高效液相色譜法同時測定酵素原液中的乳酸和醋酸

楊鈺昆,宋 佳,喬 沈,郭園園,常媛媛,王興華

(山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山西太原 030006)

近幾年從日本和我國臺灣引入的酵素產(chǎn)品是保健食品中的新生力量[1]。酵素由日語對“Enzyme”的翻譯而來,因此也稱為酶,其在體內(nèi)功效與酶相近。在2016年中國生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)協(xié)會團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)[2]中規(guī)定:酵素是以動物、植物、菌類等為原料經(jīng)微生物發(fā)酵制得的含有特定生物活性成分的產(chǎn)品。酵素采用的原材料均是果品、蔬菜、食用菌等純天然食材,不含添加劑或其他化學(xué)成分,食用后通常不會產(chǎn)生不良反應(yīng),因此具有廣闊的發(fā)展前景和很大的開發(fā)價值[3]。據(jù)目前研究可知,酵素具有多種保健功能,如抗氧化性[4],輔助減肥和美容,使腸道菌群保持平衡,進(jìn)而促進(jìn)機(jī)體排便[5],除此之外，還可抑菌消炎[6],解酒保肝[7]等,而且將天然果蔬進(jìn)行發(fā)酵處理,不但可以保持果蔬中的營養(yǎng)價值，甚至還可將之提高[8-9]。

高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)由于其具有分離效率高、選擇性好、檢測靈敏度高、操作自動化等優(yōu)點(diǎn)廣泛應(yīng)用于食品和藥物分析等領(lǐng)域[10-16]。楊毅等[17]在其研究中利用反相高效液相色譜法對啤酒中多種有機(jī)酸的含量進(jìn)行了測定。鄭重等[18]也應(yīng)用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)定量測定分析出植物酵素中的多種氨基酸成分。另外還有利用HPLC對山西老陳醋[19]、傳統(tǒng)香醋[20]、鎮(zhèn)江香醋[21]、葡萄酒[22]等醋品酒品中有機(jī)酸含量的分析測定等。

酵素發(fā)酵與食醋、葡萄酒發(fā)酵相似,主要包括醋酸發(fā)酵和乳酸發(fā)酵,因而在發(fā)酵產(chǎn)物中有機(jī)酸中醋酸和乳酸居多。當(dāng)前對于酵素中有機(jī)酸成分種類及其具體含量測定方法的相關(guān)研究較少,雖然已有相關(guān)文獻(xiàn)測定了特定酵素中的有機(jī)酸含量[23-25],但是不同酵素原料及不同酵素產(chǎn)品的有機(jī)酸成分、含量有很大的差別,且不同種類的酵素樣品需要開發(fā)相應(yīng)的樣品前處理方法。因此本文對果蔬酵素樣品的前處理及色譜條件進(jìn)行了探索,旨在建立一種利用高效液相色譜法(HPLC)同時測定果蔬酵素中乳酸和醋酸的方法。本研究的內(nèi)容可以為后續(xù)其他酵素中有機(jī)酸測定及探索其功效作用等研究提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酵素原液 產(chǎn)自臨汾市態(tài)和生物科技有限公司；乳酸標(biāo)準(zhǔn)品(ρ=1.209 g/mL) Sigma-Aldrich化學(xué)公司;醋酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99.0%,ρ=1.049 g/mL) Sigma Fluka公司;甲醇(色譜純)、磷酸二氫鉀(色譜純)、磷酸氫二鉀(色譜純)、磷酸二氫銨(色譜純) 北京化工廠;娃哈哈純凈水 市售。

