Box-Behnken法優(yōu)化雙酶協(xié)同水解牡蠣蛋白工藝

高雅鑫,楊 森,李雨恬,李 點(diǎn),魏梟雄,淑 英,張志勝

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,河北保定 071000)

牡蠣俗稱海蠣子、生蠔等,俗稱“海里的牛奶”，是唯一可生吃的貝類,不僅肉質(zhì)鮮美,而且營養(yǎng)豐富,富含?；撬?、多糖等多種生物活性物質(zhì),是我國衛(wèi)生部第一批批準(zhǔn)的食藥兩用的功能性療效品[1],具有抗菌、降血壓和抗氧化等生物活性[2-6]。但由于牡蠣存在易腐難保鮮、深加工技術(shù)及利用率低,嚴(yán)重限制了牡蠣養(yǎng)殖業(yè)的高產(chǎn)值的發(fā)展。通過生物技術(shù)降解蛋白質(zhì)不僅可以提高蛋白質(zhì)的利用率,還能提取出豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和功能性成分。

目前對牡蠣多采用單酶水解法,但在酶解中常存在氨基酸態(tài)氮含量低、風(fēng)味欠佳等問題,為了提高牡蠣酶解液中氨基態(tài)氮含量低的問題,本實(shí)驗(yàn)采用中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶協(xié)同酶解牡蠣,利用Box-Behnken法對牡蠣酶解工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,得到了牡蠣雙酶協(xié)同酶解的最佳工藝參數(shù),降低了生產(chǎn)成本,為牡蠣的深加工和綜合利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牡蠣 購自秦皇島嘉輝水產(chǎn)食品有限公司;中性蛋白酶(酶活6萬U/g)、堿性蛋白酶(酶活10萬U/g)、酸性蛋白酶(酶活19萬U/g)、木瓜蛋白酶(酶活50萬U/mg)、胰蛋白酶(酶活250 NF/mg)、風(fēng)味蛋白酶(酶活20 U/mg) 均購自南寧東恒華道生物科技有限責(zé)任公司;乙腈(色譜純)、乙酸、乙酸鈉、2,4-二硝基氟苯、甲醛(37%)、鹽酸、氫氧化鈉等 均購自北京康普匯維科技有限公司;所用試劑 均為分析純。

HH-4電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器公司;PHS-25臺式pH計(jì)、CP64電子天平、JD-TGL20MW臺式離心機(jī) 昆山吉和力儀器有限公司;79-1磁力攪拌器、JJ-2組織搗碎勻漿機(jī) 江蘇省金壇市友聯(lián)儀器研究所;7890A-5975C型高效液相色譜儀 美國Agilent公司;Symmetry Column C18(4.6 mm×250 mm×5 μm)色譜柱 美國Waters公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 牡蠣的酶解工藝流程及操作要點(diǎn) 牡蠣→流水解凍→搗碎→10 g勻漿→1∶6的比例加蒸餾水,調(diào)節(jié)pH為7.0→酶解(酶解溫度為50 ℃,時間為3 h,酶添加量5%)→加熱至100 ℃→滅酶15 min→水浴冷卻→靜置→5000 r/min離心20 min→獲得上清液[7]。

1.2.2 單酶酶解篩選實(shí)驗(yàn) 取牡蠣流水解凍,用組織搗碎機(jī)將牡蠣肉勻漿,然后取定量的勻漿,按照1∶6的比例加蒸餾水,在六種酶的最適作用條件下進(jìn)行酶解,酶解一定的時間,100 ℃滅活10 min,水浴冷卻靜置后,4000 r/min離心15 min,取上清液,六種蛋白酶的最適作用條件如表1。

表1 六種蛋白酶的酶解條件

1.2.3 牡蠣雙酶協(xié)同酶解單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 考察中性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶的添加量之比對雙酶協(xié)同酶解效果的影響 中性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶的添加量之比分別為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5,提取條件為pH7.0、溫度50 ℃、酶解2 h、加酶總量為勻漿的5%時,比較不同添加量之比對酶解效果的影響[8-9]。

1.2.3.2 考察不同加酶量對雙酶協(xié)同酶解效果的影響 加酶總量分別為2%、3%、4%、5%、6%,提取條件為pH7.0、溫度50 ℃、酶解2 h、添加量之比1∶1時,比較不同加酶總量對酶解效果的影響。

