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    蝦青素保護(hù)PC-3細(xì)胞免受H2O2氧化應(yīng)激的作用機(jī)制

    2018-05-25 00:47:46倪曉鋒于海寧王姍姍張程程沈生榮
    食品科學(xué) 2018年9期
    關(guān)鍵詞:素處理青素存活率

    倪曉鋒,于海寧,王姍姍,張程程,沈生榮,*

    蝦青素是天然存在的類胡蘿卜素,但不同于其他類胡蘿卜素,其化學(xué)結(jié)構(gòu)兩端每個芳香環(huán)上各有一個羥基和不飽和羰基,使其具有顯著的抗氧化能力,其抗氧化能力比β-胡蘿卜素高10 倍以上,是VE的500 倍以上,是天然的“超級抗氧化劑”。蝦青素廣泛存在于自然界,如大多數(shù)甲殼類動物和鮭科魚類體內(nèi),植物的葉、花、果,以及火烈鳥的羽毛中等。近年來,圍繞蝦青素的研究也逐漸展開,例如抗氧化、改善動脈粥樣硬化、抗炎癥和抗腫瘤等生物活性[1-7]。氧化應(yīng)激涉及許多疾病的發(fā)病機(jī)理,包括癌癥,其最主要的標(biāo)志物是活性氧(reactive oxygen species,ROS),ROS與細(xì)胞的增殖和凋亡密切相關(guān)[8-9]?,F(xiàn)已證實(shí),核因子E2相關(guān)基因2-血紅素氧合酶1(nuclear factor erythroid-2-related factor 2-heme oxygenase 1,Nrf2-HO-1)通路是抗氧化應(yīng)激最重要的細(xì)胞保護(hù)機(jī)制之一。在氧化應(yīng)激狀態(tài)下,機(jī)體Nrf2激活,轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)與AU富含元件(AU-rich element,ARE)的基因序列結(jié)合,上調(diào)依賴還原型輔酶Ⅰ/Ⅱ:醌氧化還原酶(NADPH: quinoneoxido-reductase,NQO1)、HO-1、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-glutamylcysteine synthetase,γ-GCS)等的表達(dá),從而發(fā)揮自身抗氧化應(yīng)激的作用[10-12]。

    本實(shí)驗(yàn)采用H2O2誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞氧化應(yīng)激,通過觀察細(xì)胞存活率、細(xì)胞凋亡、ROS水平以及絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)-Nrf2-HO-1通路,探討蝦青素對ROS所致細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    PC-3細(xì)胞株 中國科學(xué)院細(xì)胞庫;蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT) 美國Sigma公司;ROS、Annexin V-FITC試劑盒、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)抑制劑(LY294002)、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)抑制劑(U0126)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)抑制劑(SP600125)、p38蛋白抑制劑(SB203580)碧云天生物技術(shù)研究所;三羥甲基氨基甲烷(tris(hydroxymethyl)aminomethane,Tris)、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)、吐溫20 北京索萊寶科技有限公司;B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2-associated X,Bax)、活化半胱天冬酶-3(cleaved caspase-3)、ERK、JNK、p38蛋白、Akt 美國Cell Signaling Technology公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    MD29 SpectraMax酶標(biāo)儀 芬蘭Thermal Lab System公司;FC500MCL流式細(xì)胞儀 美國Beckman Coulter公司;Cary Eclipase熒光分光光度計(jì) 美國Virian公司;WD-9405A脫色搖床、DYY-6C電泳儀 北京六一儀器廠。

    1.3 方法

    1.3.1 不同濃度H2O2對PC-3細(xì)胞的氧化損傷作用

    細(xì)胞以1×105個/mL密度接種到96 孔板中,每孔200 μL,在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后,用0、50、100、200、400、800 μmol/L H2O2處理24 h。棄培養(yǎng)液,每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后每孔加入150 μL二甲基亞砜,在490 nm波長處檢測吸光度。篩選出適宜濃度的H2O2氧化損傷模型。

    1.3.2 蝦青素對H2O2誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞損傷模型的細(xì)胞存活率影響

    將PC-3細(xì)胞接種到96 孔板中,每孔200 μL,培養(yǎng)12 h,然后設(shè)置5 個組,分別是正常對照組(只含培養(yǎng)液,CK)、蝦青素處理組(蝦青素濃度分別為0、5、10、20 μmol/L)。蝦青素處理組加入相應(yīng)濃度的蝦青素,處理24 h后,加入400 μmol/L H2O2,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,MTT法檢測在490 nm波長處的吸光度。