高效液相色譜儀(配有UV230Ⅱ紫外可見檢測器、ZW230Ⅱ色譜柱恒溫箱、P230Ⅱ高壓恒流泵兩臺、EC2006色譜數(shù)據(jù)處理工作站) 大連依利特分析儀器有限公司;色譜柱SinoChrom ODS-BP(C18:4.6 mm×150 mm,5 μm) 大連依利特分析儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液配制及樣品前處理 乳酸和醋酸標(biāo)準(zhǔn)品均為液態(tài),配制對應(yīng)工作液直接稀釋即可。乳酸與醋酸混合標(biāo)準(zhǔn)樣品配制:分別用移液槍準(zhǔn)確吸取一定量的乳酸與醋酸標(biāo)品于50 mL容量瓶中,用對應(yīng)流動相定容,混合均勻,得到乳酸和醋酸混合標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液,使得乳酸質(zhì)量濃度分別為0、302.25、604.5、906.75、1209、1511.25、1813.5、2115.75 μg/mL,醋酸的質(zhì)量濃度分別為0、302.25、604.5、906.75、1209、1511.25、1813.5、2115.75 μg/mL。

樣品預(yù)處理:取一定體積酵素原液,10000 r/min離心15 min,取上清液,用流動相(水相溶液)稀釋一定倍數(shù),過0.45 μm針筒式水膜,待用。

流動相制備:以磷酸鹽為溶質(zhì),用娃哈哈純凈水配制成流動相溶液,過0.45 μm混合纖維樹酯膜,真空抽慮后使用。

1.2.2 色譜條件的篩選

1.2.2.1 檢測波長的篩選 用紫外-可見光分光光度計于190～350 nm對乳酸和醋酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行掃描,同時參照測定有機(jī)酸相關(guān)文獻(xiàn)選擇檢測波長分別為210、215、220 nm,其余色譜條件:色譜柱SinoChrom ODS-BP(4.6 mm×150 mm,5 μm),流動相為0.02 mol/L KH2PO4,流速0.8 mL/min,進(jìn)樣量20 μL,柱溫:25 ℃。通過對比各檢測波長下的峰型,篩選出測定的最佳波長。

1.2.2.2 流動相的篩選 利用高效液相色譜法分析樣品中有機(jī)酸常采用的流動相是甲醇-磷酸鹽緩沖液或者是甲醇-硫酸[26],其中甲醇-磷酸鹽緩沖液較甲醇-硫酸對溶液的pH控制更為穩(wěn)定,效果更佳,故本實(shí)驗(yàn)中采用甲醇-磷酸鹽緩沖液作為流動相,選擇的磷酸鹽分別為NaH2PO4、KH2PO4、(NH4)H2PO4;磷酸鹽濃度設(shè)置為0.08、0.04、0.02、0.01 mol/L;參照其電離常數(shù),磷酸鹽pH設(shè)置為2.99、2.95、2.92、2.90、2.88、2.85、2.80、2.68、2.55。其余色譜條件:色譜柱SinoChrom ODS-BP(4.6 mm×150 mm,5 μm),流速0.8 mL/min,波長215 nm,進(jìn)樣量20 μL,柱溫:25 ℃。通過對比各不同流動相條件下的峰型,篩選出測定的最佳流動相及其濃度、溶液pH、流動相比例。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 按照表1配制乳酸和醋酸的混合標(biāo)準(zhǔn)樣品,進(jìn)樣前需經(jīng)針筒式微孔濾膜過濾,采用HPLC進(jìn)行測定分析?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)樣品的色譜圖見圖4。色譜條件:色譜柱SinoChrom ODS-BP(4.6 mm×150 mm,5 μm),流動相為0.01 mol/L KH2PO4(100%,溶液pH為2.88),流速0.8 mL/min,波長215 nm,柱溫25 ℃,進(jìn)樣量20 μL。在測定中另做兩組平行。分別以乳酸和醋酸標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo),以色譜峰面積為縱坐標(biāo),繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 精密度與重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.2.4 酵素原液樣品中乳酸和醋酸的測定 按照1.2.1中樣品預(yù)處理得到待測液,測定的色譜條件同1.2.3。

