犬乳腺瘤的臨床病理學(xué)分析

沈清霞， 苗懋東， 張 毅， 董 妍， 芮 榮* (.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 0095；.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 83005)

寵物犬作為常見(jiàn)的伴侶動(dòng)物，其健康問(wèn)題一直倍受重視。隨著現(xiàn)代醫(yī)療水平的提高，寵物犬的壽命得以有效延長(zhǎng)，但伴隨著環(huán)境刺激等因素的增加，腫瘤已成為危害犬只生命的一大殺手。腫瘤是動(dòng)物機(jī)體內(nèi)遺傳物質(zhì)改變?cè)斐杉?xì)胞增殖、分化過(guò)程失控而形成的病理性贅生物，分為良性和惡性兩種基本類型。影響犬腫瘤發(fā)病的因素很多，如動(dòng)物品種、年齡等因素導(dǎo)致的免疫功能下降和內(nèi)分泌失調(diào)，飼養(yǎng)環(huán)境中的各種理化刺激等，均可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。在寵物犬腫瘤中，乳腺腫瘤在雌犬腫瘤疾病中占比較大，臨床發(fā)病率達(dá)腫瘤病例數(shù)的50%或以上，且其中半數(shù)為惡性乳腺腫瘤[1]。犬乳腺腫瘤具有與人類乳腺腫瘤極為相似的分子生物學(xué)與臨床特征，因此，犬是對(duì)腫瘤進(jìn)行比較醫(yī)學(xué)研究的理想動(dòng)物模型。

相關(guān)研究認(rèn)為眾多臨床因素如品種、年齡及腫瘤大小等，均可以影響犬乳腺腫瘤的發(fā)病及預(yù)后。因此本研究針對(duì)南京地區(qū)寵物犬臨床腫瘤病例，應(yīng)用臨床統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，對(duì)影響犬乳腺腫瘤的多方面因素進(jìn)行研究分析，并根據(jù)新版WHO分類對(duì)犬乳腺腫瘤作出臨床病理學(xué)診斷，為更好地了解犬乳腺腫瘤診斷及預(yù)后提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)時(shí)間段為2015年4月至2016年6月，在南京地區(qū)多家寵物醫(yī)院共收集30例寵物犬乳腺腫瘤門(mén)診病例，手術(shù)治療時(shí)采集腫瘤組織；記錄患犬完整臨床診療資料(主要包括品種、年齡、瘤體大小、性別及絕育情況等)。采集非腫瘤性死亡雌犬的健康乳腺組織樣本作為對(duì)照?；既鶠榇菩裕舶ㄙF賓、博美、蝴蝶等10個(gè)犬種。

1.2 腫瘤組織病理學(xué)診斷

將收集到的犬乳腺腫瘤組織取中心位置1 cm3大小，置于4%中性甲醛固定液中固定24 h后，常規(guī)方法制備蠟塊。切片單位5 μm，HE染色，進(jìn)行組織病理學(xué)分析。

1.3 生存時(shí)間統(tǒng)計(jì)

對(duì)所有有效病例自手術(shù)治療后開(kāi)始計(jì)算生存時(shí)間，每隔3～6個(gè)月電話回訪，直到動(dòng)物死亡(復(fù)發(fā))統(tǒng)計(jì)結(jié)束，結(jié)果用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，Log rank檢驗(yàn)比較組間生存率差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 品種在乳腺腫瘤發(fā)病的關(guān)系

研究結(jié)果說(shuō)明，犬乳腺腫瘤可發(fā)生于多品種之中。30例犬乳腺腫瘤病例中，共包含10個(gè)犬種，其中90%為小型犬只，貴賓犬發(fā)病率最高(33.3%)，博美犬排在第2(16.7%)，詳見(jiàn)圖1。

圖1 犬乳腺腫瘤的品種分布情況Fig.1 The distribution of CMTs in breeds

2.2 年齡增長(zhǎng)對(duì)犬乳腺腫瘤發(fā)病的影響

對(duì)犬乳腺腫瘤發(fā)病年齡分布統(tǒng)計(jì)詳見(jiàn)圖2。腫瘤患犬年齡從4～15歲不等，隨年齡增加發(fā)病率升高。8歲為最常見(jiàn)發(fā)病年齡(26.7%)，8～13歲為主要發(fā)病區(qū)間(80.0%)，13歲之后發(fā)病的患犬?dāng)?shù)量有所下降。

