基質(zhì)分散固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測動(dòng)物源性食品中硝基咪唑藥物及其代謝物

方 力, 邱鳳梅, 余新威, 張志超

(1. 浙江省海產(chǎn)品健康危害因素關(guān)鍵技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 舟山市疾病預(yù)防控制中心, 浙江 舟山 316021; 2. 岱山縣疾病預(yù)防控制中心, 浙江 岱山 316200)

硝基咪唑類藥物是一類抗生素和抗原蟲藥,主要用于預(yù)防和治療家禽組織滴蟲病、球蟲病以及豬出血性腸炎等疾病,其作為獸藥廣泛應(yīng)用于畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。硝基咪唑類藥物主要包括甲硝唑(metronidazole, MNZ)、二甲硝基咪唑(dimetridazole, DMZ)、洛硝噠唑(ronidazole, RNZ)、奧硝唑(ornidazole, ONZ)、替硝唑(tinidazole, TNZ)、塞克硝唑(secnidazole, SNZ)和甲硝唑的代謝物羥基甲硝唑(hydroxyl metronidazole, MNZ-OH)以及二甲硝基咪唑和洛硝噠唑的共同代謝物1-甲基-5-硝基-2-羥甲基咪唑(2-hydroxymethyl-1-methyl-5-nitroimidazole, HMMNI)等。然而這些化合物被認(rèn)為可能對人類產(chǎn)生致癌、致畸、致突變作用,已被美國和歐盟國家禁止使用[1,2]。我國農(nóng)業(yè)部將二甲硝基咪唑和甲硝唑列為允許作治療用、但不得在動(dòng)物源性食品中檢出的獸藥[3]。因此,為了進(jìn)一步加強(qiáng)相關(guān)食品安全問題的監(jiān)管,開發(fā)簡單、準(zhǔn)確、快速檢測動(dòng)物源性食品中硝基咪唑類藥物及其代謝物的方法顯得十分必要。

目前,硝基咪唑類藥物殘留的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫法[4-6]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[7,8]、毛細(xì)管電泳法[9]、高效液相色譜法[10,11]及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[1,2,12-15]。酶聯(lián)免疫法易產(chǎn)生假陽性或者假陰性結(jié)果,一般用于常規(guī)大批量快速篩查;氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法需要衍生化,實(shí)驗(yàn)條件要求嚴(yán)格;毛細(xì)管電泳法、液相色譜法靈敏度相對較低;液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)具有選擇性好、靈敏度高等優(yōu)勢。當(dāng)前關(guān)于食品中硝基咪唑類藥物殘留檢測的前處理手段主要有固相萃取凈化法、分子印跡凈化法等[1,2,12-15]。常規(guī)固相萃取凈化法存在溶劑消耗量大、使用成本高等缺陷;分子印跡凈化法盡管凈化效果好,但也存在操作要求高、制備時(shí)間長等缺陷。近年來,分散固相萃取技術(shù)(dispersive solid phase extraction, dSPE)廣泛應(yīng)用于多種類樣品的前處理,該凈化手段具有快速、高效、操作簡單、成本低等特點(diǎn),可實(shí)現(xiàn)高通量檢測[16-18]。

本研究采用基質(zhì)分散固相萃取技術(shù)結(jié)合HPLC-MS/MS,建立了測定雞蛋、雞肉、魚肉和豬肉等動(dòng)物源性食品中8種硝基咪唑類藥物及其代謝物殘留的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

TSQ Vantage三重四極桿質(zhì)譜儀(配有電噴霧離子(ESI)源)、Ultimate 3000超高效液相色譜儀(美國Thermo公司); Allegra X-15R型高速冷凍離心機(jī)、Microfuge 20型微量高速離心機(jī)(美國Beckman公司); DMT-2500型多管渦旋混合器(杭州米歐儀器公司); GM200型刀式研磨儀(德國Retsch公司); Milli-Q(18.2 MΩ5cm)超純水處理系統(tǒng)(德國Merck公司)。

