煙酸、果寡糖及檸檬酸稀土組合對肉牛瘤胃體外發(fā)酵特性及菌群結(jié)構(gòu)的影響

梁 歡 趙向輝 許蘭嬌 文露華 陳作棟 趙二龍 瞿明仁

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，江西省動物營養(yǎng)重點實驗室，營養(yǎng)飼料開發(fā)研究中心，南昌 330045)

瘤胃是反芻動物區(qū)別于單胃動物最顯著的特征之一，瘤胃發(fā)酵功能及特性的好壞對反芻動物健康與生產(chǎn)影響巨大。因此，如何調(diào)控瘤胃發(fā)酵特性，增強(qiáng)瘤胃發(fā)酵功能，一直是反芻動物營養(yǎng)研究的重中之重。

果寡糖(fructooligosaccharides,FOS)，又稱為低聚果糖、果聚糖，是在蔗糖分子上以β-1，2-糖苷鍵結(jié)合數(shù)個D-果糖所形成的一組低聚糖的總稱，具有調(diào)控瘤胃微生物區(qū)系的作用[1]。瞿明仁等[2]和凌寶明等[3]均通過研究發(fā)現(xiàn)，灌注2.00%果寡糖可以顯著降低綿羊瘤胃液相pH和瘤胃內(nèi)的氨態(tài)氮(NH3-N)含量，顯著提高瘤胃內(nèi)揮發(fā)性脂肪酸(VFA)和微生物蛋白(MCP)含量，有效添加劑量為飼糧的0.8%。

檸檬酸稀土(rare earth citrate,REC)，是一種有待開發(fā)的新型高效飼料添加劑，其中稀土元素對生物體有較強(qiáng)的生理活性，是一種生理激活劑，可以改變動物或微生物對飼料營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，增強(qiáng)機(jī)體蛋白質(zhì)和核酸的合成，從而促進(jìn)動物和微生物生長，檸檬酸稀土的有效添加劑量為飼糧的0.6%[8]。

從上述研究可見，果寡糖、煙酸及檸檬酸稀土對瘤胃的發(fā)酵功能具有調(diào)控作用，而且均是通過促進(jìn)瘤胃微生物生化代謝及生長繁殖來實現(xiàn)瘤胃調(diào)控功能的，但目前研究報道均是使用單一調(diào)控劑來調(diào)控瘤胃發(fā)酵功能，而對這3種調(diào)控劑是否有組合效應(yīng)、是否能增強(qiáng)其調(diào)控效果、適宜的組合如何，尚未見到研究報道。因此，本試驗擬研究這3種調(diào)控劑組合對肉牛瘤胃體外發(fā)酵特性及菌群結(jié)構(gòu)的影響，旨在為開發(fā)效果優(yōu)良的復(fù)合瘤胃調(diào)控劑，并為其在肉牛養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

果寡糖購自河北維爾康制藥有限公司，其純度大于90%。

煙酸購自鄭州嘉禾生物制品有限公司，有效成分含量≥95%。

檸檬酸稀土購自江西筐廬科技有限公司，為白色或淡黃色流動性粉末，其檸檬酸稀土含量≥99%，其中稀土元素(RE，主要是鑭系元素)≥36%，鎘(Cd)≤0.000 1%、鉛(Pb)≤0.002%、砷(As)≤0.000 5%。

1.2 試驗動物、飼糧及飼養(yǎng)管理

選用3只體重為(375±28) kg、安裝有永久性瘤胃瘺管的健康錦江黃牛公牛為瘤胃液供體，口服伊維菌素統(tǒng)一驅(qū)蟲，單圈飼養(yǎng)?；A(chǔ)飼糧為玉米-豆粕-稻草型飼糧，按照《肉牛飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 815—2004)配制，精粗比為20∶80?；A(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。每日分2次(08:00和18:00)等量飼喂，自由飲水。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1)每千克預(yù)混料含有Contained the following per kg of premix：VA 500 000 IU，VD380 000 IU，VE 200 000 IU，F(xiàn)e 10 g，Mn 8 g，Zn 6 g，Se 0.02 g，I 0.1 g，Co 0.02 g。

2)NEm為計算值，計算方法：NEm=DE×Km；Km=0.187 5×(DE/GE)+0.457 9。式中：NEm為維持凈能；DE為飼糧消化能；Km為消化能轉(zhuǎn)化為維持凈能的效率；GE為飼糧總能[9]。其他營養(yǎng)水平為測定值。NEmwas a calculated value, which was calculated as follows: NEm=DE×Km; Km=0.187 5×(DE/GE)+0.457 9. In the formulas, NEmpresented net energy for maintenance, DE presented digestive energy, Km presented the efficient of DE converted into NEm, and GE presented gross energy[9]. The other nutrient levels were measured values.