1.2.3.3 考察不同pH對雙酶協(xié)同酶解效果的影響 提取條件為溫度50 ℃、酶解2 h、加酶總量5%、添加量之比1∶1時,pH分別為5.0、6.0、7.0、8.0和9.0時,比較不同pH對酶解效果的影響。

1.2.3.4 考察不同酶解時間對雙酶協(xié)同酶解效果的影響 酶解時間分別為1、2、3、4、5 h,提取條件為溫度50 ℃、加酶總量5%、添加量之比1∶1,pH7.0時,比較不同酶解時間對酶解效果的影響。

1.2.3.5 考察不同溫度對雙酶協(xié)同酶解效果的影響 酶解溫度分別為30、40、50、60、70 ℃,提取條件為pH7.0、酶解2 h、加酶總量5%、添加量之比1∶1時,比較不同酶解溫度對酶解效果的影響。

1.2.4 雙酶協(xié)同酶解工藝參數(shù)的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)Box-Behnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[10],在雙酶協(xié)同酶解牡蠣單因素的基礎(chǔ)上,選取與酶解效果密切相關(guān)的三個影響因素:溫度、pH、加酶量,以氨基氮含量為響應(yīng)值,每個因素選取三個對酶解效果影響較大的水平,建立三因素三水平的Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)因素水平如表2所示。

表2 響應(yīng)面分析因素水平編碼

1.2.5 酶解液的指標(biāo)檢測

1.2.5.1 牡蠣酶解液的氨基氮測定 采用甲醛電位滴定法測定牡蠣酶解液中氨基氮含量[12]。

1.2.5.2 牡蠣酶解液感官分值評定 通過20人的感官鑒評小組對酶解液的澄清度、色澤、腥味及苦味等感官特性指標(biāo)進(jìn)行感官評分[13],感官評定表見表3，之后將相應(yīng)的評分總和,取其平均值,對六種蛋白酶進(jìn)行比較,得到適宜的兩種蛋白酶進(jìn)行協(xié)同酶解。在本試驗(yàn)中，主要是以氨基氮含量作為評價指標(biāo)進(jìn)行酶解條件優(yōu)化，故感官評定僅作為篩選蛋白酶時的參考指標(biāo)。

表3 牡蠣酶解液的感官評定

1.2.5.3 牡蠣酶解液游離氨基酸測定 采用2,4-二硝基氯苯HPLC法分析牡蠣酶解液進(jìn)行游離氨基酸含量測定。儀器及色譜條件:色譜柱:Symmetry Column C18(4.6 mm×250 mm×5 μm);紫外檢測器的波長360 nm;流動相A為純乙腈,流動相B為pH6.40的乙酸-乙酸鈉緩沖液,洗脫條件如表4;流速為1.0 mL/min;柱溫40 ℃;進(jìn)樣量10 μL。

表4 梯度洗脫程序

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Design Expert軟件進(jìn)行相應(yīng)的數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一品種蛋白酶的酶解效果比較

單一品種蛋白酶的酶解液中氨基氮含量與感官評定分值的比較見圖1和圖2。用木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解,氨基氮含量最小,用中性蛋白酶進(jìn)行酶解,氨基氮含量最大,其中用風(fēng)味蛋白酶酶解得到的氨基氮含量較高;另一方面,堿性蛋白酶條件下感官分值最低,風(fēng)味蛋白酶條件下感官分值最高,其中中性蛋白酶條件下感官結(jié)果處于中等水平。用中性蛋白酶氨基氮含量較高,常用于提取海洋生物的生物活性物質(zhì),但中性蛋白酶的酶解液在色澤和腥味方面不太理想,因此選用感官評價較高的風(fēng)味蛋白酶與其協(xié)同酶解,在色澤和腥味上加以調(diào)節(jié),并且有利于一些呈味氨基酸的游離,從而達(dá)到酶解液感官特性的改善。綜合考慮兩指標(biāo),確定選擇中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶兩種單酶對牡蠣進(jìn)行協(xié)同酶解相對較好。