標(biāo)準(zhǔn)品:MNZ、DMZ、HMMNI、RNZ、ONZ、TNZ、氘代甲硝唑(MNZ-D4)、氘代替硝唑(TNZ-D5)均購自德國Dr. Ehrenstorfer公司;SNZ購自日本TCI公司;MNZ-OH購自德國Witega公司,標(biāo)準(zhǔn)品純度均≥98%;甲酸(LC-MS級)、乙酸乙酯(色譜純)和乙腈(色譜純)均購自德國CNW公司。

乙二胺基-N-丙基硅烷填料CNWBOND PSA(40～63 μm)購自德國CNW公司;孔徑0.22 μm親水聚四氟乙烯(PTFE)濾膜購自上海安譜有限公司。超純水由Milli-Q超純水系統(tǒng)制得。

1.2 樣品前處理

1.2.1樣品采集

雞肉、雞蛋、豬肉、羅非魚肉均購自當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場或超市,取500 g基質(zhì)樣品經(jīng)刀式研磨儀均質(zhì)后,于-20 ℃冷凍保存,待用。

1.2.2提取

準(zhǔn)確稱取(2.00±0.01) g均質(zhì)后樣品,置于50 mL聚丙烯離心管中,加入10 mL乙酸乙酯,渦旋混合10 min,超聲提取10 min,以8 000 r/min離心5 min,移取上清液至另一25 mL離心管中,再向殘?jiān)屑尤?0 mL乙酸乙酯,重復(fù)以上提取步驟,合并提取液,于40 ℃水浴下氮吹至近干,用2 mL 0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸水溶液溶解,待凈化。

1.2.3凈化

向提取液中加入4 mL正己烷,渦旋混勻1 min,以8 000 r/min離心5 min,棄去正己烷層,移取1.0 mL提取液,置于已裝有(50±3) mg PSA粉末的離心管中,渦旋混勻1 min,以15 000 r/min離心5 min,上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾,注入樣品瓶中,備用。

稱取不含目標(biāo)化合物的基質(zhì)樣品于離心管中,按照上述步驟進(jìn)行提取和凈化,得到空白基質(zhì)溶液。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取8種硝基咪唑類藥物及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)品,用乙腈溶解,配制成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別移取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,用0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸水溶液稀釋,配制成1.0 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)中間液;最后用空白基質(zhì)溶液配制成質(zhì)量濃度為2、5、10、20和40 μg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4 分析條件

色譜柱:Hypersil GOLD C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.9 μm,美國Thermo公司);柱溫:30 ℃;流動(dòng)相:A為0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸水溶液,B為乙腈;流速:0.3 mL/min。梯度洗脫程序:0～2.0 min, 8%B; 2.0～7.0 min, 8%B～70%B; 7.0～7.2 min, 70%B～8%B; 7.2～10.0 min, 8%B。進(jìn)樣量:10 μL。

離子源:電噴霧離子(ESI)源,正離子模式;掃描模式:選擇反應(yīng)監(jiān)測(SRM)模式;離子傳輸溫度:325 ℃;噴霧電壓:3.0 kV;汽化溫度:300 ℃;鞘氣(氮?dú)?壓力:45 arb;輔助氣(氮?dú)?壓力:15 arb;碰撞氣:高純氬氣,壓力0.2 Pa。8種硝基咪唑類藥物及其代謝物的其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表 1 硝基咪唑類藥物及其代謝物的質(zhì)譜參數(shù)

*Quantitative ion.

2 結(jié)果與討論

2.1 分析條件的優(yōu)化

2.1.1色譜條件的優(yōu)化

硝基咪唑類藥物及其代謝物是一種中等極性化合物,已有文獻(xiàn)[1,2]證實(shí)反相色譜柱更適合該類化合物的分離與檢測。本實(shí)驗(yàn)比較了Hypersil GOLD C18(100 mm×2.0 mm, 1.9 μm)和Hypersil GOLD aQ(100 mm×2.0 mm, 1.9 μm)反相色譜柱對目標(biāo)化合物的分離效果。結(jié)果顯示,與Hypersil GOLD aQ色譜柱相比,Hypersil GOLD C18色譜柱對目標(biāo)化合物的分離效果更好,色譜峰峰形更尖銳。

