絲腺特異表達hBPI23轉基因蠶的制作和表達分析*

冉冬旭 歐 瑤 劉榮鵬 肖海梅 徐漢福

(家蠶基因組生物學國家重點實驗室，西南大學生物技術學院，重慶 400715)

家蠶以高效合成和分泌蠶絲蛋白著稱，蠶絲蛋白作為一種純天然的高分子材料，不僅力學性能優(yōu)良，還具有優(yōu)異的組織相容性、生物可降解性、環(huán)境穩(wěn)定性以及一定的抗菌功能，這些優(yōu)良特性使其在醫(yī)藥、食品、組織工程、日用精細化工等領域備受關注[1-2]，相關研究和開發(fā)十分活躍。

抗菌是蠶絲蛋白的一個重要特性，該特性對于生物醫(yī)學材料開發(fā)等具有重要意義，但天然蠶絲蛋白的抗菌功效尚難達到生物醫(yī)學材料開發(fā)的應用實際需求。為解決該問題，國內外學者開發(fā)了多種策略，如：利用化學鍍工藝處理蠶絲材料，在蠶絲材料中添加納米銀，在蠶絲材料中添加抗菌肽等[3-7]。這些方法盡管有助于提高蠶絲的抗菌性能，但離實際應用仍有一定距離。此外，添加金屬離子等方法對人體健康和環(huán)境也存在不良影響[8]。因此，有必要探索提高蠶絲抗菌性能的新策略。

殺菌/通透性增加蛋白(bactericidal/permeability-increasing protein，BPI)是Weiss等人最先在人類中性粒細胞中發(fā)現的一種相對分子量為56 kDa的陽離子抗菌蛋白，具有強大的殺滅革蘭氏陰性菌及中和內毒素的能力，同時還有調節(jié)免疫、抑制血管生成、抗真菌和殺滅寄生蟲等作用，譽有“超級抗生素”之稱[9-10]。近年研究證實，人源BPI蛋白的N末端區(qū)富含陽離子氨基酸和親水殘基，利用原核和真核表達系統(tǒng)表達的相對分子量為23 kDa的N末端氨基酸片段(hBPI23)與天然人BPI具有完全相同的生物學作用[11-16]，表明hBPI23是開發(fā)抗菌藥物和提高抗菌功效的一個理想分子靶標。本研究以hBPI23為靶標，制作獲得在后部絲腺特異表達hBPI23的轉基因蠶，以期為探索利用hBPI23提高蠶絲的抗菌性能打下素材基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試家蠶品系Nistari，為多化性品系，由本實驗室保存。亞克隆載體p57S[fibH-MCS-LBS]、piggyBac骨架載體pBac[3×P3EGFPafm]和輔助質粒A4 Helper均由本課題組構建或保存。注射用超純質粒DNA采用QIAprep Spin Miniprep試劑盒(購自QIAGEN公司)制備。

1.2 基因合成和載體構建

以人BPI蛋白的N端序列(hBPI23)為基礎，根據家蠶密碼子偏好進行優(yōu)化后由南京金斯瑞生物科技有限公司直接合成，序列兩端分別為BamHI和NotI酶切位點，并在C末端加6×His標簽序列。采用BamHI和NotI雙酶切hBPI23合成質粒并回收目的片段，裝到經同樣酶切的亞克隆載體p57S[fibH-MCS-LBS]中，構建獲得p57S[fibH-hBPI23-LBS]。利用AscI單酶切p57S[fibH-hBPI23-LBS]質粒，將回收的目的片段與經同樣酶切的pBac[3×P3EGFPafm]骨架載體連接，構建獲得最終表達載體pB[fibH-hBPI23-LBS,3×P3EGFP]。表達載體質粒測序由深圳華大基因科技股份有限公司完成。

1.3 顯微注射和熒光篩選

將制備的pB[fibH-hBPI23-LBS,3×P3EGFP]和A4 Helper超純質粒DNA按1∶1摩爾比混合，顯微注射到產卵后1～3 h的Nistari早期胚胎(G0代)。G0代孵化幼蟲飼育至羽化后進行自交或回交制種，獲得的G1代蠶卵于點青期前1d左右置于體視熒光顯微鏡(Olympus，日本)下檢測，篩選在胚胎眼睛或神經組織發(fā)熒光的轉基因陽性個體，并以蛾圈為單位單獨飼育。

1.4 基因組整合位點分析

提取野生型Nistari(WT，下同)蠶蛾和G1代陽性蠶蛾基因組DNA，采用HaeIII內切酶酶切消化3～4 h，然后用T4 DNA連接酶進行環(huán)化連接。以連接產物為模板，分別利用piggyBac轉座子的左臂和右臂特異引物進行Inverse PCR擴增。piggyBac左臂引物序列為5’-ATCAGTGACACTTACCGCATTGACA-3’和5’-TGACGAGCTTGTTGGTGAGGATTCT-3’;piggyBac右臂引物序列為5’-TACGCATGATTATCTTTAACGTA-3’和5’-GGGGTCCGTCAAAACAAAACATC-3’。膠回收Inverse PCR目的片段并進行T克隆，然后送公司測序。測序序列利用SilkDB數據庫(http://www.silkdb.org/silkdb/)中的BLAST和SilkMap程序進行比對和染色體定位分析。

