新型腫瘤標志物MEF2D在肝癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用*

(1.青島大學藥學院，山東 青島 266071； 2.青島市市立醫(yī)院內(nèi)窺鏡室，山東 青島 2660011；3.青島市市立醫(yī)院核醫(yī)學科,山東 青島 266011)

肝細胞性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界上最常見的和第三大致死率的癌癥[1]。肝癌患者術后5年內(nèi)的生存率仍然很低。50%以上患者出現(xiàn)轉(zhuǎn)移復發(fā)，嚴重影響患者預后。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transitions, EMT)的發(fā)生是促進肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移的主要原因之一[2]。臨床上有58%的肝癌患者伴隨有以E-Cadherin減少為標志的EMT發(fā)生[3]。通常用手術的手法去除腫瘤，但是這些病人的預后很差，術后大多發(fā)生腫瘤的肝內(nèi)轉(zhuǎn)移。相比之下，未發(fā)生EMT的肝癌患者則很少發(fā)生肝內(nèi)轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象[4]。肌肉增強因子2D(myocyte enhancer factor 2d, MEF2D)是一種發(fā)揮多種生理功能的細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，據(jù)文獻報道MEF2D在骨骼肌、心肌、神經(jīng)組織和免疫系統(tǒng)的發(fā)育過程和正常生理功能的維持中發(fā)揮重要功能[5]。本課題組通過對GDS4269基因芯片研究發(fā)現(xiàn)在TGF-β誘導的EMT過程中MEF2D的表達量上升[6]，進一步對于肝癌轉(zhuǎn)移基因芯片GDS3901的分析中，我們發(fā)現(xiàn)在肝癌轉(zhuǎn)移灶表達量明顯高于原發(fā)灶[7]。因此，我們推測MEF2D參與TGF-β誘導EMT的過程，并且具有可作為肝癌診斷和預后的分子標記物的價值。

1 材料與方法

1.1 材料

細胞株PLC/PRF5、HepG2購買于中科院上海細胞庫；DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；胎牛血清(fetal bovine serum, FBS，PANS)；Vimentin，E-cadhern，GAPDH抗體購買于Abcam; MEF2D抗體購買于CST公司；TGF-β購買于索萊寶；siMEF2D和Nc 購自中國上海吉瑪制藥技術有限公司；空載對照質(zhì)粒和MEF2D質(zhì)粒購自中國上海吉凱基因化學技術有限公司；基因芯片GDS4269是肝癌Huh-7細胞系經(jīng)過TGF-β刺激與正常對照兩組樣本測序；基因芯片GDS3901是分析靜脈轉(zhuǎn)移肝癌與原發(fā)肝癌組織的測序；轉(zhuǎn)染試劑siRNA Transfection Reagent/DNAfectin 2100 Transfection Reagent均購買于Applied Biological Materials公司；肝癌標本和肝癌切片來自于青島大學附屬醫(yī)院。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng) PLC/PRF5、HepG2細胞均采用DMEM培養(yǎng)基(含10%FBS，1%雙抗)培養(yǎng)，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。覆蓋率達到80%～90%后，棄去培養(yǎng)液用PBS沖洗，加入1 ml胰酶消化2～3 min，然后傳到新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2蛋白質(zhì)印跡檢測 肝癌細胞PLC/PRF5和HepG2轉(zhuǎn)染48 h后，加入蛋白裂解液，低溫高速離心，提取細胞總蛋白，加入loading buffer變性。用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，濕法轉(zhuǎn)膜到PVDF膜上，用TBST搖床洗3×10 min，用5%脫脂奶粉在搖床封閉2 h，TBST搖床洗3×10 min， 在一抗孵育槽中加入用5%脫脂奶粉稀釋的一抗(GAPDH 1∶1 000，MEF2D 1∶1 000)，用一抗覆蓋PVDF膜在4℃冰箱中。隔夜取出膜，TBST搖床洗3×10 min，加入稀釋好的二抗(1∶1 000～1∶10 000)1 h，TBST搖床洗3×10 min，將適量的高靈敏度ECL發(fā)光液按1∶1比例混合均勻，覆蓋到PVDF膜上，在暗室中用Bio-Rad凝膠成像儀顯影并記錄。

1.2.3siRNA/質(zhì)粒細胞轉(zhuǎn)染 將PLC/PRF5、HepG2細胞接種于6孔板中，正常情況培養(yǎng)細胞覆蓋率達到50%～60%時，每孔加入1.6 ml無血清培養(yǎng)液。將5 μl siRNA Transfection Reagent/DNA fectin 2100 Transfection Reagent和100 μl 無血清培養(yǎng)液混合室溫靜置5 min之后，與100 μl無血清培養(yǎng)液和5 μl siRNA/質(zhì)?；旌弦夯旌暇鶆蛐纬蓮秃衔?，在室溫放置20 min之后加到對應的6孔板中，放置于37 ℃，5%CO2溫箱中培養(yǎng)。48 h之后進行后續(xù)實驗和提取蛋白。