本研究還比較了0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸水-乙腈與含5 mmol/L甲酸銨的0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸水-乙腈兩個(gè)流動(dòng)相體系對目標(biāo)化合物分離效果的影響。結(jié)果顯示,當(dāng)流動(dòng)相體系中加入甲酸銨后,部分目標(biāo)物的色譜峰出現(xiàn)峰展寬的現(xiàn)象,響應(yīng)強(qiáng)度下降。綜上所述,本研究采用Hypersil GOLD C18色譜柱,0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸水-乙腈作為流動(dòng)相分離待測組分，此時(shí)目標(biāo)化合物能較好地實(shí)現(xiàn)分離，其色譜圖見圖1。

圖 1 在SRM模式下硝基咪唑類藥物及其代謝物的色譜圖Fig. 1 Chromatograms of the nitroimidazoles and their metabolites in the selected reaction monitoring (SRM) mode

2.1.2質(zhì)譜條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)中以1.0 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)中間液為對象,采用流動(dòng)注射的方式在ESI+模式下進(jìn)行質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化。選擇干擾小、信噪比大的離子對作為定性或定量離子對。優(yōu)化后的透鏡電壓、碰撞能量、定性和定量離子對見表1。選出的離子對數(shù)量符合歐盟EC/657指令中利用質(zhì)譜方法對藥物殘留進(jìn)行確證時(shí)必須滿足4個(gè)識別點(diǎn)的要求(母離子為1個(gè)識別位點(diǎn),特征子離子為1.5個(gè)識別位點(diǎn))。

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.2.1提取條件的優(yōu)化

硝基咪唑類化合物的提取試劑一般為乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷和甲醇等,本文對比了分別采用甲醇、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯、二氯甲烷-乙腈(1∶1, v/v)時(shí)目標(biāo)化合物的提取效率(見圖2)。可以看出,提取溶劑對MNZ-OH提取回收率的影響最為明顯,采用乙酸乙酯提取時(shí),回收率最高,為90.7%;提取溶劑對其他目標(biāo)化合物的影響不顯著。實(shí)際樣品存在大量水溶性化合物,乙腈、甲醇等溶劑易溶于水,容易將水溶性雜質(zhì)帶入提取液中;采用乙酸乙酯萃取,大部分親水性雜質(zhì)被去除,可降低后續(xù)凈化的難度。因此,本研究選用乙酸乙酯作為提取溶劑。

圖 2 提取溶劑對硝基咪唑類藥物及其代謝物回收率的影響(n=3)Fig. 2 Effects of extraction solvents on the recoveries of the nitroimidazoles and their metabolites (n=3)

2.2.2凈化條件的優(yōu)化

動(dòng)物源性食品中的脂肪含量較高,樣品經(jīng)有機(jī)溶劑提取后,大部分脂肪被提取出來。對樣品提取液中脂肪的去除是樣品前處理過程中非常重要的步驟。本研究考察了正己烷、石油醚、環(huán)己烷3種溶劑對脫脂凈化效果的影響。結(jié)果顯示,3種脫脂溶劑都能達(dá)到較好的凈化效果，雞蛋基質(zhì)樣品的變化尤其明顯。雞蛋基質(zhì)中含有大量脂溶性色素,樣品提取液呈黃色,經(jīng)脫脂溶劑凈化后,樣品溶液變?yōu)闊o色透明。綜合考慮脫脂溶劑的毒性和使用成本,本研究采用最常用的正己烷作為脫脂溶劑。

