豆腐柴葉蛋白閃式提取工藝優(yōu)化計及其體外抗氧化活性研究

陶阿麗，馮學花，曹殿潔，華芳，楊梅蘭

(安徽新華學院藥學院，安徽 合肥 230088)

豆腐柴(PremnamicrophyllaTurcz )學名觀音草，屬馬鞭草科灌木植物[1]，廣泛分布于我國華東、華南等地。豆腐柴的根、莖、葉均可入藥，具有清熱解毒、消腫止血等功效[2]。據報道，豆腐柴葉中富含多種天然活性成分，其中蛋白質含量高達21%～34%。實驗表明，豆腐柴葉中蛋白質安全、無毒，具有提高機體免疫力、降低膽固醇和抗疲勞等營養(yǎng)功效[2,3]，可作為功能食品開發(fā)的重要原料。

植物蛋白提取方法很多，閃式提取法是近年來新興的一種提取方法，將植物快速破碎實現(xiàn)有效成分的迅速滲透、釋放，方法簡單、快速、環(huán)保[4,5]。目前，對于采用閃式提取法提取豆腐柴葉蛋白的研究報道較少[6,7]。本研究以豆腐柴葉為原料，利用響應面法優(yōu)化豆腐柴葉蛋白閃式提取工藝條件，進行豆腐柴葉蛋白體外抗氧化活性研究，以期為豆腐柴葉功能性產品的開發(fā)提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豆腐柴葉：采摘于安徽新華學院藥學院植物組培實驗室，鮮葉洗凈后自然風干，粉碎過50目篩，貯存?zhèn)溆?；考馬斯亮藍G-250、標準牛血清白蛋白、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、三羥基氨基甲烷(Tris)購自上海海拓試劑有限公司；其他試劑(AR級)購自國藥集團化學試劑有限公司。

LN12-JHBE50T閃式提取器(北京中西遠大科技有限公司)；FY130型中藥粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)；TDL-40B高速離心機(上海安亭科學儀器廠)；DZF-6020型恒溫鼓風干燥箱(上海三發(fā)科學儀器有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 豆腐柴葉蛋白的閃式提取

精確稱取50.0g豆腐柴葉粉末，按照一定液料比加入蒸餾水充分混勻，用1.0mol/L NaOH溶液調節(jié)至一定pH，設定溫度為50℃，在一定電壓下閃式提取一定時間后，以6000r/min離心10min。收集上層清液，用1.0mol/L HCl調節(jié)pH至等電點，使豆腐柴葉蛋白沉淀，以6000r/min離心5min，棄去上層清液后真空冷凍干燥，即得豆腐柴葉蛋白。豆腐柴葉蛋白提取率按如下公式進行計算：

豆腐柴葉蛋白提取率=(提取液中蛋白質含量/豆腐柴葉蛋白質含量)×100%

1.2.2 牛血清白蛋白標準曲線的繪制

稱取100mg考馬斯亮藍G-250溶于50mL 95%乙醇中，加入100mL 85%磷酸，用蒸餾水稀釋至1000mL。取6只試管，分別加入0.1mg/mL的牛血清白蛋白標準溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，加蒸餾水定容至1mL，在每只試管中加入5mL考馬斯亮藍溶液，充分震蕩，靜置2min后在595nm處測光密度。以蛋白含量為橫坐標，以光密度為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為：Y=2.2729X+0.0045，R2=0.995，說明牛血清白蛋白在0～0.1mg/mL范圍內呈良好的線性關系。

1.2.3 單因素試驗

1)閃提時間 取適量豆腐柴葉粉末，在pH為11.0、液料比(mL∶g)為40∶1、閃提電壓為120V條件下分別提取120、150、180、210、240s，考察閃提時間對豆腐柴葉蛋白提取率的影響。

2)液料比 取適量豆腐柴葉粉末，分別在液料比(mL∶g)10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1以及pH為11.0、閃提電壓為120V條件下提取180s，考察液料比對豆腐柴葉蛋白提取率的影響。

