信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)接頭蛋白2和輸入蛋白5表達(dá)對(duì)骨骼肌蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)的影響①

劉雪云，徐守宇

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院，浙江杭州市310000；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江杭州市310053

骨骼肌穩(wěn)態(tài)取決于蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)的動(dòng)態(tài)平衡。老年人及許多疾病患者很難承受高強(qiáng)度耐力訓(xùn)練，即＞70%單次最大負(fù)荷量(one repetition maximum,1RM)，每周3次并維持5～12周[1-2]。既往研究表明[3-7]，阻血結(jié)合低強(qiáng)度抗阻訓(xùn)練(20%～30%1RM)，在增加肌肉體積和力量方面，可產(chǎn)生與高強(qiáng)度抗阻訓(xùn)練相似的效果，且安全有效。前期我們開(kāi)發(fā)了阻血誘導(dǎo)骨骼肌肥大大鼠模型[8]，基因芯片研究發(fā)現(xiàn)，阻血后超過(guò)2倍變化的基因共1649個(gè)，其中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)接頭蛋白-2(signal-transducing adaptor protein-2,STAP2)和輸入蛋白5(importin 5,Ipo5)有顯著變化[9]。

myostatin是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor-β,TGF-β)超家族成員之一，是肌肉生長(zhǎng)的負(fù)調(diào)節(jié)因子[10]，在維持肌肉蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡中有重要作用。本研究通過(guò)shRNA慢病毒感染靶基因STAP2和Ipo5，檢測(cè)不同狀態(tài)下STAP2、Ipo5和myostatin表達(dá)，探討STAP2和Ipo5對(duì)骨骼肌蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康雄性清潔級(jí)Sprague-Dawley大鼠12只，初始體質(zhì)量(310±10)g，鼠齡32周，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供并飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件：溫度24～26℃，濕度55%～65%，24 h循環(huán)光照，普通飼料喂養(yǎng)，自由攝食和飲水。采用隨機(jī)數(shù)字法分為模型組和對(duì)照組，每組6只。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)大鼠的處置嚴(yán)格遵守動(dòng)物倫理準(zhǔn)則和指南的相關(guān)規(guī)定。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

myostatin抗體、GAPDH抗體：美國(guó)PROTEINTECH公司。Ipo5抗體、STAP2抗體：北京博奧森公司。第二抗體：Jackson分裝?；騃po5、STAP2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒：美國(guó)INVITROGEN公司。ECL試劑盒、PVDF膜(0.45 μm)：德國(guó)MILLIPORE公司。GL-400SD超聲波細(xì)胞破碎儀：南京先歐儀器制造有限公司。5810R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：北京離心機(jī)廠。SDS-PAGE蛋白凝膠電泳儀、垂直電泳轉(zhuǎn)移儀：美國(guó)BIO-RAD公司。BTY型脫色搖床：江蘇太倉(cāng)醫(yī)用儀器廠。FluorChem HD2凝膠成像分析系統(tǒng)：美國(guó)PROTEINSIMPLE公司。微量移液器：德國(guó)EPPENDORF公司。

1.3 模型制備

參照前期研究[8]制備阻血誘導(dǎo)大鼠骨骼肌肥大模型。模型組右后肢在膝上方近關(guān)節(jié)處用橡皮筋捆扎，每次30 min，每周2次，共2周。捆扎時(shí)在MoorFCPI散斑全幀實(shí)時(shí)掃描成像系統(tǒng)下觀察外周循環(huán)血流，判斷是否阻血成功。最后一次捆扎24 h后，所有大鼠腹膜注射戊巴比妥鈉1.5 ml/kg麻醉，分離比目魚肌，稱重，立即異戊烷和液氮冷凍，進(jìn)行細(xì)胞體外培養(yǎng)。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

將比目魚肌用胰蛋白酶處理成單個(gè)細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)液中，入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用shRNA慢病毒及過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染模型組細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)候選基因STAP2和Ipo5的敲落、過(guò)表達(dá)和功能挽救。對(duì)照組正常培養(yǎng)。

