60Co輻照對柴葛退熱散主要有效成分含量及滅菌效果的影響

張 強(qiáng), 劉亮鏡, 秦亞東* (. 安徽中醫(yī)藥高等專科學(xué)校 藥學(xué)系，安徽 蕪湖 400；. 蕪湖市中醫(yī)醫(yī)院 制劑室，安徽 蕪湖 4003)

柴葛退熱散為蕪湖市中醫(yī)醫(yī)院院內(nèi)協(xié)定處方制劑，臨床療效確切。本方由柴胡、葛根、黃芩、升麻、薄荷、蘆根、甘草、鴨跖草、石膏、知母共十味中藥組成，具有清熱解毒，解肌退熱的功效，臨床主要用于惡寒發(fā)熱、頭身疼痛、咽痛煩渴等外感發(fā)熱的治療。

柴葛退熱散工藝為凈中藥材粉碎，按內(nèi)服散劑微生物控制要求需要進(jìn)一步滅菌處理，2015版《中國藥典》中就明確規(guī)定了散劑的微生物限度檢查項(xiàng)目?，F(xiàn)常用的控制微生物限度的方法有干熱滅菌、濕熱滅菌、微波滅菌、紫外滅菌法等[1-2]。由于本方中薄荷含有揮發(fā)性的薄荷腦成分，導(dǎo)致上述滅菌方法往往不能滿足中藥制劑中多種藥材同時滅菌的條件，增加了中藥制劑微生物限度控制的難度。60Co輻照滅菌是在常溫下進(jìn)行滅菌，避免了高溫條件下?lián)]發(fā)性成分的揮發(fā)，一般認(rèn)為對制劑中薄荷腦等揮發(fā)性成分不造成影響，另外衛(wèi)生部1997年38號文件“允許輻照中藥材”目錄發(fā)現(xiàn)柴葛退熱散絕大多數(shù)成分是適合60Co輻照滅菌。李計萍[3]在討論γ射線輻照滅菌的問題時指出大多數(shù)僅以滅菌效果為考察指標(biāo)，未對輻照劑量和前后有效性等進(jìn)行深入研究，因此輻照劑量與滅菌效果以及輻照前后可測定的主要有效成分含量有無變化是考察的重點(diǎn)[4-6]。

為了保證柴葛退熱散制劑工藝及質(zhì)量，選用60Co輻照對柴葛退熱散中微生物限度控制進(jìn)行研究，通過不同強(qiáng)度的60Co-γ射線輻照，比較輻照前后柴葛退熱散中主要有效成分的化學(xué)變化及其微生物含量變化，判斷柴葛退熱散是否適宜60Co輻照滅菌，從而為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供理論支持，確保臨床用藥安全有效。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品及試劑 葛根素對照品(批號110752-201313)、甘草苷對照品(批號 111610-201106)、黃芩苷對照品(批號 110715-201318)購自中國食品藥品檢定研究院。三氯甲烷、石油醚(30～60℃)、甲酸乙酯、甲酸、甲苯、冰醋酸等為分析純，磷酸、甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水。

1.1.2 儀器 Agilent 1200型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)、Mettler Toledo XP205電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)、UPS-11-10T優(yōu)普系列超純水器(成都優(yōu)普凈化科技有限公司)、BFT-4型60℃輻照裝置(北京三強(qiáng)核力輻照工程技術(shù)有限公司)、SPX-150B-Z生化培養(yǎng)箱(上海書培實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、MJX-160B-Z霉菌培養(yǎng)箱(上海右一儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 柴葛退熱散制備 按柴葛退熱散處方中各藥材規(guī)定比例，選取藥材飲片，分別稱取各藥材飲片共計10 kg，將藥材飲片混合后用粉碎機(jī)粉碎，過65目篩，未過篩的粗粉繼續(xù)粉碎，直至完全通過篩網(wǎng)，即得柴葛退熱散混合粉末。