3)閃提電壓 取適量豆腐柴葉粉末，固定pH為11.0，液料比(mL∶g)為40∶1，分別在閃提電壓為80、100、120、140、160V條件下提取180s，考察閃提電壓對豆腐柴葉蛋白提取率的影響。

4)pH 取適量豆腐柴葉粉末，分別在pH為8.0、9.0、10.0、11.0、12.0以及固定液料比(mL∶g)為40∶1、電壓為120V條件下閃式提取180s，考察不同pH對豆腐柴葉蛋白提取率的影響。

1.2.4 響應面試驗

在單因素試驗結果的基礎上，根據Box-Behnken中心組合設計原理，以豆腐柴葉蛋白提取率為響應值，選擇閃提時間(A)、液料比(B)、閃提電壓(C)和pH(D)為自變量，采用Design-expert軟件設計響應面試驗，其因素及水平詳見表1。

表1 響應面試驗因素及水平

1.2.5 豆腐柴葉蛋白體外抗氧化實驗

將在響應面法優(yōu)化的最佳工藝條件下提取得到的豆腐柴葉蛋白配制成一定濃度的樣品進行體外抗氧化實驗研究。

1)DPPH自由基清除能力的測定 取不同質量濃度的樣品溶液2mL于試管中，加入0.04mg/mL的DPPH乙醇溶液3mL，混合均勻后置暗處靜置30min，在517nm處測定光密度D1。以蒸餾水2mL加入0.04mg/mL的DPPH乙醇溶液3mL混合，測定空白對照光密度D0。將2mL樣品與3mL無水乙醇混合，測定樣品本身光密度D2[8，9]。以Vc為陽性對照組，各組實驗平行3次取平均值，豆腐柴葉蛋白對DPPH自由基的清除率按下式計算。

2)超氧陰離子自由基清除能力的測定 取不同質量濃度的樣品溶液1mL于試管中，加入0.1 mol/mL Tris-HCl(pH8.2)緩沖溶液5mL，于25℃水浴20 min，加入已經于25 ℃預熱的7mmol/L鄰苯三酚溶液0.3mL，25 ℃恒溫反應5min，加入10mol/L鹽酸2mL，在420nm處測定光密度D1,以1mL蒸餾水代替樣品溶液，測定光密度D0。以Vc為陽性對照組，各組實驗平行3次取平均值，豆腐柴葉蛋白對超氧陰離子自由基的清除率按下式計算。

2 結果與分析

2.1 閃提時間對豆腐柴葉蛋白提取率的影響

圖1 不同閃提時間下的豆腐柴葉蛋白提取率

由圖1可知，豆腐柴葉蛋白提取率隨著閃提時間的增長而增加，在閃提180s時達到最大提取率。180s后，延長閃提時間，豆腐柴葉蛋白提取率并未有明顯改變?？赡芤驗殡S著提取時間的延長，閃式提取器的刀頭通過不斷機械剪切原料，增加了原料與溶劑的接觸面，從而有利于蛋白的溶出。隨著溶劑中蛋白的飽和，提取時間達一定程度后，豆腐柴葉蛋白提取率未見明顯增高。因此，選擇合適的閃提時間為180s。

2.2 液料比對豆腐柴葉蛋白提取率的影響

圖2 不同液料比下的豆腐柴葉蛋白提取率

圖3 不同閃提電壓下的豆腐柴葉蛋白提取率

由圖2可知，隨著液料比的增加，豆腐柴葉蛋白提取率明顯增加，當液料比(mL∶g)大于40∶1后，豆腐柴葉蛋白提取率稍有降低。前期隨著溶劑用量的增加，有利于蛋白的擴散及溶出，當?shù)鞍滋崛÷蔬_到最大值后，溶劑用量繼續(xù)增加會增加熱能消耗、溶劑回收損耗等，造成提取率有所下降。因此，選擇合適的液料比(mL∶g)為40∶1。