1.2.4Transwell實驗 將基質(zhì)膠放在4℃冰盒融化，用預冷的移液槍頭混勻Matrigel基質(zhì)成勻漿狀，按照1∶8的比例加入無血清培養(yǎng)液。每個小室當中加入60 μl混合液包被于小室，置于溫箱當中30 min，吸取多余的混合液。將分別轉(zhuǎn)染Nc和siMEF2D的PLC/PRF5細胞做成混懸液，細胞計數(shù)制成1×105個/ml混懸液，每個小室加入200 μl的細胞混懸液，24孔板中加入600 μl的含15%FBS的培養(yǎng)液置于溫箱當中48 h，培養(yǎng)48 h后，用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)細胞，PBS液洗3×3 min，用4%多聚甲醛固定細胞30 min。再用PBS液洗3×3 min，用結(jié)晶紫染色30 min，最后再用PBS液清洗。 將小室置于顯微鏡下觀察并拍照，各小室取5個視野統(tǒng)計細胞個數(shù)，細胞相對侵襲率=實驗組細胞數(shù)/對照組細胞數(shù)。

1.2.5劃痕實驗 將HepG2細胞接種于6孔板，等到覆蓋率達到50%～60%轉(zhuǎn)染過表達質(zhì)粒之后48 h，用200 μl槍頭垂直用力劃橫線，用PBS緩沖液沖洗3次，加入無血清的培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，分別于0，48 h用倒置顯微鏡拍照，用Image J進行劃痕測量，細胞遷移率=(初始劃痕距離-實驗后劃痕距離)/初始劃痕距離。

1.2.6免疫組化 石蠟切片放置在60 ℃恒溫箱中烘烤120 min；然后脫蠟和水化(二甲苯10 min→二甲苯10 min→無水乙醇2×5 min→95%乙醇2×5 min→90%乙醇5 min→85%乙醇5 min →80%乙醇5 min→75%乙醇5 min； 用蒸餾水沖洗25 min；加3%H2O2孵育30 min(室溫)；蒸餾水洗2次；抗原修復；用PBS洗3×5 min，封閉30 min；滴加一抗，4 ℃過夜或37 ℃孵育2～3 h；用PBS洗3×5 min，滴加二抗，37 ℃孵育30～60 min；用PBS洗3×5 min，DAB液(二氨基聯(lián)苯胺)顯色，自來水充分沖洗；蘇木素復染，自來水充分沖洗；脫水、透明各5～10 min；中性樹脂封片，加蓋玻片，晾干之后顯微鏡觀察拍攝照片。

1.2.7統(tǒng)計學分析 利用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，兩組均數(shù)的比較用t檢驗，P≤0.05被認為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 MEF2D參與TGF-β誘導細胞發(fā)生EMT過程

用不同濃度的TGF-β(0、3、5 ng/ml)處理PLC/PRF5細胞48 h，隨著TGF-β的濃度梯度增長，細胞之間黏連性降低，細胞間緊密連接遭到破壞(圖1A)。為驗證MEF2D是否參與EMT的發(fā)生過程，免疫印跡法結(jié)果顯示Vimentin表達量逐漸升高，E-cadhern的表達量下降不太明顯，MEF2D的表達量明顯升高(圖1B )。通過信息學對GDS4269基因芯片進行分析也得出同樣的結(jié)果，經(jīng)過TGF-β作用之后，MEF2D的表達量上升幅度很大(圖1C)。

A:TGF-β處理PLC/PRF5細胞之后細胞形態(tài)的變化；B:TGF-β處理PLC/PRF5細胞之后EMT相關蛋白以及MEF2D的表達量及其定量；C:基因芯片GDS4269顯示Huh7經(jīng)過TGF-β處理后MEF2D表達量。

圖1 MEF2D參與TGF-β誘導細胞發(fā)生EMT過程

2.2 MEF2D可以明顯促進細胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移

為檢測MEF2D與肝癌細胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的關系，用NC和siMEF2D分別轉(zhuǎn)染PLC/RPF5細胞系，可觀察到MEF2D明顯下調(diào)(圖2A)，在Transwell實驗中，下調(diào)MEF2D的細胞侵襲能力明顯弱于對照組(P<0.01)(圖2B)。在劃痕實驗中，用質(zhì)粒上調(diào)HepG2細胞系中的MEF2D表達量(圖2C)，過表達MEF2D細胞的愈合能力要強于對照組(P<0.01)(圖2D)。在細胞實驗中，MEF2D可以明顯促進細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。

2.3 MEF2D在侵襲轉(zhuǎn)移的腫瘤組織中高表達

用肝癌患者的腫瘤和正常標本做免疫組化，MEF2D在腫瘤組織中的表達量高于癌旁組織(圖3A)。通過對于基因芯片GDS3901的分析，我們發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)移的組織當中MEF2D的表達量明顯高于非轉(zhuǎn)移的腫瘤組織(圖3C)，為再次驗證這一結(jié)論，我們?nèi)?例轉(zhuǎn)移病人標本，在轉(zhuǎn)移病人組織中MEF2D的mRNA表達量是原發(fā)灶腫瘤的2.5倍。因此MEF2D在病人的轉(zhuǎn)移組織當中高表達(圖3B)。

