修復沉積物中的 PAHs已初見成效[4]，但都基于盆栽實驗，無法清楚闡述PAHs降解的根際效應.

筆者選取了兩種沉水植物(苦草和狐尾藻)，利用自制的多隔層根箱，研究了不同沉水植物根際沉積物中菲和芘質量分數(shù)的梯度變化.同時還監(jiān)測了氧化還原電位(Eh)、PAH-降解菌和磷脂脂肪酸(PLFAs).在此基礎上，比較了兩種沉水植物根際PAHs的降解并分析了氧對降解的影響.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

菲和芘，分析純，純度≥98%,，京東仁成工業(yè)株式會社生產(chǎn)；試劑均為分析純，天津市化學試劑一廠生產(chǎn).狐尾藻采自天津大學敬業(yè)湖，并采用 Zhou等[5]的組織培養(yǎng)方法進行培養(yǎng)和繁殖；苦草種子購買于江蘇固城湖漁村店，然后進行幼苗培養(yǎng).

沉積物采自天津海河干流表層沉積物(0～15,cm)，陰涼遮光處自然風干后過 2,mm 篩.采取先局部染毒，再全部混勻的方式進行染毒：將適當濃度菲和芘的丙酮混合溶液均勻加入到所需總量 1/6的沉積物中，緩慢攪拌均勻，待丙酮揮發(fā)后，用剩余的5/6未染毒的沉積物稀釋，多次攪拌后過2,mm篩，最終制得沉積物中菲和芘的質量分數(shù)分別接近12.0,mg/kg和13.0,mg/kg.

1.2 實驗設計

自制一個長 12,cm、寬 12,cm、高 10,cm 的根箱(見圖 1)，從上到下為根際區(qū)(S0，高 6,cm)、近根際區(qū)(高1,cm，用粘有500 目尼龍網(wǎng)2,mm厚的插片進一步分為 5層，分別為 S1、S2、S3、S4和 S5)和非根際區(qū)(S6，高3,cm).根際室內(nèi)先加入334,g未染毒沉積物，將苦草(26株)、狐尾藻(30株)分別種植于浸濕的沉積物中，再將根際室放入有 36,L曝氣水的玻璃水族箱中培養(yǎng) 1個月以獲取植物根墊.待植物根墊形成后，每個插片內(nèi)放入 33.4,g染毒沉積物，鋪平并用水浸濕，每 5個插片平放摞在一起，放在非根際室(裝有 501,g染毒沉積物)上，再將植物根際室放在最上面，4周用插銷裝置固定，繼續(xù)培養(yǎng) 30天.同時設置無植物對照組.運行期間，保持光照強度為(2,200±100)lx，光暗比 12,h：12,h，控制溫度為(22±1)℃.

圖1 根箱及插片結構示意Fig.1 Illustrative diagram of designed rhizobox and nylon mesh supported by back-up carriage

實驗結束時，先測定根際微域的氧化還原電位值，再取出植物樣品測量長度和鮮量及 PAHs含量.依次取下插片，分別采集各微域中的沉積物樣品，取部分新鮮樣品立即測定 PAH-降解菌，其余部分冷凍干燥24,h后研磨，待進一步測定其他指標.

1.3 實驗方法

1.3.1 PAHs含量分析

沉積物中菲和芘的分析方法：稱取 5.0,g冷凍干燥后過 80目篩的沉積物樣品于兩層普通濾紙中包好，置于60,mL的索氏提取器中，用45,mL二氯甲烷索氏提取24,h.然后將提取液轉移到100,mL的K-D濃縮管中，旋轉蒸發(fā)(水浴溫度＜35,℃)至約 1,mL.再轉移至自制的凈化柱內(nèi)(內(nèi)徑為 1,cm，從上到下依次為 1,cm高無水硫酸鈉、7,cm高中性氧化鋁和14,cm高硅膠；使用前依次用 20,mL甲醇、30,mL正己烷清洗并棄去潤洗液)，用 25,mL體積比為 2∶3的二氯甲烷和正己烷混合溶液洗脫并收集洗脫液，氮吹濃縮至 1,mL.處理后的樣品用 Agilent 6890N/5975C氣質聯(lián)用儀測定，分析前加入10,μL的內(nèi)標物(1,000,mg/L的六甲基苯).升溫程序為：初始溫度 100,℃，以 20,℃/min升溫至 280,℃，保持2,min.載氣氦氣，流量為 1.0,mL/min，不分流進樣，進樣1,μL.進樣口和檢測器溫度均為250,℃，接口溫度為280,℃，EI源70,eV.