1.5 轉錄表達分析

利用Total RNA Kit II(Omega, 美國)試劑盒分別提取WT和G1代陽性蠶蛾，以及5齡第1d至第6d的WT和G2代轉基因幼蟲后部絲腺總RNA，反轉錄后制備成cDNA模板。蠶蛾cDNA用于RT-PCR檢測，后部絲腺cDNA用于qRT-PCR檢測。PCR引物序列包括：hBPI23特異引物5’-ATGGCTCGTGGTCCCTGTA-3’和5’-GCTGCTGTGCCCTGTTGA-3’(目的片段大小為152 bp)；BmActin3檢測引物5’-AACACCCCGTCCTGCTCACTG-3’和5’-GGGCGAGACGTGTGATTTCCT-3’；qRT-PCR內參基因(BmeIF4A)檢測引物5’-TTCGTACTGGCTCTTCTCGT-3’和5’-CAAAGTTGATAGCAATTCCCT-3’。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

2 結果與分析

2.1 H-hBPI23轉基因系的制作

以合成的hBPI23序列為基礎，采用酶切連接方式將其組裝到piggyBac骨架載體pBac[3×P3EGFPafm]中，構建成最終表達載體pB[fibH-hBPI23-LBS,3×P3EGFP](圖1)。將制備的pB[fibH-hBPI23-LBS,3×P3EGFP]超純質粒與輔助質粒等摩爾比混合后，顯微注射至Nistari早期胚胎(G0代)，于次代(G1代)胚胎期第7d進行熒光觀察，在16個G1代蛾圈中篩選獲得了1個陽性蛾圈，將其命名為H-hBPI23(圖2)。

圖1 pB[fibH-hBPI23-LBS,3×P3EGFP]表達載體示意圖

圖2 G1代H-hBPI23轉基因陽性個體

2.2 H-hBPI23的基因組整合位點

以G1代H-hBPI23轉基因蠶蛾的基因組DNA為模板，利用Inverse PCR技術對H-hBPI23基因組整合位點的兩翼序列進行擴增和測序分析，結果顯示，H-hBPI23的基因組整合位點位于家蠶第23號染色體上的nscaf3027，以單拷貝形式存在(圖3)。

2.3 hBPI23的轉錄表達特征

以G1代H-hBPI23蠶蛾cDNA為模板，利用hBPI23特異引物進行RT-PCR檢測，結果顯示：僅在H-hBPI23個體中擴增出了與預期大小一致的目的條帶，表明在轉基因個體中hBPI23能夠轉錄表達(圖4)。隨后，以5齡第1d至第6d的G2代H-hBPI23幼蟲后部絲腺cDNA為模板，利用hBPI23特異引物進行qRT-PCR檢測，結果圖5所示：在H-hBPI23幼蟲后部絲腺中，hBPI23在5齡第1d和第2d有微弱表達，5齡第3d開始大量表達，5齡第6d(吐絲前1d)達到表達峰值，其表達模式與家蠶內源絲素蛋白基因類似。

圖3 H-hBPI23的基因組整合位點

圖4 H-hBPI23蠶蛾中hBPI23的表達檢測

圖5 H-hBPI23幼蟲后部絲腺中hBPI23的表達特征

3 討論

天然蠶絲蛋白具有一定的抗菌性能，但從生物醫(yī)學材料等應用開發(fā)要求來看，其抗菌活性還有待進一步提高。近年來，國內外學者探索建立了添加納米銀離子、化學鍍處理等多種提高蠶絲蛋白抗菌活性的有效方法，但這些方法對環(huán)境或人體健康也帶來了潛在的風險，尚需進一步改進。本研究以具有強大殺滅革蘭氏陰性菌及中和內毒素能力的人BPI蛋白的N末端氨基酸片段(hBPI23)為靶標，首先根據家蠶密碼子偏好合成了hBPI23序列，進而通過顯微注射制作獲得了轉基因系H-hBPI23。分子檢測證實，hBPI23在轉基因家蠶后部絲腺中高量轉錄表達，在5齡第6d(吐絲前1d)達到表達高峰，表明轉基因蠶制作成功。下一步我們將以H-hBPI23轉基因系為基礎，利用Western方法分析轉基因蠶繭中重組hBPI23蛋白的含量，并通過添加革蘭氏陰性菌等方法，檢測和評估H-hBPI23蠶絲的抗菌活性。