3 討 論

肝癌細胞的轉(zhuǎn)移是導致患者死亡的主要原因之一。因此，發(fā)現(xiàn)肝癌轉(zhuǎn)移的標志性蛋白具有非常重要的臨床意義，它可以成為肝細胞癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移的指標。肌細胞增強因子2家族(myocyte enhancer factor 2，MEF2)是一類發(fā)揮多種生理功能的細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，該家族包括MEF2A、MEF2B、MEF2C和MEF2D 4個成員。作為該家族的成員之一，MEF2D在骨骼肌、心肌、神經(jīng)組織和免疫系統(tǒng)的發(fā)育過程和正常生理功能的維持中發(fā)揮重要功能[5]。如同其他重要的發(fā)育相關因子一樣，MEF2D也參與了癌癥的發(fā)生過程。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，沉默MEF2D能夠抑制肝癌細胞的增殖和其在體內(nèi)的成瘤能力，而過表達MEF2D則能夠提高肝癌細胞的增殖率。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，MEF2D通過下調(diào)RPRM、CDKN1A、GADD45A和GADD45B促進細胞周期從S期向G2/M期的演進。微小RNA miR-122的下調(diào)可能是造成原發(fā)肝癌中MEF2D過表達的原因[8]。

近期有文獻報道在肝癌細胞中MEF2家族4個成員在TGF-β的刺激下表達會上調(diào)[9]。近幾年，很多關于MEF2D如何直接調(diào)控腫瘤發(fā)生的研究機制也陸續(xù)報道，最近已有研究表明MEF2D可以結(jié)合鋅指蛋白從而促進結(jié)直腸癌細胞的上皮間質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)移[10]，除此之外，MEF2D還可以通過結(jié)合Pokemon 的啟動子，兩者協(xié)同促進肝癌細胞的浸潤[11-12]。本實驗課題中，我們通過對于基因芯片的分析以及細胞實驗，驗證MEF2D參與TGF-β誘導的EMT的發(fā)生，并且與Vimentin的表達量成正比。在前期研究中，蛋白激酶p38 MAPK是TGF-β非經(jīng)典通路誘導EMT的關鍵因子之一[13]，使用小分子抑制劑或干擾RNA抑制p38 MAPK的活性，會嚴重削弱TGF-β誘導EMT的效率[14]。有文獻提示，在肝臟的星狀細胞中蛋白激酶p38 MAPK可以促使MEF2D發(fā)生磷酸化[15]，磷酸化后MEF2D結(jié)合DNA的能力增強，激活靶基因表達的活性也隨之升高[16]。因此我們驗證MEF2D在細胞侵襲轉(zhuǎn)移當中的作用。本課題中我們下調(diào)MEF2D的表達會抑制高侵襲細胞PLC/PRF5的侵襲，相反當我們上調(diào)MEF2D的時候可以促進HepG2細胞的遷移能力，說明MEF2D可以促進細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。結(jié)合基因芯片和臨床的樣本，我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶腫瘤中的MEF2D表達量高于原發(fā)灶位置腫瘤，這也再次證明MEF2D在腫瘤的發(fā)生當中發(fā)揮重要作用[8]。除此之外，有研究發(fā)現(xiàn)MEF2D能顯著促進腸癌細胞系的遷移和侵襲能力[10]，因此我們可以初步得出結(jié)論MEF2D可以作為肝癌腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的標志蛋白。

在今后的工作中，我們會探索MEF2D是如何結(jié)合下游EMT的啟動基因，進一步研究MEF2D如何參與細胞侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制研究，為肝癌的復發(fā)和轉(zhuǎn)移確定診斷標記物，對于肝癌的靶向治療具有重大基礎和臨床意義。

A: si-MEF2D可以有效地下調(diào)MEF2D蛋白的表達量； B:敲除MEF2D蛋白質(zhì)后，對PLC/PRF5細胞侵襲效率的影響； C:質(zhì)粒pKC-MEF2D上調(diào)MEF2D蛋白的表達量； D:過表達MEF2D蛋白對于HepG2細胞劃痕的影響

圖2 MEF2D參與細胞的侵襲轉(zhuǎn)移

A:MEF2D在肝癌組織與癌旁組織中的表達差異；B：收集9粒肝癌轉(zhuǎn)移樣本與原發(fā)灶肝癌中驗證MEF2D的表達差異;C：基因轉(zhuǎn)移芯片GDS3091顯示MEF2D在轉(zhuǎn)移灶肝癌組織中與原發(fā)灶肝癌中的表達性差異。

圖3 MEF2D在臨床樣本中的表達量差異

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