圖1 不同蛋白酶的酶解效果

圖2 不同蛋白酶的感官評定分

2.2 牡蠣雙酶協(xié)同酶解單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 牡蠣雙酶協(xié)同酶解中性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶添加量之比的確定 圖3可知,中性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶的比例由1∶1上升到1∶5的過程中,酶解液中氨基氮含量不斷下降,從而說明風(fēng)味蛋白酶所占的比例越大,在牡蠣雙酶協(xié)同酶解的效果上越不好,也表明風(fēng)味蛋白酶的主要作用在于改善呈味,對提取氨基氮所起作用較小。因此在酶解液中氨基氮含量的問題上,選擇中性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶添加量之比為1∶1。

圖3 不同添加量之比對酶解效果的影響

2.2.2 牡蠣雙酶協(xié)同酶解加酶總量的確定 由圖4可知,隨著加酶總量的增大,氨基氮含量雖然有所上升,但是上升趨勢較緩且逐漸趨于平穩(wěn),當(dāng)加酶總量達(dá)到5%時,僅僅有微小的上升趨勢?？紤]到成本節(jié)約以及后期處理的問題,不宜過度添加蛋白酶,因此選擇5%作為Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的一個中心點(diǎn)。

圖4 不同添加量對酶解效果的影響

2.2.3 牡蠣雙酶協(xié)同酶解pH的確定 不同的pH條件下,酶制劑顯示出不同的酶活力,不適宜的pH會導(dǎo)致酶的空間構(gòu)象發(fā)生改變,當(dāng)遇到極端pH時甚至可能導(dǎo)致酶失活;酶解體系的pH還決定了底物與酶的結(jié)合狀態(tài),促進(jìn)或抑制酶制劑與底物的結(jié)合,從而影響蛋白質(zhì)的水解程度[14]。由圖5可知,pH由5.0上升到9.0的過程中,在pH達(dá)到7.0時,氨基氮含量到一個最大值,pH<7.0時,氨基氮含量隨著pH的升高而上升;但pH>7.0時,氨基氮含量呈下降趨勢。因此選擇pH為7.0作為Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的一個中心點(diǎn)。

圖5 不同pH對酶解效果的影響

2.2.4 牡蠣雙酶協(xié)同酶解時間的確定 由圖6可知,酶解時間由1 h上升到5 h的過程中,氨基氮含量隨著酶解時間的增加有明顯上升,但酶解時間達(dá)到3 h后,氨基氮含量幾乎不再有變化,考慮到時間成本,故選擇最佳協(xié)同酶解時間為3 h。

圖6 不同時間對酶解效果的影響

2.2.5 牡蠣雙酶協(xié)同酶解溫度的確定 由圖7可知,當(dāng)酶解溫度達(dá)到50 ℃左右時,氨基氮含量達(dá)到一個最大值,溫度由30 ℃升至50 ℃,氨基氮含量也隨之升高,但當(dāng)溫度高于50 ℃時,氨基氮含量卻隨之下降,說明蛋白酶存在最適酶解溫度,只有在兩種蛋白酶的最適溫度范圍內(nèi),才能達(dá)到較好的酶解效果,溫度過高,易引起部分酶失去生物催化活性,不利于酶解反應(yīng)。因此,選擇50 ℃作為Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的一個中心點(diǎn)。

圖7 不同溫度對酶解效果的影響

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果分析

2.3.1 響應(yīng)模型的建立與數(shù)據(jù)分析 由Design Expert統(tǒng)計(jì)分析軟件設(shè)計(jì)出的實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果如表5所示,以氨基氮含量為響應(yīng)值,以酶解溫度(A)、加酶量(B)、pH(C)為自變量,建立三因素三水平的Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),共包括17個實(shí)驗(yàn)方案。根據(jù)表5的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,用Design Expert軟件對A、B、C三因素進(jìn)行二次多元回歸擬合,得到二次多項(xiàng)回歸方程:Y=8.09+0.063A+0.14B+0.11C+2499.87AB+0.11AC+0.038BC-0.15A2-0.15B2-0.19C2;R2=0.9728。

表5 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表6可知,該模型F值為32.36,p<0.0001,說明該模型有極顯著意義,失擬項(xiàng)(p>0.05)差異不顯著,說明其他未知因素對酶解效果干擾極小,模型相對穩(wěn)定,擬合程度較高,該模型R2=0.9728,表明該模型擬合程度良好,實(shí)驗(yàn)誤差小,適合對牡蠣蠣酶解中氨基氮含量進(jìn)行分析和預(yù)測,可較好地預(yù)測牡蠣協(xié)同酶解液中氨基氮含量的變化。在該回歸模型中,一次項(xiàng)A對協(xié)同酶解影響顯著,B與C對協(xié)同酶解影響極顯著;二次項(xiàng)A2、B2、C2對協(xié)同酶解均有極顯著影響;交互項(xiàng)AB與BC對協(xié)同酶解影響不顯著,而溫度與pH交互項(xiàng)AC對協(xié)同酶解影響顯著。

