黃芩拆分組分對正常大鼠物質(zhì)代謝、能量代謝、內(nèi)分泌系統(tǒng)及植物神經(jīng)系統(tǒng)的影響*

張亞男，陳平平，王洪玉，高 鑫，劉樹民

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全評價中心，哈爾濱 150040）

黃芩為唇形科植物黃芩（Scutellaria baicalensis Georgi）的干燥根，2015版中國藥典記載黃芩味苦性寒。歸肺、膽、脾、大腸、小腸經(jīng)[1-5]。

中藥的四性（四氣）是指中藥溫?zé)岷疀?種不同的藥性，但也有一部分中藥藥性平和，故現(xiàn)在四氣一般指“寒、熱、溫、涼、平”5種藥性，它反映了藥物影響人體陰陽盛衰、寒熱變化方面的作用趨勢[1]?；诖吮緦嶒灆z測大鼠體內(nèi)物質(zhì)代謝、能量代謝、內(nèi)分泌系統(tǒng)、植物神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)酶的含量，考察黃芩拆分組分對其表達(dá)的影響，以初步詮釋黃芩拆分組分的寒熱屬性。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 取SD種雄性大鼠50只，SPF級，體質(zhì)量（200±20）g，動物由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評價中心提供[許可證號:SCXK（黑）2015-004]，室溫為（22±1）℃，相對濕度為（65±5）%，實驗動物自由攝食飲水。將大鼠隨機(jī)分成5組，空白組，全成分組、苷元組、苷類組、多糖組，每組10只。

1.2 藥物 黃芩生品[河北承德藥材有限公司（生產(chǎn)批號:20140623）]。黃芩拆分組分的制備:黃芩飲片加石油醚（料液比 1∶6）超聲 50 min，2 次，抽濾。合并濾液減壓濃縮，揮去石油醚得揮發(fā)油組分；藥渣干燥后，水煎煮，第1煎加入10倍量的蒸餾水提取，第2煎加入8倍量水（兩煎均冷凝回流2 h）,合并兩煎藥液，減壓回收提取液至適當(dāng)濃度，得到全成分。加入95%乙醇（大約5倍量體積），不斷攪動，至乙醇的濃度約為80%，靜置24 h（此過程反復(fù)3～4次），收集沉淀部分，沉淀經(jīng)抽慮，離心后，經(jīng)無水乙醇，乙醚交替洗滌，自然干燥沉淀得多糖組分；濾液減壓回收至無醇味，過D101大孔樹脂，用3倍柱體積的30%乙醇和95%的乙醇進(jìn)行洗脫，分別得到黃芩苷元組分和苷類組分，縮至稠浸膏，凍干，干燥保存待用。

1.3 試劑與儀器 葡萄糖激酶（GCK）、果糖磷酸激酶（PFK）、乙酰輔酶 A（Ac-CoA）、丙酮酸脫氫酶（PDH）、檸檬酸合酶（CS）、異檸檬酸脫氫酶（ICD）（南京建成生物工程研究所，批號20150610）、腺甘酸激酶（ADK）、ATP合成酶（ATPs）、細(xì)胞色素 C 還原酶（CCR）、細(xì)胞色素 C 氧化酶（COX）（南京建成生物工程研究所，批號20150617）、三碘甲狀腺原氨酸（T3）、四碘甲狀腺原氨酸（T4）、5-羥色胺（5-HT）、乙酰膽堿（AchE）、去甲腎上腺素（NE）酶聯(lián)免疫試劑盒、超微量Na-K-ATP酶測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號20150624）。

酶標(biāo)儀M200 PRO（奧地利）；AL204電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；TGL-20M高速臺式冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；移液槍（德國梅特勒-托利多）；水浴鍋（北京市長風(fēng)儀器有限公司）。