    1.3.3 蝦青素對H2O2誘導(dǎo)的PC-3細(xì)胞損傷模型的ROS水平的影響

    將處于對數(shù)生長期的PC-3細(xì)胞接種于6 孔板中,細(xì)胞密度分別為1×105個/mL,每孔接種2 mL,培養(yǎng)12 h后,棄培養(yǎng)液,用蝦青素(0、5、10、20 μmol/L)處理細(xì)胞24 h,并設(shè)CK組,每組設(shè)置3 個平行,除CK組外,其余各組加入400 μmol/L H2O2,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,胰酶消化收集細(xì)胞,所有組經(jīng)磷酸鹽緩沖液清洗一遍后,加入1 mL 10 μmol/L 2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA),細(xì)胞濃度一般為1×106~2×107個/mL,37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育25 min。每隔3~5 min顛倒混勻一下,使探針和細(xì)胞充分接觸。離心后去除上清液,用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌離心細(xì)胞3 次,以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA,最后重懸于無血清培養(yǎng)基,立即用流式細(xì)胞儀檢測熒光強(qiáng)度(488 nm激發(fā)波長,525 nm發(fā)射波長)。

    1.3.4 蝦青素對H2O2誘導(dǎo)的PC-3細(xì)胞損傷模型的細(xì)胞凋亡的影響

    細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理過程同1.3.3節(jié)。培養(yǎng)結(jié)束后,將細(xì)胞培養(yǎng)液吸出至離心管,磷酸鹽緩沖液洗滌貼壁細(xì)胞1 次,轉(zhuǎn)入上述離心管,胰酶消化后加入上述離心管收集的培養(yǎng)液(此步驟的目的一方面是收集已經(jīng)懸浮的凋亡或壞死細(xì)胞,另一方面培養(yǎng)液中的血清可以中和胰酶,終止消化過程)。1 000 r/min離心5 min,棄上清液,收集細(xì)胞,用磷酸鹽清洗2 遍后重懸并計(jì)數(shù)。取5×104~1×105個重懸細(xì)胞,1 000 r/min離心5 min,棄上清液,加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液并重懸細(xì)胞,加入5 μL Annexin V-FITC,輕輕混勻,加入10 μL碘化丙啶,室溫避光孵育10~20 min后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。

    1.3.5 蝦青素對H2O2誘導(dǎo)的PC-3細(xì)胞損傷模型中Bcl-2/Bax、caspase-3表達(dá)的影響

    細(xì)胞培養(yǎng)同1.3.3節(jié),培養(yǎng)12 h后,棄培養(yǎng)液,用蝦青素(20 μmol/L)、H2O2(400 μmol/L)、蝦青素+H2O2(20 μmol/L蝦青素+400 μmol/L H2O2)處理細(xì)胞24 h,并設(shè)CK組,每組設(shè)置3 個平行,胰酶消化收集細(xì)胞。Western blotting法測定表達(dá)情況。

    1.3.6 蝦青素對H2O2誘導(dǎo)的PC-3細(xì)胞損傷模型中MAPK通路的影響

    細(xì)胞培養(yǎng)和分組同1.3.5節(jié)。Western blotting法測定表達(dá)情況。

    1.3.7 蝦青素對H2O2誘導(dǎo)的PC-3細(xì)胞損傷模型中Nrf2-HO-1通路的影響

    細(xì)胞培養(yǎng)同1.3.3節(jié),培養(yǎng)12 h后,棄培養(yǎng)液,用蝦青素(0、5、10、20 μmol/L)處理細(xì)胞24 h,每組設(shè)置3 個平行,胰酶消化收集細(xì)胞。Western blotting法測定表達(dá)情況。

    1.3.8 通路抑制劑對蝦青素影響H2O2誘導(dǎo)的PC-3細(xì)胞損傷模型中Nuclear Nrf2表達(dá)的影響

    細(xì)胞培養(yǎng)同1.3.3節(jié),培養(yǎng)12 h后,棄培養(yǎng)液,用ERK抑制劑(U0126)、Akt抑制劑(LY294002)預(yù)處理PC-3細(xì)胞1 h,而后再用20 μmol/L蝦青素處理24 h,另設(shè)CK組和20 μmol/L蝦青素組,每組設(shè)置3 個平行,胰酶消化收集細(xì)胞。Western blotting法測定表達(dá)情況。