1.4.1 基因沉默

轉(zhuǎn)染前24 h將待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞置12孔板。加入完全培養(yǎng)基(含有血清和抗生素)1 ml孵育過(guò)夜。轉(zhuǎn)染當(dāng)天細(xì)胞應(yīng)達(dá)到約50%平鋪。準(zhǔn)備完全培養(yǎng)基和Polybrene?混合物，Polybrene終濃度為5μg/ml。移去培養(yǎng)基并每孔添加Polybrene/培養(yǎng)基混合物于1 ml。在室溫下溶化慢病毒顆粒，輕輕混勻，加入培養(yǎng)液中；輕輕振動(dòng)培養(yǎng)板使其混勻并孵育過(guò)夜。移去混合培養(yǎng)液，添加完全培養(yǎng)基(不含Polybrene)1 ml，孵育細(xì)胞過(guò)夜。選擇穩(wěn)定表達(dá)shRNA的克隆，根據(jù)細(xì)胞類型不同將其分成1∶3到1∶5，繼續(xù)在完全培養(yǎng)基中孵育24～48 h。以后每天用Puromycindihydrochloriede篩選穩(wěn)定表達(dá)shRNA的克隆。

1.4.2 基因過(guò)表達(dá)

轉(zhuǎn)染前1 d，將1.5×105細(xì)胞接種于12孔板，加不含抗生素的完全培養(yǎng)基500 μl，保證轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞匯合達(dá)90%～95%。將總RNA 0.8 μg稀釋于無(wú)血清無(wú)抗生素培養(yǎng)液50 μl中輕輕混勻。將Lipofectamine 2000 2 μl稀釋于無(wú)血清無(wú)抗生素培養(yǎng)液50 μl中，輕輕混勻，室溫孵育5 min。將以上兩種液體混合，輕輕混勻，室溫孵育20 min。吸去培養(yǎng)板的培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞2次。將復(fù)合物(總體積100 μl)加入培養(yǎng)孔，前后搖動(dòng)培養(yǎng)板使其分布均勻。置培養(yǎng)箱孵育4～6 h，更換含血清培養(yǎng)液，去除復(fù)合物。48 h后觀察轉(zhuǎn)入基因表達(dá)情況。

1.4.3 基因挽救

細(xì)胞基因沉默24 h后，在候選基因過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染(操作同前)，實(shí)現(xiàn)基因挽救。

1.5 Western blotting

收集各組比目魚肌細(xì)胞，PBS洗2遍，RIPA裂解液裂解30 min，4℃、12000 r/min離心10 min。收集上清液，加DEPC處理的去離子水20 ml溶解，-80℃保存。

提取的蛋白質(zhì)6%和10%SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)至甲醇浸透的PVDF膜上，TBST(含150 mmol/L Na-CI、10 mmol/L Tris-HCI、0.5%Tween 20，pH=7.5)洗滌 10 min，共 3 遍 ，加 Ipo5(1∶200)、STAP2(1∶200)、myostatin(1∶1000)、GAPDH(1∶2000)一抗，4℃冰箱過(guò)夜。TBST洗膜10 min，共3遍；滴加生物素化二抗(1∶10000)，TBST洗膜10 min，共3遍；滴加ECL發(fā)光液孵育5 min，顯影，凝膠成像儀照相記錄。Image-Pro Plus掃描條帶，計(jì)算相對(duì)灰度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。STAP2、Ipo5及myostatin相對(duì)表達(dá)量均以(±s)表示，對(duì)照組和模型組兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；模型組、沉默組、過(guò)表達(dá)組和挽救組多組間比較采用單因素方差分析，事后兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