基質(zhì)分散固相萃取是一種簡單高效的凈化方法,其原理是利用固體吸附劑選擇性吸附雜質(zhì)從而達(dá)到凈化樣品的目的。吸附劑的選擇是dSPE的一個(gè)最重要參數(shù)。C18填料是一種憎水硅膠基吸附劑,其對非極性化合物具有很強(qiáng)的吸附性能;HLB填料是一種以改性的二乙烯基苯聚合物為基質(zhì)的吸附劑,其親水-親脂平衡性能的設(shè)計(jì)適用于酸性、堿性和中性化合物的凈化;石墨化炭黑(GCB)具有六元環(huán)結(jié)構(gòu),因此與平面分子具有很強(qiáng)的親和力,適用于多種有機(jī)化合物的提取和凈化,特別適用于從各種基質(zhì)中分離和除去有色物質(zhì)和固醇類等。PSA填料的主要成分是乙二胺-N-丙基硅烷,能與樣品中有機(jī)酸、色素、金屬離子、酚類化合物結(jié)合以去除基質(zhì)中的相關(guān)干擾物。本研究考察了CNWBOND HC-C18(40～63 μm)、Poly-Sery HLB(20～120 μm)、CNWBOND Carbon-GCB(37～125 μm)和CNWBOND PSA(40～63 μm)吸附劑對硝基咪唑類藥物及其代謝物的吸附情況。如圖3所示,GCB和HLB填料對目標(biāo)化合物的吸附作用較強(qiáng),目標(biāo)化合物的回收率小于50%; C18填料對目標(biāo)物也產(chǎn)生了一定的吸附作用,且離心后部分C18填料仍處于懸浮狀態(tài),對后續(xù)取樣造成了困難;采用PSA吸附劑時(shí)目標(biāo)物的回收率最高。因此實(shí)驗(yàn)最終選用PSA吸附劑。

實(shí)驗(yàn)還對比了不同PSA吸附劑用量(25、50、100和200 mg)對目標(biāo)化合物回收率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),除采用25 mg PSA吸附劑產(chǎn)生的凈化效果較差外,不同PSA吸附劑用量對硝基咪唑類藥物及其代謝物回收率的影響并不明顯。因此最終確定PSA吸附劑用量為50 mg。

圖 3 吸附劑對硝基咪唑類藥物及其代謝物回收率的影響Fig. 3 Effects of adsorbents on the recoveries of the nitroimidazoles and their metabolites GCB: graphitized carbon black; HLB: hydrophilic-lipophilic balance; PSA: primary-secondary amine.

圖 4 分散基質(zhì)固相萃取前后目標(biāo)化合物的峰面積Fig. 4 Peak areas of the target compounds before and after dispersive solid phase extraction (dSPE)

為了證明PSA吸附劑的凈化效果,本研究比較了在凈化前后4種不同動(dòng)物源性食品基質(zhì)加標(biāo)樣品(5 μg/kg)中各硝基咪唑類藥物及其代謝物的峰面積。由圖4可知,經(jīng)PSA吸附劑凈化后,大多數(shù)目標(biāo)化合物的絕對響應(yīng)峰面積有所增加,豬肉基質(zhì)中DMZ的響應(yīng)值提高最明顯,達(dá)25.9%; 4種基質(zhì)中HMMNI和SNZ的響應(yīng)也均有10%以上的提高。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)(ME)評估

本研究按(空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率/純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線斜率-1)×100%的計(jì)算方法對基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評價(jià)(見表2)。當(dāng)ME為負(fù)值時(shí)表示存在基質(zhì)抑制效應(yīng),ME為正值時(shí)表示存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng);絕對值越大則基質(zhì)效應(yīng)越強(qiáng),如恰好為0則表示不存在基質(zhì)效應(yīng)。由表2可知,硝基咪唑類藥物及其代謝物在各基質(zhì)溶液中呈現(xiàn)一定的基質(zhì)增強(qiáng)作用,尤其是豬肉樣品基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)最為明顯,最高為+22.5%,其他樣品基質(zhì)中各硝基咪唑類藥物及其代謝物的基質(zhì)效應(yīng)為-10.9%～+16.8%。對于復(fù)雜的食品類基質(zhì)而言,經(jīng)本方法凈化處理后目標(biāo)化合物的基質(zhì)效應(yīng)均在可接受范圍內(nèi)。本文采用基質(zhì)匹配內(nèi)標(biāo)法測定實(shí)際樣品也可在一定程度上補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)的影響。