圖2 犬乳腺腫瘤在不同年齡發(fā)生數(shù)量的變化Fig.2 The changing number of CMTs in different ages

2.3 腫瘤大小與發(fā)病的聯(lián)系

對(duì)手術(shù)切除后的犬乳腺腫瘤組織測(cè)量最大直徑，記錄分為3組：(1)<3 cm組10例；(2)≥3 cm且<5 cm組11例；(3)≥5 cm組9例。并將不同直徑腫瘤分組中良惡性比例作圖(圖3)發(fā)現(xiàn)腫瘤大小分布平均(3組分別為33.3%，36.7%和30%)，最大直徑在3～5 cm的腫瘤病例最多且其中惡性占比達(dá)到81.8%，其余2組良惡性之比相近(50.0%/44.4%)。

圖3 腫瘤大小與發(fā)病的關(guān)系Fig.3 The relationship between tumor sizes and the incidence of CMTs

2.4 犬乳腺腫瘤的病理診斷

病理組織學(xué)診斷發(fā)現(xiàn)30例犬乳腺腫瘤包括良性12例(40.0%)：2例腺瘤、4例纖維腺瘤和6例乳頭狀瘤；惡性18例(60.0%)：3例導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀癌、5例混合癌和10例浸潤(rùn)性癌。其中浸潤(rùn)性癌發(fā)病率最高，占總發(fā)病率的33.3%，惡性腫瘤發(fā)病半數(shù)以上(55.6%)。將所有類型腫瘤排序如表1。

表1 不同犬乳腺腫瘤類型發(fā)病情況Table 1 The incidence of various canine mammary tumors

腺瘤是由高分化的腔上皮、肌上皮分別或共同形成的良性乳腺腫瘤，表現(xiàn)為腺管增生，外圍纖維結(jié)締組織包裹，但細(xì)胞大致形態(tài)與正常組織無(wú)異(圖4.A)。乳頭狀瘤可分為導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤以及非典型乳頭狀瘤，導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤主要表現(xiàn)為導(dǎo)管膨大，腔上皮細(xì)胞大量增生呈樹(shù)杈或團(tuán)塊狀聚集于導(dǎo)管內(nèi)(圖4.B)。另一種非典型乳頭狀瘤，主要呈導(dǎo)管外增生，形成分枝、分葉狀(圖4.C)。

惡性腫瘤中浸潤(rùn)性癌非常常見(jiàn)，占本次研究所見(jiàn)惡性腫瘤的55.6%，主要特征表現(xiàn)為瘤細(xì)胞突破基底膜，在間質(zhì)中浸潤(rùn)生長(zhǎng)(圖4.D、E)。這類腫瘤復(fù)發(fā)可能性大，預(yù)后不良?；旌习┦谴舜窝芯堪l(fā)現(xiàn)的另一種常見(jiàn)惡性腫瘤，其惡性組分由腺上皮組織和肌上皮組織共同構(gòu)成，間質(zhì)有時(shí)可見(jiàn)化生現(xiàn)象(圖4.F)。

圖4 犬乳腺腫瘤的組織病理學(xué)特征Fig.4 Histopathological characteristics of CMTs

(A)腺瘤：纖維結(jié)締組織將增生的腺管分隔開(kāi),增生腺管內(nèi)充斥膠原纖維;(B)導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤：導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀突起由大量形狀均一的上皮細(xì)胞構(gòu)成;(C)非典型乳頭狀瘤：增生的不規(guī)則導(dǎo)管占據(jù)整個(gè)視野，管腔內(nèi)充斥膠原纖維。乳頭狀突起上覆蓋的上皮細(xì)胞呈現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)液泡化;(D)浸潤(rùn)性癌：癌細(xì)胞突變基底膜在間質(zhì)中浸潤(rùn)生長(zhǎng)，無(wú)正常腺泡組織。癌細(xì)胞大小不一，含大量胞質(zhì)，細(xì)胞核卵圓;(E)浸潤(rùn)性癌：癌巢中心粉刺樣，外圍細(xì)胞軟骨化生。壞死細(xì)胞呈粉刺樣大量分布于結(jié)締組織之間;(F)混合癌：癌組織成分復(fù)雜，增生大量乳頭狀導(dǎo)管連片成巢，管腔大小不一。癌細(xì)胞異型性大，間質(zhì)粘液化生，嗜堿性。

(A) Adenoma: The extensive ducts are surrounded by fibrous stroma,the ductal filled with collagen fibers.(B) Intraductal papilloma: The intraductal papillary covered a large number of uniform epithelial cells.(C) Atypical papilloma: Hyperplasia of the irregular ducts to occupy the entire field of view, the lumen filled with collagen fibers. Papillary processes covered epithelial cells showed cytoplasmic vacuolization.(D) Invasive carcinoma: cancer cell break basement membrane in the interstitial infiltrative growth, normal ducts invisible. Cancer cells vary in size, with a large number of cytoplasm, nucleus oval.(E) Invasive carcinoma: Cancer nest performed acne-like necrosis, peripheral cell cartilage metaplasia. Necrotic cells were a large number of acne-like distribution between the connective tissue.(F) Mixed carcinoma: The composition of neoplasm is complex, hyperplasia of a large number of papillary catheter into the nest, lumen size varies. Cancer cells showed pleomorphism, interstitial mucus metaplasia, basophilic.