1.2.2 輻照滅菌 樣品輻照滅菌由南京喜悅輻照有限公司進(jìn)行輻照處理，輻照源為60Co，輻照劑量分別為 1 kGy、2 kGy、3 kGy。

1.2.3 輻照前后性狀比較 通過日光下目視、口嘗、鼻嗅對柴葛退熱散外觀聚集狀態(tài)、色澤、氣味、味道進(jìn)行直觀判斷。

1.2.4 對照品溶液的制備 取葛根素、黃芩苷和甘草苷對照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成葛根素26.72 μg/mL、黃芩苷432.5 μg/mL、甘草苷16.81 μg/mL的混合對照品溶液。

1.2.5 供試品溶液的制備 精密稱取本品約5.0 g，置具塞錐形瓶中，精密加入30% 乙醇100 mL，稱定重量，水浴回流30 min，放冷，再稱定，用30%乙醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。

1.2.6 葛根素、甘草苷和黃芩苷的含量測定 精密稱取不同批號(150825、150826、150827)柴葛退熱散(60Co輻照前)、柴葛退熱散(60Co輻照1 kGy)、柴葛退熱散(60Co輻照2 kGy)、柴葛退熱散(60Co輻照3 kGy)各約5.0 g，按“1.2.5”項(xiàng)下方法處理樣品。參照課題組前期確定測定方法：色譜柱為Agilent ZORBA SB-C18(150×4.6 mm，5 μm)，以乙腈-甲醇-0.1%磷酸(V/V)為流動相，1.0 mL/min，檢測波長237 nm，柱溫30℃，梯度洗脫[7]，分別精密吸取混合對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄數(shù)據(jù)，平行測定3次，按外標(biāo)一點(diǎn)法計算平均含量。

1.2.7 微生物檢查 按照2015年版《中國藥典》第四部通則中非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查[8]：通則 1105(微生物計數(shù)法)、通則1106(控制菌檢查法)及通則 1107(非無菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn))檢查60Co輻照前后柴葛退熱散需氧菌總數(shù)、霉菌及酵母菌總數(shù)、大腸埃希菌數(shù)和沙門菌數(shù)的變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 輻照前后柴葛退熱散性狀比較

輻照前后柴葛退熱散樣品的外觀、聚集狀態(tài)、色澤、嗅、味均未發(fā)生明顯變化,說明60Co輻照對柴葛退熱散性狀沒有明顯影響，60Co輻照前后柴葛退熱散性狀未見明顯改變。

2.2 輻照前后化學(xué)成分及葛根素、黃芩苷和甘草苷含量比較

在同一色譜條件下，60Co輻照前后HPLC色譜圖譜進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)輻照前后主要有效成份HPLC圖譜基本一致，說明輻照前后柴葛退熱散化學(xué)成分無明顯變化；依據(jù)葛根素、黃芩苷和甘草苷對照品和輻照前后樣品HPLC圖譜中三成分的保留時間tR及在線DAD掃描紫外光譜圖完全一致(圖1)[9]。因此輻照前后柴葛退熱散中葛根素、黃芩苷和甘草苷化學(xué)成分均未發(fā)生變化。

圖1 柴葛退熱散輻照前HPLC圖譜(1-A)；柴葛退熱散輻照后HPLC圖譜(1-B)；混合對照品HPLC圖譜(1-C)(1.葛根素;2.甘草苷;3.黃芩苷)。

Fig.1 HPLC chromatograms of Chaige tuire powder before irradiation(1-A);HPLC chromatograms of Chaige tuire powder after e irradiation(1-B);HPLC chromatograms of reference substance mixture(1.puerarin;2. liquiritin;3. baicalin).