1.3.2 氧化還原電位測定

沉積物中 Eh采用丹麥 Unisense公司發(fā)明的穿刺型微電極測定.取出根箱，將參比電極固定在根際室內(nèi)，然后將根際室中間位置的土層挖開，露出插片中間的方孔(每個插片中央位置預先挖 1,cm×1,cm的方孔)，旋轉粗調螺旋和微調螺旋，使 Eh電極下降，觀察信號值.當出現(xiàn)信號突變時，即為零點，開始測定.測定深度2,cm，步徑50,μm.

1.3.3 PAH-降解菌測定

制備滅菌的無機鹽培養(yǎng)基[6]，冷卻到 50,℃時，加入適量菲和芘的丙酮溶液使培養(yǎng)基中菲和芘的質量濃度均為50,mg/L，超聲20,min后傾倒于滅菌培養(yǎng)皿中，凝固后倒置于 30,℃黑暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24,h.稱取 1,g吸干水的新鮮沉積物于滅菌錐形瓶中，加9,mL無菌水和玻璃珠，150,r/min水平振蕩 30,min，靜置 30,min.將上清液配制成 10-2、10-3、10-43個稀釋度的菌懸液.然后分別吸取 0.2,mL菌液，涂布接種于無菌培養(yǎng)皿中，倒置于 30,℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 5,d后計數(shù).最終結果換算為 CFU/g來表示沉積物中PAH-降解菌數(shù)量.

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計都采用SPSS 20.0軟件完成.對實驗不同處理組之間進行單因素方差分析(ANOVA)，采用Duncan方法，在 α＝0.05水平進行數(shù)據(jù)差異顯著性檢驗；并對不同指標間進行 Pearson相關性分析，以α＝0.05水平進行數(shù)據(jù)相關性顯著性檢驗.

2 結果與討論

2.1 根際微域中PAHs的去除

實驗結束時，不同處理組和不同根際微域中菲和芘的質量分數(shù)都有明顯的降低(見表 1).在對照組中，S1微域中菲質量分數(shù)顯著低于其他微域，而芘質量分數(shù)在整個微域中變化并不明顯.有植物組中，隨著距根系距離的增加，菲和芘的質量分數(shù)也隨之增加.在S1和S2微域中，植物組微域中PAHs含量顯著高于對照組(p＜0.05)；而在S3～S6微域并沒有顯著差異(p＞0.05)，這說明植物根系明顯促進了距根系4,mm內(nèi)PAHs的降解.

表1 根際微域中菲和芘的質量分數(shù)Tab.1 Mass fractions of phenanthrene and pyrene in the rhizosphere

相應地，如圖 2所示，菲和芘在苦草組、狐尾藻組、對照組中的去除率分別為 35.0%,～84.3%,和31.0%,～74.6%,、33.8%,～80.6%,和 39.8%,～69.7%,、32.3%,～54.4%,和 33.3%,～47.2%,.隨著距根系距離的增加，3個處理組中菲和芘的去除率隨之降低，并且植物組和對照組不同根際微域中 PAHs去除率的大小順序分別為 S1＞S2＞S3～S6和 S1＞S2～S6，這說明PAHs在近根際微域中的去除作用更大.這是因為 S1和 S2微域距離植物根墊最近，受植物根系釋放的根系分泌物和氧氣的影響最強烈.此外，在S1和 S2微域中，PAHs去除率在 3個處理組中的差異最顯著(p＜0.05)，其大小順序為苦草＞狐尾藻＞對照；與對照組相比，種植苦草和狐尾藻分別使 S1微域中菲的去除率增加了29.9%,和26.2%,，使芘的去除率增加了 27.4%,和 22.5%,；分別使 S2微域中菲的去除率增加了 17.9%,和 13.8%,，使芘的去除率增加了8.8%,和 10.8%,.可以看出：①苦草對根際沉積物中PAHs去除的促進作用大于狐尾藻，這是因為在相同時間內(nèi)，苦草根系的生長能力大于狐尾藻[7]，苦草的根系比狐尾藻更發(fā)達，可為微生物提供更多的營養(yǎng)物質和氧氣；②菲的去除率高于芘，這是因為低環(huán)PAHs更易被降解，這一結果與已有報道一致[8-9].而在S3-S6微域中，菲和芘的去除率在3個處理組中無顯著差異(p＞0.05)，這說明苦草和狐尾藻根系對根際沉積物影響的最大距離均為4,mm.

圖2 根際微域中菲和芘的去除率Fig.2 Dissipation ratios of phenanthrene and pyrene in the rhizosphere

植物組沉積物中PAHs主要通過兩種途徑去除：一是微生物降解，二是植物的吸收作用.實驗結束時測得苦草和狐尾藻體內(nèi)菲的質量分數(shù)分別為0.05,mg/kg和 0.07,mg/kg，芘的質量分數(shù)分別為0.06,mg/kg和 0.09,mg/kg.質量守恒結果得出植物體內(nèi)PAHs的富集量僅占S1微域內(nèi)PAHs去除總量的0.53%,～0.99%,.可見，植物吸收對PAHs去除的貢獻作用很小，微生物降解才是沉積物中PAHs主要的去除途徑.