    1.3.9 通路抑制劑對蝦青素影響H2O2誘導(dǎo)的PC-3細(xì)胞損傷模型中細(xì)胞存活率的影響

    細(xì)胞培養(yǎng)同1.3.3節(jié),培養(yǎng)12 h后,棄培養(yǎng)液,設(shè)立H2O2處理組和無H2O2處理組,無H2O2處理組用ERK、JNK抑制劑和p38蛋白抑制劑預(yù)處理PC-3細(xì)胞1 h,而后再用20 μmol/L蝦青素處理48 h;H2O2處理組用U0126、SP600125和SB203580預(yù)處理PC-3細(xì)胞1 h,而后再用20 μmol/L蝦青素處理24 h后,加入400 μmol/L H2O2,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。設(shè)立CK組,每組設(shè)置3 個平行,胰酶消化收集細(xì)胞。Western blotting法測定表達(dá)情況。

    1.3.10 Western blotting分析

    細(xì)胞收集后提取蛋白,二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)法測定蛋白質(zhì)量濃度,于-80 ℃保存。樣品蛋白變性后,取50 μg蛋白樣品用于SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳,采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的分離膠、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的濃縮膠分離蛋白,300 mA恒流轉(zhuǎn)移0.5 h至聚偏二氟乙烯膜,用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉封閉1 h,一抗孵育,4 ℃反應(yīng)過夜,吐溫20-Tris緩沖液(Tris-buffered saline tween 20,TBST)搖床洗3 次后用二抗室溫孵育30 min,電化學(xué)發(fā)光(electro-chemi-luminescence,ECL)顯影,將膠片掃描存檔,分析光密度值。

    1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

    所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果以 ±s表示,用SPSS 22.0分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,組間比較采用單因素方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 H2O2對PC-3細(xì)胞的氧化損傷作用

    PC-3細(xì)胞經(jīng)H2O2處理后,細(xì)胞存活率明顯下降,與濃度成負(fù)相關(guān),即濃度越大,存活率越低(圖1)。H2O2濃度200、400、800 μmol/L的細(xì)胞存活率分別為77.5%、56.3%和34.6%,與CK組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。綜合考慮,后續(xù)實(shí)驗(yàn)用400 μmol/L H2O2誘導(dǎo)氧化損傷模型。

    圖1 H2O2對PC-3細(xì)胞存活率的影響Fig. 1 Effect of H2O2 on cell viability of PC-3 cells

    2.2 蝦青素對H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的PC-3細(xì)胞存活率的影響

    圖2 蝦青素對H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的PC-3細(xì)胞存活率的影響Fig. 2 Effect of astaxanthin on cell viability of PC-3 cells with oxidative stress induced by H2O2

    如圖2顯示,無蝦青素處理組經(jīng)H2O2氧化損傷處理后,細(xì)胞存活率顯著下降(P<0.01)。用5、10、20 μmol/L蝦青素預(yù)處理后再經(jīng)H2O2氧化損傷,PC-3細(xì)胞存活率分別提高到58.3%、65.3%和82%。與無蝦青素處理組相比較,20 μmol/L蝦青素組具有顯著性差異(P<0.05)。

    2.3 蝦青素對H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的PC-3細(xì)胞ROS水平的影響

    圖3 蝦青素對H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的PC-3細(xì)胞ROS水平的影響Fig. 3 Effect of astaxanthin on ROS level of PC-3 cells with oxidative stress induced by H2O2

    H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷與ROS的積累密切相關(guān)。DCFH-DA探針進(jìn)入細(xì)胞后能與細(xì)胞內(nèi)部存在的過氧化物、氫過氧化物等氧化分解,產(chǎn)生2’,7’-二氯熒光素(2’,7’-dichlorodihydrofluorescein,DCF),而DCF具有熒光,因此通過測定熒光強(qiáng)度,就能得出ROS的水平。由圖3可知,400 μmol/L H2O2處理后,與CK組相比,PC-3細(xì)胞中熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)(P<0.01)。蝦青素預(yù)處理組可以降低H2O2處理所致細(xì)胞內(nèi)升高的ROS水平,且與蝦青素劑量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān),即蝦青素濃度越高,細(xì)胞內(nèi)ROS水平越低。20 μmol/L蝦青素預(yù)處理后,細(xì)胞內(nèi)ROS水平與CK組相比無顯著性差異,結(jié)果表明,蝦青素可以抑制或清除H2O2誘導(dǎo)的ROS的產(chǎn)生。