由表1可以看出輻照前后葛根素和黃芩苷的含量最大波動在2%以內(nèi)；盡管甘草苷含量較低，積分誤差大，然輻照前后甘草苷含量最大波動仍小于5%，說明輻照劑量低于3 kGy時對柴葛退熱散中主要成分葛根素、甘草苷和黃芩苷的含量影響可以忽略不計。輻照后各成分與輻照前含量無顯著性差異(P>0.05)。

表1 柴葛退熱散輻照前后含量及微生物比較(n=3)Table 1 Comparison of contents and microorganisms before and after irradiation for Chaige Tuire powder(n=3)

注：a:批號150825；b:批號150826；c:批號150827。

Note：a represents batch number 150825；b represents batch number150826；c represents batch number150827.

2.3 輻照前后微生物含量比較

通過對三批柴葛退熱散分別進(jìn)行輻照前、1 kGy劑量60Co輻照、2 kGy劑量60Co輻照、3kGy劑量60Co輻照的樣品按照1.2.7項(xiàng)下進(jìn)行微生物限度檢查，檢查結(jié)果(見表2)發(fā)現(xiàn)輻照前柴葛退熱散的微生物數(shù)量高于2015年版《中國藥典》[10]內(nèi)服散劑項(xiàng)下微生物限量，不符合藥典要求。依據(jù)表2中的結(jié)果，對同批柴葛退熱散在輻照前和不同劑量60Co輻照后微生物含量對比，發(fā)現(xiàn)三批樣品輻照后微生物含量均較輻照前顯著下降，表現(xiàn)為輻照后的需氧菌總數(shù)均在輻照前的20%以內(nèi)，輻照后的霉菌及酵母菌總數(shù)均在輻照前的25%以內(nèi)，且需氧菌總數(shù)、霉菌及酵母菌總數(shù)隨60Co輻照劑量的增加逐漸遞減；當(dāng)60Co輻照劑量為2 kGy時，霉菌及酵母菌均已無法檢出，檢測結(jié)果呈現(xiàn)零的狀態(tài)；當(dāng)輻照劑量為3 kGy時，不但霉菌和酵母菌均未檢出，需氧菌總數(shù)也已不足輻照前的1%，大腸埃希菌和沙門菌均未在各批樣品中檢出。輻照后各成分與輻照前含量具顯著性差異(P<0.05)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)輻照劑量為3 kGy時即可保證柴葛退熱散微生物含量符合2015年版《中國藥典》內(nèi)服散劑項(xiàng)下微生物限度要求。

表2 柴葛退熱散輻照前后含量及微生物比較(n=3)Table 2 Comparison of contents and microorganisms before and after irradiation for Chaige Tuire powder(n=3)

續(xù)表2Table 2 Continued

注：a:批號150825、b:批號150826、c:批號150827、N表示未檢出;△表示P<0.05。

Note：a represents batch number 150825;b represents batch number 150826; c represents batch number 150827; N indicates that it is not detected;△indicateP<0.05.

3 結(jié)論與討論

柴葛退熱散屬于治療表證外感發(fā)熱，研究發(fā)現(xiàn)，柴葛退熱散中的主要有效成分葛根素、甘草苷和黃芩苷的含量在60Co輻照前后無明顯變化，而微生物含量在60Co輻照后明顯減少，尤其在3 kGy輻照劑量時，能夠較好地抑制微生物的生長，控制微生物的限度，符合國家藥典散劑項(xiàng)下的微生物限量標(biāo)準(zhǔn)。60Co輻照滅菌與紫外滅菌相比較具有穿透力強(qiáng)的特點(diǎn)，適合大批量的藥材滅菌；與濕熱滅菌比較，能夠在常溫下進(jìn)行滅菌，不影響處方中藥物的揮發(fā)性成分及不耐熱成分，60Co輻照滅菌主要是通過γ射線損壞生物體的DNA和RNA，使細(xì)菌失去蛋白質(zhì)合成和遺傳功能而死亡，具有安全、有效、經(jīng)濟(jì)、綠色、節(jié)能等特點(diǎn)，操作簡單、方便，適合含有多種藥物的中藥制劑的滅菌處理。

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