2.5 良惡性腫瘤患犬不同的生存時(shí)間

由于部分病例畜主失聯(lián)，30例腫瘤病例中共收集完整回訪數(shù)據(jù)18例，其中良性腫瘤8例(44.4%)，惡性腫瘤10例(55.6%)。均由患犬實(shí)施手術(shù)治療后開(kāi)始計(jì)算生存時(shí)間，每個(gè)病例最后的狀態(tài)均可分為2類：1——死亡或復(fù)發(fā)；0——失訪或存活。

Kaplan-Meier生存分析曲線結(jié)果(圖5)發(fā)現(xiàn)18例犬乳腺腫瘤病例，手術(shù)后中位生存期為14個(gè)月(1～20個(gè)月)，良性組中位生存期為15個(gè)月(6～20個(gè)月)，惡性組偏低為11個(gè)月(1～15個(gè)月)。良性腫瘤組患犬整體生存時(shí)間較惡性腫瘤組患犬長(zhǎng)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.196)。

圖5 腫瘤類型與患犬生存時(shí)間的關(guān)系Fig.5 The relationship between tumor type and survival of the dogs

3 結(jié)論與討論

犬乳腺腫瘤作為雌犬臨床最常見(jiàn)的腫瘤類型，受到國(guó)內(nèi)外臨床獸醫(yī)界的廣泛關(guān)注。犬乳腺腫瘤與人類乳腺腫瘤在流行病學(xué)特征、臨床表現(xiàn)及預(yù)后因素等方面又十分相似，可作為理想的動(dòng)物腫瘤模型[2-3]。學(xué)界認(rèn)為參與調(diào)控犬乳腺腫瘤發(fā)病和預(yù)后的因素十分復(fù)雜，包括類固醇性激素(特別是雌激素和孕酮)受體的活化，以及關(guān)鍵因子異常導(dǎo)致的某些細(xì)胞增殖與凋亡信號(hào)通路失調(diào)[4]，說(shuō)明深入了解犬乳腺腫瘤生理特點(diǎn)對(duì)臨床及病理學(xué)研究均十分重要。研究發(fā)現(xiàn)犬乳腺腫瘤在不同地區(qū)表現(xiàn)出特異的流行病學(xué)特征，因此本次研究就南京地區(qū)寵物犬乳腺腫瘤各臨床因素與發(fā)病間聯(lián)系以及常見(jiàn)乳腺腫瘤類型進(jìn)行分析，為臨床診斷及治療提供參考。

3.1 品種、年齡、腫瘤大小等因素與腫瘤發(fā)病的聯(lián)系

本次研究采集的30例臨床犬乳腺腫瘤病例，涉及了10個(gè)犬種，其中9個(gè)為小型純種犬，貴賓犬為發(fā)病率最高品種(33.3%)，其次是博美犬(16.7%)、蝴蝶犬(13.3%)，雜交犬占比很小(10.0%)。與Marta[5]等人發(fā)現(xiàn)純種犬發(fā)病率是混血犬兩倍的結(jié)果相似。研究發(fā)現(xiàn)乳腺腫瘤發(fā)病率為薩摩耶犬>杜賓犬>雪納瑞犬>約克夏犬[5]，另有學(xué)者曾指出對(duì)于犬乳腺腫瘤，拳師犬、短毛獵犬、羅威納犬、伯爾尼山地犬是發(fā)病率由高到低的品種排序，這與本次研究結(jié)果有所出入。本次研究中30例乳腺腫瘤患犬除3例雜交犬屬于中大型犬，其余均集中于貴賓、京巴、博美等小型犬品種。分析認(rèn)為國(guó)內(nèi)外養(yǎng)犬品種的不同會(huì)造成這種差距，但乳腺腫瘤在品種間發(fā)病率有偏向這一事實(shí)可以確定，而對(duì)于不同地區(qū)應(yīng)針對(duì)當(dāng)?shù)氐酿B(yǎng)犬習(xí)慣做出高危品種建議，研究表明就南京地區(qū)而言應(yīng)當(dāng)將貴賓犬列為乳腺腫瘤高度關(guān)注犬種。