    2.4 蝦青素對H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的PC-3細(xì)胞凋亡的影響

    圖4 蝦青素對H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的PC-3細(xì)胞凋亡率的影響Fig. 4 Effect of astaxanthin on cell apoptosis of PC-3 cells with oxidative stress induced by H2O2

    表1 蝦青素對H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的PC-3細(xì)胞凋亡中B1、B2、B3、B4區(qū)所占比例變化Table 1 Percentage changes of B1, B2, B3 and B4 area in apoptosis of PC-3 cells with oxidative stress induced by H2O2 after astaxanthin treatment

    細(xì)胞經(jīng)Annexin V-FITC和PI染色后可通過流式細(xì)胞儀將細(xì)胞區(qū)別為死亡細(xì)胞(B1)、晚期凋亡細(xì)胞(B2)、正常細(xì)胞(B3)和早期凋亡細(xì)胞(B4)。如圖4和表1,PC-3細(xì)胞經(jīng)H2O2氧化損傷后,細(xì)胞凋亡率快速上升,無蝦青素處理組細(xì)胞凋亡率為51.4%,明顯高于CK組。不同濃度蝦青素處理后,PC-3細(xì)胞的凋亡率分別下降到39.8%、29.5%和14.8%,濃度越大,凋亡率越小。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明H2O2可以導(dǎo)致PC-3細(xì)胞快速凋亡,蝦青素處理可以降低其細(xì)胞凋亡率。

    2.5 蝦青素對H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的PC-3細(xì)胞中Bcl-2/Bax表達(dá)水平和caspase-3激活的影響

    圖5 蝦青素對H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的PC-3細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響Fig. 5 Effect of astaxanthin on Bcl-2 and Bax family protein expression in PC-3 cells with oxidative stress induced by H2O2

    在細(xì)胞凋亡的過程中,凋亡負(fù)調(diào)控蛋白Bcl-2和凋亡正調(diào)控蛋白Bax的調(diào)控是凋亡的關(guān)鍵因素,尤其是Bcl-2/Bax比率是啟動細(xì)胞凋亡的“分子開關(guān)”。因此,分析了蝦青素對H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激引起的Bcl-2/Bax比率變化的影響。如圖5A所示,H2O2處理組引起B(yǎng)cl-2蛋白表達(dá)的下降,同時增加了Bax蛋白的表達(dá),導(dǎo)致Bcl-2/Bax比率降低(圖5B)。蝦青素處理能夠抑制H2O2引起的Bcl-2/Bax比率下降。

    圖6 蝦青素對H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的PC-3細(xì)胞cleaved caspase-3蛋白表達(dá)的影響Fig. 6 Effect of astaxanthin on cleaved caspase-3 protein expression in PC-3 cells with oxidative stress induced by H2O2

    caspase-3的激活會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。如圖6所示,H2O2處理24 h后,cleaved caspase-3的表達(dá)明顯上升,而蝦青素+H2O2處理的細(xì)胞中,cleaved caspase-3的表達(dá)下降,表明蝦青素能抑制H2O2引起的caspase-3的激活。

    2.6 蝦青素對H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的PC-3細(xì)胞MAPK通路的影響

    圖7 蝦青素對H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的PC-3細(xì)胞ERK、JNK、p38通路的影響Fig. 7 Effect of astaxanthin on ERK, JNK and p38 signaling pathways in PC-3 cells with oxidative stress induced by H2O2

    MAPK家族的激活參與氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡,目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)JNK和p38的激活介導(dǎo)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程[13]。如圖7B1、B2、C1、C2所示,PC-3細(xì)胞經(jīng)H2O2誘導(dǎo)后,p-JNK和p-p38顯著上升(P<0.01),表明JNK和p38途徑被激活,細(xì)胞凋亡上升,而蝦青素+H2O2處理可以抑制H2O2引起的JNK和p38的磷酸化,降低細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生。ERK是一種多功能蛋白激酶,其激活水平?jīng)Q定了細(xì)胞存活與否。H2O2誘導(dǎo)的PC-3細(xì)胞中,ERK通路相比CK組被抑制,細(xì)胞凋亡顯著上升(P<0.05),而蝦青素+H2O2處理組,ERK水平顯著上升,與H2O2組相比,差異顯著(P<0.05)(圖7A1、A2)。