表 2 不同基質(zhì)中硝基咪唑類藥物及其代謝物的基質(zhì)效應(yīng)

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

按1.3節(jié)方法配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，并對其進(jìn)行分析,以硝基咪唑類藥物及其代謝物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、目標(biāo)化合物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)繪制基質(zhì)工作曲線(見表3)。結(jié)果表明,在0.5～20 μg/L范圍內(nèi)目標(biāo)化合物線性相關(guān)性良好,相關(guān)系數(shù)(r2)均≥0.998 2。

在本實(shí)驗(yàn)條件下,根據(jù)3倍信噪比下目標(biāo)化合物色譜峰的響應(yīng)值,得出4種動(dòng)物源性食品基質(zhì)中MNZ-OH和HMMNI的檢出限分別為0.2 μg/kg和0.5 μg/kg,其他目標(biāo)化合物的檢出限為0.1 μg/kg; MNZ-OH和HMMNI的定量限分別為0.5 μg/kg和1.0 μg/kg,其他目標(biāo)化合物的定量限為0.3 μg/kg。

2.5 回收率與精密度

準(zhǔn)確稱取空白雞蛋、雞肉、魚肉和豬肉樣品各2.0 g,設(shè)定3個(gè)添加水平(1.0、3.0和10.0 μg/kg),根據(jù)1.2節(jié)和1.3節(jié)方法進(jìn)行檢測,每組6個(gè)平行樣品,測定回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。由表4可知,各基質(zhì)中硝基咪唑類藥物及其代謝物的回收率為84.2%～120.8%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.0%～16.2%(n=6)。

2.6 實(shí)際樣品檢測

應(yīng)用本方法對2016～2017年舟山地區(qū)采集的15份雞蛋和15份雞肉樣品進(jìn)行檢測,其中有1份雞蛋樣品檢出甲硝唑和羥基甲硝唑,含量分別為3.49 μg/kg和2.43 μg/kg,其余樣品均未檢出硝基咪唑類藥物及其代謝物。

表 4 不同基質(zhì)中硝基咪唑類藥物及其代謝物的回收率和精密度(n=6)

CompoundSpiked/(μg/kg)EggRecovery/%RSD/%ChickenRecovery/%RSD/%FishRecovery/%RSD/%PorkRecovery/%RSD/%MNZ-OH1.0110.612.495.28.290.37.797.09.43.0101.67.390.26.589.23.788.26.310.098.65.589.94.193.32.991.03.3HMMNI1.0100.013.8103.27.098.716.295.99.63.0100.29.7100.66.197.25.395.58.610.0103.66.7109.33.9103.75.199.17.1MNZ1.0120.82.0112.14.5110.42.4103.210.73.0112.97.6107.25.0107.62.6102.83.810.0107.55.4108.43.4107.82.8100.44.5DMZ1.096.214.190.97.9107.02.484.212.13.096.610.687.67.9103.83.789.15.410.095.34.291.96.8106.84.688.66.2RNZ1.096.412.5103.75.684.39.887.012.23.099.16.3103.23.0106.93.495.24.610.0106.98.9105.04.7104.64.393.73.0SNZ1.0104.87.4102.93.7109.99.4102.69.03.0103.46.6100.15.2106.75.697.59.610.0102.13.5103.33.4111.44.495.65.0TNZ1.0103.010.091.615.299.212.0105.314.53.0101.66.692.05.3106.22.994.810.410.0103.15.6108.04.6107.55.886.05.3ONZ1.088.45.699.84.7111.45.4104.911.93.089.13.896.92.7108.62.294.15.410.091.16.296.55.3113.13.089.44.3

3 結(jié)論

本方法采用乙酸乙酯提取,正己烷脫脂,基質(zhì)分散固相萃取凈化,液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測,建立了準(zhǔn)確定性定量檢測動(dòng)物源性食品中8種硝基咪唑類藥物及其代謝物殘留的方法。本方法成本低,操作簡便,靈敏度高,重復(fù)性好,能夠用于應(yīng)急檢測或日常獸藥殘留監(jiān)測。

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