2 實驗方法

2.1 動物的分組及給藥 動物適應(yīng)性喂養(yǎng)3d以后，隨機(jī)分為空白組、全成分組、苷元組、苷類組、多糖組，每組10只。全成分組給予（生藥3 g/kg），苷元組（生藥 0.05 g/kg），苷類組（生藥 0.41 g/kg），多糖組（0.42 g/kg），空白組給予等劑量生理鹽水。連續(xù)給藥2周后取心臟、肝臟、肌肉等迅速凍存于液氮中，轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 物質(zhì)代謝相關(guān)指標(biāo)的檢測 取出之前凍存的肝臟組織解凍后，取剪碎的組織 0.2 g，按照 1∶9 的質(zhì)量體積比，加入1.8 mL的生理鹽水，加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨，最后將勻漿液以4 000 r/min，離心10 min，依據(jù)試劑盒說明書檢測GCK、PFK、PK、Ac-CoA、PDH、CS、ICD、的含量。

2.3 能量代謝相關(guān)指標(biāo)的檢測 操作方法如上，依據(jù)試劑盒說明書檢測 ADK、ATP、CCR、COX、Na-KATP酶（肌肉）、Na-K-ATP酶（肝臟）的含量。

2.4 內(nèi)分泌系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo)的檢測 取材后的全血樣品于室溫放置2 h或者4℃過夜后以3 000 r/min離心15 min，取上清液，依據(jù)試劑盒說明檢測T3、T4的含量。

2.5 植物神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo)的檢測 操作方法如2.4，依據(jù)試劑盒說明檢測 5-HT、AchE、NE 的含量。

2.6 統(tǒng)計方法 采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計處理，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 黃芩拆分組分對正常大鼠物質(zhì)代謝的影響

3.1.1 黃芩拆分組分對葡萄糖氧化成丙酮酸階段相關(guān)酶表達(dá)情況的影響 見表1。實驗結(jié)果所示，與空白組比較，全成分組大鼠GCK、PFK的表達(dá)下調(diào)且具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）；苷元組 GCK 顯著下調(diào)（P＜0.05）；苷類組 PFK 顯著下調(diào)（P＜0.05）。

3.1.2 黃芩拆分組分對丙酮酸氧化成乙酰輔酶A階段相關(guān)酶表達(dá)情況的影響 見表2。實驗結(jié)果所示，與空白組比較，全成分組大鼠Ac-CoA表達(dá)顯著升高、PDH表達(dá)顯著性下降且具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）；苷類組 PDH 顯著下調(diào)（P＜0.05）。

表1 黃芩拆分組分對大鼠GCK、PFK、PK表達(dá)的影響（±s）ng/mL

表1 黃芩拆分組分對大鼠GCK、PFK、PK表達(dá)的影響（±s）ng/mL

注:與空白組比較，*P＜0.05。

組別 n GCK PFK空白組 10 3.33±0.45 3.49±0.57全成分組 10 2.89±0.25* 2.77±0.68*苷元組 10 3.16±0.23 3.17±0.28*苷類組 10 3.03±0.41* 3.47±0.69多糖組 10 3.21±0.59 3.89±0.44

表2 黃芩拆分組分對大鼠Ac-CoA、PDH蛋白影響（±s）ng/mL

表2 黃芩拆分組分對大鼠Ac-CoA、PDH蛋白影響（±s）ng/mL

注:與空白組比較，*P＜0.05。

組別 n AC-COA PDH空白組 10 9.69±1.59 13.40±2.20全成分組 10 12.32±2.49* 11.66±3.33*苷元組 10 10.46±1.36 14.81±3.51苷類組 10 10.42±1.65 10.01±2.88*多糖組 10 10.95±0.96 13.27±1.99

3.1.3 黃芩拆分組分對三羧酸循環(huán)過程相關(guān)酶表達(dá)情況的影響 見表3。結(jié)果可以得出，與空白組比較，全成分組CS、ICD蛋白表達(dá)下調(diào)，且具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）；苷元組 CS蛋白表達(dá)下調(diào)明顯（P＜0.05）。

表3 黃芩拆分組分對大鼠CS、ICD蛋白的影響（±s） ng/mL

表3 黃芩拆分組分對大鼠CS、ICD蛋白的影響（±s） ng/mL

注:與空白組比較，*P＜0.05。

ng/mL組別 n CS ICD空白組 10 7.13±1.67 12.84±2.19全成分組 10 5.70±0.72* 10.76±1.07*苷元組 10 6.55±0.68* 12.24±1.51苷類組 10 6.73±1.19 12.63±1.27多糖組 10 7.75±1.01 14.77±2.09影響（±s）