    2.7 蝦青素對Nrf2和HO-1表達(dá)的影響

    圖8 蝦青素對PC-3細(xì)胞Nrf2、HO-1表達(dá)的影響Fig. 8 Effect of astaxanthin on Nrf2 and HO-1 expression in PC-3 cells

    Nrf2是調(diào)節(jié)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子,當(dāng)氧化應(yīng)激發(fā)生后,Nrf2從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)入細(xì)胞核,轉(zhuǎn)入細(xì)胞核后,與抗氧化元件ARE相結(jié)合,啟動ARE調(diào)節(jié)的Ⅱ相酶的表達(dá)。如圖8A1、A2所示,正常情況下,PC-3細(xì)胞中Nrf2磷酸化水平較低,當(dāng)蝦青素作用后,顯著促進(jìn)Nrf2的表達(dá)(P<0.05),并呈濃度依賴性。HO-1在保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激中發(fā)揮著非常重要的作用。因此研究了不同濃度蝦青素對PC-3細(xì)胞中HO-1的影響,結(jié)果表明蝦青素能夠促進(jìn)HO-1的表達(dá),促進(jìn)效果與濃度呈正相關(guān)(圖8B1、B2)。

    2.8 蝦青素對ERK和PI3K/Akt的影響

    圖9 蝦青素對PC-3細(xì)胞ERK和Akt通路的影響Fig. 9 Effect of astaxanthin on ERK and Akt signaling pathways of PC-3 cells

    圖10 ERK和Akt通路抑制劑對PC-3細(xì)胞核內(nèi)Nrf2表達(dá)的影響Fig. 10 Effect of U0126 and LY294002 on nuclear Nrf2 expression in PC-3 cells

    ERK和Akt的激活是參與細(xì)胞抗氧化應(yīng)激的主要激酶,因此研究了它們的激活水平對Nrf2激活及HO-1表達(dá)的影響。如圖9A所示,不同濃度的蝦青素處理引起p-ERK和p-Akt水平的明顯上升,表明蝦青素可以激活ERK和PI3K/Akt通路,并呈濃度依賴性。進(jìn)而通過ERK抑制劑和Akt抑制劑預(yù)處理PC-3細(xì)胞1 h,而后再用20 μmol/L蝦青素處理24 h。由圖10可知,CK組細(xì)胞核內(nèi)Nrf2表達(dá)量較低,蝦青素處理能夠迅速升高Nrf2在細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá),當(dāng)ERK和PI3K/Akt通路被抑制后,細(xì)胞核內(nèi)Nrf2的表達(dá)顯著降低(P<0.01)。結(jié)果表明,蝦青素通過ERK和PI3K/Akt激活Nrf2,進(jìn)而上調(diào)HO-1的表達(dá)。

    2.9 蝦青素對ERK通路抑制H2O2介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的影響

    圖11 U0126、SP600125和SB203580對H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的PC-3細(xì)胞存活率的影響Fig. 11 Effect of U0126, SP600125 and SB203580 on cell viability of PC-3 cells with oxidative stress induced by H2O2

    為了闡明MAPK通路在H2O2介導(dǎo)的細(xì)胞毒性損傷中的作用,研究了ERK抑制劑(U0126)、JNK抑制劑(SP600125)和p38蛋白抑制劑(SB203580)對H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞存活率的影響。如圖11所示,H2O2處理引起細(xì)胞存活率的顯著下降(P<0.01),蝦青素的預(yù)處理可以顯著提高其存活率(P<0.05)。當(dāng)SP600125和SB203580預(yù)處理1 h后,并沒有影響蝦青素對PC-3細(xì)胞的保護(hù)作用,而用ERK抑制劑預(yù)處理1 h后再經(jīng)蝦青素處理后,細(xì)胞的存活率顯著下降(P<0.01),并低于H2O2對照組,表明ERK通路參與了蝦青素抑制H2O2介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。