2.3 閃提電壓對豆腐柴葉蛋白提取率的影響

由圖3可知，豆腐柴葉蛋白提取率隨著閃提電壓的增大而增加，在120V時達到最大提取率，120V后提取率有所下降。原因可能是電壓的增高使閃式提取器的轉速加大，但是高速運轉的摩擦加快提取溶劑的揮發(fā)，反而降低提取率。因此，選擇最佳的閃提電壓為120V。

2.4 pH對豆腐柴葉蛋白提取率的影響

由圖4可知，在pH在8.0～11.0之間，豆腐柴葉蛋白的提取率呈現(xiàn)增加狀態(tài)，這是因為豆腐柴葉中的蛋白大部分為酸性蛋白質，增加堿性有利于豆腐柴葉蛋白的溶出，提取率明顯增加。當pH繼續(xù)增加后，由于發(fā)生Maillard反應[10]，造成部分蛋白質變質而引起提取率降低。因此，選擇合適的pH為11.0。

2.5 響應面試驗結果

響應面試驗結果見表2，響應面試驗數(shù)據的ANOVA分析結果見表3。

圖4 不同pH下的豆腐柴葉蛋白提取率

表2 響應面試驗設計及結果

表3 ANOVA分析結果

求解多元二次回歸方程獲得模型最大值，即閃提時間為163.59s、液料比(mL∶g)為41.54∶1、閃提電壓為119.85V、pH為11.25，豆腐柴葉蛋白提取率達到最大值，為63.0268%?？紤]實際操作性，修正響應面模型回歸所得的最佳提取工藝，確定最佳提取工藝為：閃提時間為164s、液料比(mL∶g)為42∶1、閃提電壓為120V、pH為11.3。

為驗證響應面曲線法所得結果的可靠性，根據上述修正后優(yōu)化條件提取豆腐柴葉蛋白，重復進行3次平行試驗，得豆腐柴葉蛋白平均提取率為63.06%(RSD為0.939%)，與模型所得理論預測值63.0268%非常接近，說明該模型可靠有效。

2.6 豆腐柴葉蛋白對DPPH自由基清除能力

具有抗氧化能力的物質會降低DPPH自由基在517nm處的吸收，因此可以DPPH·清除率來評價物質的抗氧化作用[11]。不同濃度豆腐柴葉蛋白對DPPH自由基的清除率如圖6所示。結果表明，在0.2～1.0mg/mL范圍內，隨著豆腐柴葉蛋白濃度的增加，其對DPPH自由基的清除能力增強。豆腐柴葉蛋白對DPPH自由基的清除能力顯著低于相同濃度的陽性對照組Vc(P<0.05)。

2.7 豆腐柴葉蛋白對超氧陰離子自由基清除能力

3 結論

圖5 豆腐柴葉蛋白提取率的響應面圖

以豆腐柴葉為原料，采用簡單高效的閃式提取法提取豆腐柴葉蛋白，通過響應面模型優(yōu)化獲得豆腐柴葉蛋白最佳提取工藝為：閃提時間為164s、液料比(mL∶g)為42∶1、閃提電壓為120V、pH為11.3，豆腐柴葉蛋白的平均提取率為63.06%，與模型預測值擬合度較高。采用DPPH自由基、超氧陰離子自由基2種體外抗氧化模型，考察豆腐柴葉蛋白的體外抗氧化能力，結果顯示，豆腐柴葉蛋白對DPPH自由基、超氧陰離子自由基均具較明顯的清除作用，清除率與豆腐柴葉蛋白濃度存在著明顯的量效關系，但清除能力均弱于陽性對照組Vc。

圖6 不同濃度豆腐柴葉蛋白對DPPH·的清除率圖7 不同濃度豆腐柴葉蛋白對O-2·的清除率

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