模型組較對(duì)照組STAP2表達(dá)顯著升高，Ipo5和myostatin表達(dá)顯著下降(P＜0.001)。見(jiàn)表1、表2。

shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染各組中，與模型組比較，沉默組STAP2表達(dá)下降，myostatin表達(dá)上升(P＜0.05)，過(guò)表達(dá)組STAP2升高，myostatin表達(dá)下降(P＜0.05)，挽救組STAP2和myostatin表達(dá)介于沉默和過(guò)表達(dá)之間，見(jiàn)表3、圖1。與模型組比較，沉默組Ipo5和myostatin表達(dá)下降(P＜0.05)，過(guò)表達(dá)組Ipo5和myostatin表達(dá)上升(P＜0.05)，挽救組Ipo5和myostatin表達(dá)介于沉默和過(guò)表達(dá)之間。見(jiàn)表4、圖2。對(duì)照組、模型組、沉默組、過(guò)表達(dá)組、挽救組基因myostatin表達(dá)隨STAP2降低而升高，隨Ipo5升高而升高。

表1 兩組STAP2和myostain蛋白表達(dá)

表2 兩組Ipo5和myostain蛋白表達(dá)

表3 各轉(zhuǎn)染組STAP2和myostain蛋白表達(dá)

表4 各轉(zhuǎn)染組Ipo5和myostain蛋白表達(dá)

圖2 各組Ipo5和myostain蛋白表達(dá)

3 討論

流行病學(xué)研究表明，90%以上與抗阻訓(xùn)練相關(guān)的損傷是由于肌肉超負(fù)荷引起[11]。阻血可有效防止高強(qiáng)度抗阻訓(xùn)練帶來(lái)的肌肉損傷[12-13]。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)和磷脂酰肌醇 3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/Akt/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)兩個(gè)信號(hào)通路是控制蛋白質(zhì)合成的主要途徑[14-16]。阻血結(jié)合低強(qiáng)度抗阻訓(xùn)練可顯著激活上述兩條信號(hào)通路[17-19]。運(yùn)動(dòng)刺激還激活Wnt信號(hào)通路，進(jìn)而恢復(fù)因年齡或肌源性疾病引起的肌肉損傷[20]。

本研究顯示，STAP2的表達(dá)水平和myostatin相反，提示STAP2表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)蛋白質(zhì)合成。GTPase活化酶可以激活MAPK三種不同的信號(hào)通路[21]。GTPase酶屬于Rho家族，包括Rho、Rac和Cdc42，在肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)組織中發(fā)揮中心作用[22]。已有研究發(fā)現(xiàn)，STAP2可以直接激活Rac和Cdc42[23]，也可以通過(guò)Src同源2域，間接銜接黏著斑激酶到Grb2銜接蛋白，間接激活MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路[24]。

含IQ基元GTP酶激活蛋白1(IQ motif containing GTPase activating protein 1,IQGAP1)可調(diào)節(jié)Cdc42和Rac的活性[25]，可與肌動(dòng)蛋白結(jié)合，參與細(xì)胞骨架的重組、細(xì)胞黏附及細(xì)胞周期等多種細(xì)胞過(guò)程；而Ipo5可通過(guò)Wnt信號(hào)通路調(diào)節(jié)IQGAP1蛋白的轉(zhuǎn)錄[26]。我們推測(cè)，Ipo5可能通過(guò)Wnt和MAPK信號(hào)通路，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)，進(jìn)而影響骨骼肌肥大。

有臨床研究表明，阻血訓(xùn)練24 h后，肌肉蛋白質(zhì)合成明顯增加，而蛋白質(zhì)降解未受明顯抑制[17]。Booth[27]研究顯示，蛋白質(zhì)合成減少可能在肌肉萎縮的始動(dòng)發(fā)生中起重要作用[28]。我們推測(cè)，阻血對(duì)骨骼肌肥大的急性效應(yīng)和慢性效應(yīng)機(jī)制可能并不相同。但本研究未觀察阻血與基因表達(dá)的關(guān)聯(lián)，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，阻血下，STAP2和Ipo5可通過(guò)不同信號(hào)通路調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)，進(jìn)而維持骨骼肌動(dòng)態(tài)平衡。未來(lái)需進(jìn)一步明確基因表達(dá)隨阻血時(shí)間不同的變化曲線，從而最大程度促進(jìn)骨骼肌肥大。

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