    3 討 論

    機(jī)體內(nèi)ROS水平與抗氧化防御系統(tǒng)之間的平衡被打破后往往會引起氧化應(yīng)激,其產(chǎn)生的ROS超過了內(nèi)源性抗氧化酶系統(tǒng)的抗氧化能力,進(jìn)而引起脂質(zhì)過氧化、蛋白和DNA氧化狀態(tài)異常、細(xì)胞凋亡等問題[14]。很多研究表明,蝦青素處理能夠保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷[15-17],提高細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)[18-19],而蝦青素對前列腺癌細(xì)胞的影響及其通路相關(guān)的研究依然較少。研究發(fā)現(xiàn),蝦青素處理能夠提高氧化應(yīng)激的PC-3細(xì)胞存活率,并通過提高Bcl-2/Bax比率及抑制caspase-3的激活來降低細(xì)胞凋亡率,同時能夠顯著降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平。

    正常情況下,PC-3細(xì)胞中Nrf2磷酸化水平較低[20-21],當(dāng)蝦青素作用后,顯著促進(jìn)Nrf2的表達(dá),并呈濃度依賴性,同時蝦青素能促進(jìn)HO-1的表達(dá),與濃度呈正相關(guān)。研究表明[22],Nrf2/ARE通路的激活能夠啟動和誘導(dǎo)Ⅱ相酶的表達(dá),如HO-1、NQO1等,這些酶能夠保護(hù)機(jī)體免受ROS的侵害[23-25],從而增強(qiáng)細(xì)胞對抗氧化應(yīng)激的能力,達(dá)到降低氧化損傷或恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)。許多天然產(chǎn)物,如七葉苷、姜黃素等都能通過Nrf2/ARE通路激活Nrf2,從而抵抗氧化應(yīng)激損傷[26]。

    為了研究ERK和PI3K/Akt通路是否參與蝦青素對Nrf2和HO-1的調(diào)節(jié),分別加入ERK抑制劑(U0126)和PI3K/Akt抑制劑(LY294002)預(yù)處理1 h,然后再加入蝦青素處理24 h檢測Nrf2和HO-1的表達(dá)。結(jié)果表明U0126和LY294002預(yù)處理組中細(xì)胞核內(nèi)的Nrf2的表達(dá)明顯下降,同時HO-1的表達(dá)也受到了抑制。這表明ERK和PI3K/Akt通路介導(dǎo)了PC-3細(xì)胞中Nrf2和HO-1的表達(dá)。Choi等[27]研究發(fā)現(xiàn)加入ERK抑制劑(PD98059和U0126)能夠抑制Nrf2的核轉(zhuǎn)移,顯著降低細(xì)胞核內(nèi)Nrf2的表達(dá)。Chai Jianshen等[28]研究發(fā)現(xiàn)胍丁胺可以通過激活PI3K/Nrf2誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)來減輕脂多糖引起的ROS積累。陳林等[29]研究表明蛋白激酶C、ERK可能通過上調(diào)Nrf2,進(jìn)而上調(diào)γ-GCS的表達(dá)。這些結(jié)果表明Nrf2和HO-1的表達(dá)受到上游多條通路的影響,而其中ERK和PI3K/Akt通路是其中最重要的兩條通路。

    進(jìn)一步研究蝦青素提高H2O2引起的細(xì)胞存活率是否經(jīng)MAPK通路介導(dǎo),分別加入ERK抑制劑(U0126)、JNK抑制劑(SP600125)和p38抑制劑(SB203580)。結(jié)果表明SP600125和SB203580預(yù)處理1 h后,并沒有影響蝦青素對PC-3細(xì)胞的保護(hù)作用,而用U0126預(yù)處理1 h后再經(jīng)蝦青素處理后,細(xì)胞的存活率顯著下降,表明蝦青素通過ERK通路來抑制H2O2介導(dǎo)的對PC-3細(xì)胞的毒性。

    蝦青素能夠顯著降低H2O2誘導(dǎo)的PC-3細(xì)胞中ROS的積累,并通過上調(diào)Bcl-2/Bax的比率,抑制caspase-3的激活,從而降低細(xì)胞的凋亡。蝦青素提高H2O2引起的細(xì)胞存活率下降是通過MAPK途徑中的ERK通路,而不是JNK和p38通路;另一方面,蝦青素能通過激活Nrf2,使Nrf2從Keap1-Nrf2的復(fù)合體上脫離,從胞質(zhì)轉(zhuǎn)入細(xì)胞核,進(jìn)而與ARE結(jié)合,上調(diào)HO-1的表達(dá)以抵抗細(xì)胞的氧化應(yīng)激。蝦青素誘導(dǎo)HO-1表達(dá)上調(diào),其上游機(jī)制涉及ERK和PI3K/Akt通路。

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