1.2.5 樣品精密度與重復(fù)性測定 平行處理6組樣品,進(jìn)行精密度與重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 樣品加標(biāo)回收率測定 按照1.2.1中樣品預(yù)處理平行處理3組樣品,分別加入兩種不同濃度的醋酸和乳酸標(biāo)準(zhǔn)系列溶液,進(jìn)行乳酸和醋酸加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn),平行3組,取平均值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Origin 8.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計算分析方法的回收率、標(biāo)準(zhǔn)偏差、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差等。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的篩選

2.1.1 檢測波長的篩選 對乳酸和醋酸利用紫外-可見光分光光度計進(jìn)行掃描后,確定其最大吸收波長范圍,選擇210、215、220 nm三種檢測波長對其進(jìn)行測定分析,待測物響應(yīng)值的大小與色譜圖中的吸光度大小相對應(yīng)。從圖1可以看出,隨著波長增加,其響應(yīng)值降低,但峰型相對越好。其中波長215 nm條件下的峰型與220 nm條件下的峰型相當(dāng),而其響應(yīng)值相對比較大,故選擇215 nm作為檢測波長。

圖1 不同檢測波長下乳酸與醋酸的譜圖

2.1.2 流動相的篩選 選擇甲醇-磷酸鹽緩沖液為流動相,在確定流動相水相和有機(jī)相比例時發(fā)現(xiàn),當(dāng)流動相為純磷酸鹽溶液時,色譜分析效果更佳,基線相對平穩(wěn),故選擇單一流動相即磷酸鹽進(jìn)行測定分析。選擇的磷酸鹽分別為NaH2PO4、KH2PO4、(NH4)H2PO4。從圖2可以看出,KH2PO4和NaH2PO4兩組的譜圖幾乎是重合的,(NH4)H2PO4組的譜圖保留時間略遲,三組的峰型都比較好。結(jié)合重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用KH2PO4重復(fù)性更好,故選擇KH2PO4為流動相。

圖2 不同磷酸鹽條件下乳酸與醋酸的譜圖

選擇四個不同濃度的KH2PO4溶液作為流動相進(jìn)行測定分析,從圖3中可以看出各乳酸和醋酸均能得到分離,且鹽濃度對分離效果影響不大。考慮到鹽濃度高會縮短泵和柱子的使用壽命[26],所以本實(shí)驗(yàn)選用的磷酸鹽濃度為0.01 mol/L。

圖3 不同KH2PO4溶液濃度下乳酸與醋酸的譜圖

在篩選磷酸鹽pH時的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示,pH范圍在2.55～2.99之間乳酸和醋酸能較好的分離,乳酸和醋酸的保留時間隨著磷酸鹽pH的增大而普遍減小,分離效果和色譜峰型相近。但pH為2.85的分離效果相對更好,結(jié)合考慮到色譜柱的pH使用范圍等因素,本實(shí)驗(yàn)選擇流動相pH為2.88。故流動相最佳條件為0.01 mol/L、pH2.88的KH2PO4溶液。

2.2 乳酸與醋酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

利用HPLC在篩選出的色譜條件下對乳酸和醋酸的混合標(biāo)品進(jìn)行測定,得到乳酸和醋酸混合標(biāo)品的色譜圖見圖4,乳酸和醋酸標(biāo)準(zhǔn)曲線如下圖5和圖6。

圖4 乳酸與醋酸混合標(biāo)品的譜圖

圖5 乳酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖6 醋酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4為乳酸與醋酸混合標(biāo)準(zhǔn)樣品的色譜圖。以乳酸標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo),乳酸色譜峰對應(yīng)的峰面積的平均值為縱坐標(biāo),繪制混合標(biāo)準(zhǔn)樣品中乳酸標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖5),得到線性回歸方程y=0.3102x-0.7825,相關(guān)系數(shù)R2=0.9996。表明乳酸在0～2100 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。同理得到混合標(biāo)準(zhǔn)樣品中醋酸標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖6),得到線性回歸方程y=1.1394x-10.277,相關(guān)系數(shù)R2=0.9992。表明醋酸在0～1800 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 酵素原液樣品中乳酸和醋酸的測定