2.2 根際微域中PAH-降解菌數(shù)量

如圖 3所示，植物組中 PAH-降解菌數(shù)量隨著距根系距離的增加先下降后保持穩(wěn)定，在 S1微域內(nèi)獲得最大值，說明近根際微域降解菌數(shù)量高于遠根際；而對照組中隨距離的增加并沒有明顯變化(p＞0.05).其中，距根系4,mm(S1和S2)微域內(nèi)，苦草組PAH-降解菌數(shù)量顯著高于狐尾藻組(p＜0.05)，與PAHs去除率的趨勢一致；距根系 6,mm(S1～S3)微域內(nèi)，植物組 PAH-降解菌數(shù)量明顯高于對照組(p＜0.05)，并且高出 86.9%～217.7%,(苦草)和 32.3%～98.4%(狐尾藻).由此說明，苦草和狐尾藻根際作用影響 PAH-降解菌數(shù)量主要在近根際，雖然苦草對降解菌數(shù)量的促進作用更大，但兩種植物根系影響降解菌的距離范圍均為 6,mm.此外，統(tǒng)計分析表明，PAH-降解菌數(shù)量與 PAHs去除率之間有很好的正相關性(菲：r＝0.791，n＝54，p＝0.003；芘：r＝0.743，n＝54，p＝0.025).

圖3 根際微域中PAH-降解菌數(shù)量Fig.3 PAH-degrading bacterial populations in the rhizosphere

2.3 根際微域中氧化還原電位

O2是 PAHs好氧生物降解過程中必需的電子受體.沉積物中 Eh可以用來表征沉積物中的氧含量[6].Jouanneau等[10]發(fā)現(xiàn)在蘆葦根系周圍的明亮區(qū)域中Eh為正值，而暗色的沉積物中 Eh為負值，這說明蘆葦根系可提高根際區(qū)域的 Eh值.本研究利用Unisense微電極原位測定了苦草和狐尾藻根際微域中距植物根系20,mm內(nèi)的Eh梯度變化情況，如圖4所示.隨著距根系距離的增加，苦草根際中的 Eh先快速下降(0,mm(477.8,mV)～6,mm(179.2,mV))后緩慢降低(6,mm(179.2,mV)～20,mm(95.2,mV))；狐尾藻根際微域中先快速下降(0,mm(409.8,mV)～4,mm(168.0,mV))后保持穩(wěn)定(4～20,mm，平均值為162.5,mV)；而對照組中的 Eh(平均值為 132.7,mV)隨距根系距離的增加沒有變化.在距根系6,mm距離內(nèi)，苦草根際中的 Eh值顯著高于對照組(高出50.6～328.8,mV)，而狐尾藻根際中的 Eh值只在4,mm 的距離內(nèi)高于對照組(高出 29.0～255.8,mV).這說明苦草根系對沉積物中氧的影響范圍為 6,mm，狐尾藻根系的影響范圍僅為 4,mm.這更進一步說明了苦草根系的釋氧能力大于狐尾藻，使得苦草根際中氧的擴散距離遠大于狐尾藻.Pearson相關性分析表明，沉積物中的 Eh值與降解菌數(shù)量之間有很好的正相關關系(r＝0.899，n＝45，p＝0.000)，表明根系釋氧增加了根際沉積物中的氧濃度，提高了降解菌的數(shù)量，進而促進了沉積物中PAHs的降解[11].

圖4 根際微域中氧化還原電位Fig.4 Sediment redox potential in the rhizosphere

3 結 論

(1)沉積物中 PAHs去除率沿著遠離根系的方向呈下降趨勢，苦草和狐尾藻明顯提高了距植物根系4,mm 距離內(nèi)菲(增幅分別為 17.9%～29.9%和13.8%～26.2%)和芘(8.8%～27.4%和 10.8%～22.5%)的去除率.說明苦草的根際效應大于狐尾藻.

(2)近根際(0～6,mm)微域，植物組 PAH-降解菌數(shù)量顯著高于對照組，并且苦草組 PAH-降解菌數(shù)量顯著高于狐尾藻組，統(tǒng)計結果也表明 PAH-降解菌數(shù)量和PAHs的去除率呈顯著正相關.

(3)沉積物 Eh隨著與根系距離的增大逐漸減小.苦草根系對沉積物中氧的影響范圍為 6,mm，狐尾藻根系的影響范圍僅為 4,mm，說明苦草的釋氧能力大于狐尾藻.沉積物中的 Eh值與降解菌數(shù)量之間有很好的正相關性，說明高氧含量能增加 PAH-降解菌數(shù)量，進而促進PAHs的降解.

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