年齡與犬乳腺腫瘤的發(fā)生有明顯的聯(lián)系，未見(jiàn)1～3歲年齡段發(fā)病，4～6年齡段患犬也非常少見(jiàn)，而在8～13歲年齡段的發(fā)病率突增至80.0%，這之后又有所下降。數(shù)據(jù)結(jié)果與前人研究報(bào)道犬乳腺腫瘤發(fā)病年齡的中位值在8～10歲之間一致[5-6]。有研究表明在2～3.99歲之間犬乳腺腫瘤占所有犬腫瘤的10%，在4～5.99歲之間比例上升到35%，而到6～13.99歲時(shí)，乳腺腫瘤已是母犬首要的發(fā)病腫瘤類型(46%～50%)，14歲之后比例下滑至40%[7]。發(fā)生這種情況的主要原因是犬乳腺腫瘤的發(fā)病與機(jī)體激素含量關(guān)系密切，雌犬在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)經(jīng)歷周期性的發(fā)情及懷孕過(guò)程，在此過(guò)程中乳腺組織會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化以促進(jìn)乳汁分泌，造成乳腺組織突變概率上升。部分未絕育但從未生育的雌犬由于生理周期的破壞，腫瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)更高，1歲前進(jìn)行絕育手術(shù)被認(rèn)為是有效的控制手段[8-9]。

腫瘤大小或體積也是關(guān)于犬乳腺腫瘤預(yù)后中被研究最多的臨床病理特征之一，理論上來(lái)說(shuō)腫瘤越大，組織內(nèi)突變累積相應(yīng)增多，惡性行為的可能就越大[10]。參照經(jīng)典TNM腫瘤分期法，筆者對(duì)手術(shù)切除后的腫瘤組織測(cè)量最大直徑，記錄分為三組：(1)<3 cm組10例；(2)≥3 cm且<5 cm組11例；(3)≥5 cm組9例。發(fā)現(xiàn)三組占比差異不大(33.3%、36.7%和30%)，但直徑在3～5 cm的腫瘤病例惡性占比遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)其他兩組，達(dá)到81.8%，其余兩組良惡性之比相近(50.0%和44.4%)。結(jié)果說(shuō)明在3～5 cm時(shí)腫瘤癌變可能加大，印證了突變積累的理論，但腫瘤繼續(xù)增大時(shí)惡性比例反而下降，分析可能是組織發(fā)生壞死的概率上升而遏制了進(jìn)一步的惡化，需要后續(xù)試驗(yàn)驗(yàn)證。

3.2 犬乳腺腫瘤的病理學(xué)分類

病理學(xué)檢查主要是指對(duì)臨床腫瘤進(jìn)行穿刺、活檢或手術(shù)切除后的瘤體進(jìn)行組織病理學(xué)染色觀察的手段。犬乳腺腫瘤組織病理學(xué)診斷及分級(jí)在臨床上是最重要最常用的診斷方法。

犬乳腺組織主要有實(shí)質(zhì)、基質(zhì)、導(dǎo)管、血管和神經(jīng)這幾個(gè)部分組成[11]。而乳腺腫瘤主要由腺上皮細(xì)胞、肌上皮細(xì)胞或是間質(zhì)成分，某一個(gè)或聯(lián)合的異常增生而引起。根據(jù)瘤細(xì)胞惡性程度，瘤體生長(zhǎng)速度及方式等特征可分為良性腫瘤及惡性腫瘤兩大類，而每一類根據(jù)瘤細(xì)胞來(lái)源的不同又主要可分為腺瘤(癌)、瘤(癌)、間質(zhì)瘤(癌)。

由于犬乳腺組織結(jié)構(gòu)較人類及貓科動(dòng)物更為復(fù)雜，時(shí)常出現(xiàn)一份樣本中多種腫瘤類型同時(shí)存在的現(xiàn)象，因此對(duì)犬乳腺腫瘤進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化的分類研究一直備受關(guān)注，本次研究主要根據(jù)經(jīng)典WHO分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。研究收集30例犬乳腺腫瘤病料，經(jīng)病理組織學(xué)診斷發(fā)現(xiàn)良性腫瘤12例(40.0%)：2例腺瘤、4例纖維腺瘤和6例乳頭狀瘤；惡性腫瘤18例(60.0%)：3例導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀癌、5例混合癌和10例浸潤(rùn)性癌，其中浸潤(rùn)性癌是總發(fā)病率第一(33.3%)的腫瘤類型。