3.2 黃芩拆分組分對能量代謝過程中相關(guān)酶表達(dá)的影響 見表4。實驗結(jié)果所示，與空白組比較，全成分組可顯著性的降低ADK、CCR、NA-K-ATP酶（肝臟）的表達(dá)，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）；苷元組可明顯降低COX、NA-K-ATP酶（肝臟）的表達(dá)且具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），其余指標(biāo)均有回調(diào)趨勢；苷類組顯著性降低COX蛋白表達(dá)及NA-K-ATP（肌肉）活性（P＜0.05），其余指標(biāo)均有回調(diào)作用；多糖組 ATP顯著降低（P＜0.05）。

3.3 黃芩拆分組分對正常大鼠內(nèi)分泌系統(tǒng)相關(guān)酶表達(dá)的影響 見表5。實驗結(jié)果所示，與空白組比較，全成分組和苷元組 T4 明顯降低（P＜0.05）；苷類組 T3、T4 水平降低且具有明顯差異（P＜0.05）。

表4 黃芩拆分組分對大鼠ADK、ATP、CCR、COX、NA-K-ATP的影響（±s）

表4 黃芩拆分組分對大鼠ADK、ATP、CCR、COX、NA-K-ATP的影響（±s）

注:與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 n ADK（ng/mL） ATP（ng/mL） CCR（ng/mL） COX（ng/mL） NA+-K+-ATP（U/mg）（肝臟） NA+-K+-ATP（U/mg）（肌肉）空白組 10 4.54±0.33 3.26±0.50 0.69±0.20 1.23±0.19 2.16±0.40 2.62±0.48全成分組 10 4.20±3.75* 3.75±0.47 0.51±0.13* 1.12±0.15 1.50±0.46** 2.35±0.90苷元組 10 4.68±3.23 3.23±0.39 0.67±0.19 1.05±0.12* 1.61±0.77* 2.40±0.87苷類組 10 4.38±3.30 3.20±0.36 0.60±0.18 1.03±0.16* 1.76±0.72 2.13±0.39*多糖組 10 4.43±2.77 2.77±0.29* 0.64±0.18 1.09±0.13 2.71±0.51 2.65±0.69

表5 黃芩拆分組分對大鼠T3、T4的影響（±s）ng/mL

表5 黃芩拆分組分對大鼠T3、T4的影響（±s）ng/mL

注:與空白組比較，*P＜0.05。

組別 n T3 T4空白組 10 0.99±0.12 23.56±3.98全成分組 10 0.97±0.11 19.77±4.37*苷元組 10 0.95±0.39 21.79±3.85*苷類組 10 0.85±0.13* 19.14±4.01*多糖組 10 1.03±0.12 21.37±4.68

3.4 黃芩拆分組分對正常大鼠植物神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)酶表達(dá)的影響 見表6。實驗結(jié)果所示，與空白組比較，全成分組大鼠 5-HT 水平顯著上升（P＞0.05）；苷元組大鼠5-HT水平明顯升高、AchE水平顯著降低（P＜0.05），NE 有降低趨勢但不明顯；苷類組 5-HT 水平明顯升高、NE水平明顯下降，AchE有降低趨勢；多糖組5-HT升高，AchE和NE下降，但均不顯。

表6 黃芩拆分組分對大鼠5-HT、AchE、NE的影響（±s）

表6 黃芩拆分組分對大鼠5-HT、AchE、NE的影響（±s）

注:與空白組比較，*P＜0.05。

組別 n 5-HT（U/mL） AchE（ng/mL） NE（nmol/mL）空白組 10 7.38±1.91 33.17±2.26 7.79±0.78全成分組 10 10.59±2.74* 31.53±4.45 7.78±0.93苷元組 10 12.42±3.35* 30.70±2.14* 8.19±0.62苷類組 10 7.21±1.94 32.72±2.04 7.16±1.00多糖組 10 8.24±1.98 31.57±2.26 8.31±0.93