表6 回歸模型方差分析結(jié)果

2.3.2 響應(yīng)曲面的交互效應(yīng)分析 酶解溫度、加酶量以及酶解pH三因素之間的相互作用對響應(yīng)值的影響如圖8所示。響應(yīng)曲面圖彎曲程度的高低,可反映兩因素交互作用對響應(yīng)值的影響程度,一般彎曲程度越高,即坡度越陡,說明兩因素的作用越顯著。

由圖8可知,氨基氮含量隨著酶解溫度和pH的增加先增后減,先增加可能由于未達(dá)到最適的溫度和pH范圍內(nèi),蛋白酶活力發(fā)揮有限,之后減少可能由于過熱、過酸、過堿導(dǎo)致蛋白酶失去活力,從而氨基氮含量下降。結(jié)合曲面圖及方程中交互項(xiàng)的顯著性分析,說明,溫度和pH的交互作用相比加酶量與溫度、加酶量與pH的交互作用較強(qiáng)。

圖8 兩因素之間相互作用的響應(yīng)面圖

2.3.3 最優(yōu)酶解工藝參數(shù)確定 在Box-Behnken分析法的基礎(chǔ)上,由回歸模型計(jì)算得出的最優(yōu)酶解參數(shù)為:酶解溫度51.74 ℃、加酶總量4.70%、酶解pH7.42,氨基態(tài)氮的含量為8.162 mg/g。為了檢驗(yàn)響應(yīng)面的分析結(jié)果與實(shí)際結(jié)果的一致性以及便于操作和控制各項(xiàng)參數(shù),對參數(shù)進(jìn)行調(diào)整后進(jìn)行了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),在溫度51.7 ℃、加酶總量4.7%、pH7.4、雙酶的添加量之比1∶1的條件下酶解3 h,并進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn),得出的平均氨基氮含量為8.197 mg/g,其標(biāo)準(zhǔn)差SD值為0.0042。與理論值接近,說明優(yōu)化結(jié)果良好,可知該模型預(yù)測的準(zhǔn)確度較高。

2.4 游離氨基酸的種類及含量

采用HPLC法對牡蠣協(xié)同酶解液中游離氨基酸含量進(jìn)行測定,所得結(jié)果如表7所示。通過表7可知,酶解液中異亮氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸含量較少,而絲氨酸、組氨酸、精氨酸等氨基酸含量較高。除普通的氨基酸外,酶解液中還含有?；撬醄15-18](0.209 mg/g)。WHO/FAO標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定人體中的必需氨基酸占總氨基酸的40%,非必需氨基酸60%。當(dāng)食物中這兩者越接近此值,營養(yǎng)價值相對越高。從表7可知,雙酶協(xié)同酶解液中必需氨基酸的百分比含量基本符合WHO/FAO標(biāo)準(zhǔn)氨基酸模式。說明酶解液中的游離氨基酸符合人體的必需氨基酸代謝要求。

表7 HPLC法測定牡蠣酶解液中游離氨基酸含量

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以牡蠣為原料,以中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶協(xié)同酶解牡蠣,建立了以氨基氮含量為響應(yīng)值,以加酶量、pH、溫度三因素為自變量的數(shù)學(xué)模型,優(yōu)化了雙酶協(xié)同酶解牡蠣的工藝參數(shù),確定在酶解溫度51.7 ℃、加酶量4.7%、酶解pH7.4的條件下,所獲得酶解液其氨基態(tài)氮的含量為8.197 mg/g，與理論值接近,說明優(yōu)化結(jié)果良好。在該酶解條件下,不僅保存了牡蠣酶解液中的營養(yǎng)成分,氨基酸種類豐富,幾乎包含所有的必需氨基酸種類,能夠滿足人體所需的各種氨基酸,為牡蠣的深加工和綜合利用提供一定的理論依據(jù)。

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