本實(shí)驗(yàn)中,最初開始,酵素原液樣品經(jīng)離心處理后過濾膜直接進(jìn)樣,但乳酸與醋酸在圖譜中的分離效果不佳,易受樣液中其他雜質(zhì)干擾,于是考慮將樣品進(jìn)行稀釋。在稀釋樣品時,選用對應(yīng)水相流動相即磷酸鹽溶液進(jìn)行稀釋,選擇稀釋倍數(shù)2、5、8、10,隨著稀釋倍數(shù)變大,有機(jī)酸的分離效果越好,雜質(zhì)峰顯著減少,當(dāng)稀釋倍數(shù)達(dá)到10倍時,乳酸和醋酸的峰型都比較好,因此,本實(shí)驗(yàn)中選擇將樣品用水相流動相稀釋10倍后過0.45 μm針筒式濾膜,再進(jìn)行測定分析。樣品中乳酸與醋酸測定色譜圖見圖7。

圖7 樣品中乳酸與醋酸測定色譜圖

2.4 樣品精密度與重復(fù)性測定

對樣品進(jìn)行精密度與重復(fù)性實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

采用HPLC測定分析酵素原液樣品中乳酸與醋酸含量,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.99%和1.21%,結(jié)果表明儀器和方法的精密度均良好。

2.5 樣品加標(biāo)回收率測定

對樣品進(jìn)行乳酸和醋酸加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2。

表2 樣品加標(biāo)回收率

從表2中可知,該酵素原液中乳酸的加標(biāo)回收率均在95%之上,醋酸的平均加標(biāo)回收率略微偏低,可能是由于乙酸具有揮發(fā)性,在樣品處理中易受損失[17]。結(jié)果表明,同時測定酵素原液中乳酸和醋酸的HPLC法重現(xiàn)性比較好。

3 結(jié)論

通過對檢測波長、流動相及其濃度和pH的篩選,確定的利用HPLC法同時測定酵素原液中乳酸與醋酸含量的色譜條件為:色譜柱SinoChrom ODS-BP(4.6 mm×150 mm,5 μm),流動相為0.01 mol/L、pH2.88的KH2PO4溶液,流速0.8 mL/min,波長215 nm,進(jìn)樣量20 μL,柱溫:25 ℃?；旌嫌袡C(jī)酸中,乳酸在0～2100 μg/mL(0～2.1 mg/mL)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)R2=0.9996,樣品精密度(n=6)為0.99%,樣品平均加標(biāo)回收率99.26%。醋酸在0～1800 μg/mL(0～1.8 mg/mL)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)R2=0.9992,樣品精密度(n=6)為1.21%,樣品平均加標(biāo)回收率94.26%。酵素原液樣品則需要根據(jù)實(shí)際形況進(jìn)行離心和稀釋。

本文所建立的利用高效液相色譜法同時對酵素原液中乳酸和醋酸進(jìn)行定性和定量分析的方法操作簡單快捷,儀器和方法的精密度和重復(fù)性良好,對后續(xù)酵素中有機(jī)酸種類和含量的相關(guān)檢測有一定的可參考價值。雖然當(dāng)前國內(nèi)食用酵素產(chǎn)品比較風(fēng)行,但目前我國對酵素的研究主要是功能性成分含量測定以及其藥食方面的保健功能等。而產(chǎn)品質(zhì)量檢測與監(jiān)督、相關(guān)制度標(biāo)準(zhǔn)等方面并不完善,具備正規(guī)認(rèn)證或者獲得批文的產(chǎn)品很少[27]。因而,可以說國內(nèi)食用酵素產(chǎn)品多,但是質(zhì)量得不到保障。國家與相關(guān)機(jī)構(gòu)需要不斷加強(qiáng)產(chǎn)品質(zhì)量管理,對產(chǎn)品生產(chǎn)工藝安全進(jìn)行監(jiān)管,保障食用酵素產(chǎn)品的質(zhì)量,才能夠?qū)崿F(xiàn)持續(xù)性發(fā)展[28]。

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