3.2.1 良性犬乳腺腫瘤主要類型及病理學(xué)特點(diǎn)

(1)腺瘤：?jiǎn)渭冃拖倭鍪怯膳帕性趯?dǎo)管表面的細(xì)胞組成的，一般具有良好分界和完整基底膜的非浸潤(rùn)性病變。瘤變區(qū)域的間質(zhì)結(jié)締組織有時(shí)缺乏。導(dǎo)管襯以一層立方柱狀上皮，部分細(xì)胞質(zhì)可能出現(xiàn)嗜酸性特質(zhì)，核質(zhì)不均較為少見(jiàn)。

(2)纖維腺瘤：纖維腺瘤主要由大量廣泛的疏松結(jié)締組織組成，其中包裹著由立方形或柱型上皮細(xì)胞構(gòu)成的小導(dǎo)管。成纖維細(xì)胞具有狹長(zhǎng)的細(xì)胞核，很少的細(xì)胞質(zhì)和不明顯的細(xì)胞邊緣。若為更長(zhǎng)期的腫瘤具有更致密的纖維結(jié)締組織，基質(zhì)透明性增加。

(3)乳頭狀瘤(導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤)：這種腫瘤特征是具有由纖維狀支架支撐的乳頭狀突起，乳突可能單發(fā)或多發(fā)呈多節(jié)點(diǎn)的樹(shù)杈狀。導(dǎo)管常常出現(xiàn)膨大，由一層完整肌上皮細(xì)胞以及一層完整腺上皮細(xì)胞被覆。乳突基質(zhì)主要由纖維組織、膠原等構(gòu)成，核分裂象少見(jiàn)。

3.2.2 惡性犬乳腺腫瘤主要類型及病理學(xué)特點(diǎn)

(1)導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀癌：對(duì)于導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀癌，乳頭被覆有多層(分層)增殖的上皮細(xì)胞群，其具有在導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤中未發(fā)現(xiàn)的惡性特征，例如更高的核質(zhì)比率，異型性增加，可見(jiàn)有絲分裂象。

(2)混合癌：可分為三種類型，第一種由惡性腺上皮和良性肌上皮組成；第二種為腺上皮成分以及肌上皮成分均為惡性；第三種特征在于不僅存在惡性肌上皮和肌上皮成分，間質(zhì)結(jié)構(gòu)也成骨化或軟骨化的良性病變。

(3)浸潤(rùn)性癌：本研究中浸潤(rùn)性癌非常多見(jiàn)，其主要病理組織學(xué)特征為癌細(xì)胞向間質(zhì)內(nèi)廣泛浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，造成正常間質(zhì)組織中混雜各類癌細(xì)胞的情況。最常見(jiàn)的為浸潤(rùn)性乳頭狀癌，其排列成泡狀或管狀的癌細(xì)胞多數(shù)形態(tài)不一，排列散亂，異型性大，且核分裂象多見(jiàn)。

3.3 不同性質(zhì)腫瘤的生存分析

腫瘤患犬手術(shù)后的隨訪是獸醫(yī)臨床最重要的判斷生存情況的因素之一，本次研究共取得18例完整隨訪病例，8例良性腫瘤(44.4%)，10例惡性腫瘤(55.6%)。

18例犬乳腺腫瘤病例，手術(shù)后中位生存期為14個(gè)月，良性組中位生存期15個(gè)月，惡性組偏低為11個(gè)月。由中位生存期和生存曲線可以看出良性腫瘤組比惡性腫瘤組生存時(shí)間長(zhǎng)，但未出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，分析可能是樣本量太少導(dǎo)致。

生存分析(Survival analysis)是指根據(jù)試驗(yàn)或調(diào)查得到的數(shù)據(jù)對(duì)生物或人的生存時(shí)間進(jìn)行分析和推斷，是研究生存時(shí)間和結(jié)局與眾多影響因素間關(guān)系及其程度大小的方法。也可稱為生存率分析或存活率分析，其中臨床隨訪時(shí)間及方法是得到有效數(shù)據(jù)的最重要一步。獸醫(yī)隨訪數(shù)據(jù)的獲取有多種途徑，部分研究是基于手術(shù)后患犬的定期臨床檢查，但大多數(shù)研究是依靠記錄的回顧，對(duì)寵主或獸醫(yī)進(jìn)行問(wèn)卷及電話調(diào)查，在今后臨床工作中，需要臨床獸醫(yī)有意識(shí)引導(dǎo)寵主定期來(lái)院復(fù)查，根據(jù)影像學(xué)檢查才能更好地判斷淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況。

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