4 討論

王伽伯等[6]提出中藥藥性物質(zhì)基礎(chǔ)研究，研究藥性相同或相近的中藥中的一類化學(xué)成分是揭示藥性實質(zhì)的有效途徑，發(fā)現(xiàn)寒性藥抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性、減弱循環(huán)系統(tǒng)、降低機(jī)體產(chǎn)熱量。王艷艷等[7]發(fā)現(xiàn)具有寒涼藥性的中藥抑制線粒體的能量代謝；溫?zé)崴幣c之相反。黃麗萍等[8-9]提出寒性中藥黃芩抑制能量代謝，抑制NA-K-ATP酶的生成。戴璐[10]通過觀察寒性中藥黃連和大黃對實熱證大鼠物質(zhì)代謝、能量代謝及甲狀腺軸功能的影響，發(fā)現(xiàn)寒涼中藥抑制物質(zhì)代謝、能量代謝及甲狀腺軸功能。滕佳林等[11]也發(fā)現(xiàn)寒性藥使腦內(nèi)5-HT增加，NE減少。黃俊山等[12]發(fā)現(xiàn)寒涼藥抑制甲狀腺激素?？擞萚13]發(fā)現(xiàn)桑白皮拆分組分抑制物質(zhì)能量代謝，推測其藥性可能為寒涼。SONG等[14]發(fā)現(xiàn)蒼術(shù)能夠通過線粒體中的C2C12肌管促進(jìn)糖代謝和脂肪代謝。在前期的實驗研究基礎(chǔ)上，本實驗考察物質(zhì)代謝、能量代謝、內(nèi)分泌系統(tǒng)以及植物神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)，以探討黃芩拆分組分的藥性歸屬。

總體來說黃芩全成分抑制物質(zhì)代謝；苷元和苷類具有與寒涼中藥相同的作用趨勢，推測其抑制物質(zhì)代謝；在物質(zhì)代謝階段多糖的作用趨勢不明顯[15]。

在能量代謝的過程中，黃芩全成分顯著降低ADK、CCR、COX、NA-K-ATP酶的表達(dá)；對 ATP的影響不明顯，主要可能是三羧酸循環(huán)過程被抑制，而該過程是主要生成ATP的過程，糖原的合成和分解均處于動態(tài)過程提供能量，脂肪分解提供能量以保持機(jī)體的正常功能。由以上指標(biāo)可以推斷出黃芩全成分對正常大鼠的能量代謝具有抑制作用；通過部分指標(biāo)的表達(dá)，推測苷元和苷類具有與寒涼中藥相同的作用趨勢，推測其抑制能量代謝；在該過程中多糖抑制ATP的生成，推測多糖抑制能量代謝過程。

黃芩全成分和苷元抑制植物神經(jīng)系統(tǒng)，苷類有抑制傾向，NE和AchE降低，5-HT升高，表現(xiàn)出與寒涼中藥相似的作用趨勢，由此可以推斷出其黃芩全成分和苷元藥性為寒性，該階段苷類組分和多糖組分的趨勢不明顯，需要進(jìn)一步證實。

陳慧等[17]提出中藥寒熱平性質(zhì)與化學(xué)成分的類別及含量有相關(guān)性，在寒性中藥中黃酮類化合物出現(xiàn)的頻率以及含量明顯高于其他化合物，在熱性中藥中萜類和揮發(fā)油出現(xiàn)的頻率以及含量最高，在平性中藥中黃酮類化合物出現(xiàn)的頻率和糖類、萜類和揮發(fā)油相差不大，平性中藥無寒熱之偏，糖類在寒熱平3種中藥中出現(xiàn)的頻率相差不大。綜合上述實驗結(jié)果，根據(jù)黃芩拆分組分對物質(zhì)代謝、能量代謝、內(nèi)分泌系統(tǒng)及植物神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo)表達(dá)的影響，推斷出苷元和苷類的藥性為寒，是黃芩藥性為寒的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，多糖的藥性可能為微寒，尚需進(jìn)一步的實驗來進(jìn)行驗證。

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