1.3 體外發(fā)酵方法

試驗前，根據(jù)Menke等[10]的配方配制緩沖液，主要包括微量元素溶液、碳酸緩沖溶液、磷酸緩沖溶液、硫化鈉(Na2S)還原溶液以及刃天青指示劑。將配制好的緩沖液混勻后持續(xù)通入CO2在30 min以上直至溶液pH達(dá)到6.8，置于39 ℃恒溫水浴鍋中備用。

于晨飼前利用長臂手套，通過瘤胃瘺管分別于瘤胃上下前后4個部位采集等量瘤胃液，混合均勻。采集好的瘤胃液迅速灌入經(jīng)預(yù)熱達(dá)39 ℃并通有CO2的滅菌清潔燒杯中，燒杯置于裝有39 ℃蒸餾水的保溫瓶中，灌滿后立即蓋好保溫瓶蓋子，迅速返回試驗室，經(jīng)4層紗布過濾后持續(xù)通入CO25 min，然后迅速分裝至已預(yù)熱好并裝有培養(yǎng)底物(基礎(chǔ)飼糧500 mg+對應(yīng)的調(diào)控劑組合)和緩沖液(40 mL)的培養(yǎng)瓶內(nèi)，每個培養(yǎng)瓶加20 mL瘤胃液。接通培養(yǎng)瓶和注射器，打開振蕩開關(guān)，培養(yǎng)48 h。體外批次培養(yǎng)裝置參照盧德勛[11]和程茂基[12]所述的方法設(shè)計。該裝置主體為恒溫水浴搖床，其水浴溫度和振蕩速率可調(diào)。培養(yǎng)瓶為瓶口安裝有橡皮塞的150 mL酸奶瓶，酸奶瓶通過1根帶針頭的橡膠管上與注射器連接。

1.4 試驗設(shè)計

試驗采用3因素3水平[L9(33)]正交試驗設(shè)計，共設(shè)9個調(diào)控劑組合，每個調(diào)控劑組合設(shè)3個培養(yǎng)瓶。各調(diào)控劑在基礎(chǔ)飼糧中的添加水平見表2。

表2 L9(33)正交試驗設(shè)計

1.5 樣品的預(yù)處理

培養(yǎng)48 h后，取培養(yǎng)液立即測定pH，將培養(yǎng)瓶中濾渣無損地轉(zhuǎn)移入經(jīng)烘干稱重的尼龍袋(孔徑200目)中，采集濾液樣品，部分濾液-20 ℃冷凍保存，用于瘤胃發(fā)酵參數(shù)(NH3-N、VFA和MCP含量)的測定，部分濾液裝在離心管中，-80 ℃冷凍保存，用于高通量測序。

1.6 測定指標(biāo)與測定方法

飼糧中粗蛋白質(zhì)(CP)、中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)、鈣(Ca)和磷(P)含量的測定參照《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測技術(shù)》[13]進(jìn)行。

培養(yǎng)液pH采PHS-25型實驗室pH計(上海今邁儀器儀表有限公司)進(jìn)行測定；NH3-N含量采用苯酚-次氯酸鈉比色法[14]進(jìn)行測定；VFA含量采用Waters-Baseline 520液相色譜儀進(jìn)行測定，分析條件為波長214 nm，C18柱溫維持在30 ℃，流動相0.02 mol/L KH2PO4/H3PO4，pH 2.37，流速1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL[15]；MCP含量利用紫外分光光度計采用比色法[16]進(jìn)行測定。

1.7 高通量測序及生物信息學(xué)分析

通過分析前期試驗數(shù)據(jù)，從9個組中篩選出結(jié)果差異最大的2個組(A和I組)進(jìn)行高通量測序分析。取5 mL瘤胃體外發(fā)酵培養(yǎng)液樣品送上海祥音生物公司進(jìn)行DNA提取，并對質(zhì)量合格樣品的細(xì)菌16S rDNA V4～V5區(qū)(515F～907R)進(jìn)行測序，測序采用Illumina MiSeq PE250測序平臺。

對測得的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，舍棄低質(zhì)量序列(read尾部堿基質(zhì)量<20，質(zhì)控后的read<50 bp)，獲得的高質(zhì)量序列用Usearch 7.1軟件進(jìn)行聚類，以16S rDNA序列97%的相似度作為分類操作單元(operational taxonomic unit,OTU)的劃分標(biāo)準(zhǔn)。獲得的OTU與RDP數(shù)據(jù)庫比對，通過RDP Classifier鑒定OTU代表性序列的微生物分類地位。豐富度指數(shù)(Chao指數(shù)、Ace指數(shù))和多樣性指數(shù)(Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù))的計算利用Mothur 1.30.1軟件完成。采用Metastats分析方法比較分析各組之間的差異菌群。

1.8 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2003初步整理后，利用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，當(dāng)差異顯著時，采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P≤0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外培養(yǎng)液pH、NH3-N和MCP含量分析

由表3可知，不同調(diào)控劑組合對體外培養(yǎng)液pH和NH3-N含量具有顯著影響(P≤0.05)，G組體外培養(yǎng)液的pH最高，為6.77，顯著高于A、B、C、D、E組(P≤0.05)，A組體外培養(yǎng)液的pH最低，為6.66，顯著低于E、F、G、H、I組(P≤0.05)；C組體外培養(yǎng)液中NH3-N含量最高，為12.04 mg/dL，顯著高于G、H組(P≤0.05)，G組體外培養(yǎng)液中NH3-N含量最低，為9.77 mg/dL，顯著低于其余各組(P≤0.05)；各組體外培養(yǎng)液中MCP含量差異不顯著(P>0.05)，其中I組培養(yǎng)液中MCP含量最高，為37.55%，B、C組體外培養(yǎng)液中MCP含量均最低，為34.97%。

表3 不同調(diào)控劑組合對體外培養(yǎng)液pH、NH3-N和MCP的影響

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P≤0.05)。下表同。

In the same column, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P≤0.05). The same as below.

2.2 體外培養(yǎng)液VFA含量分析

由表4可知，體外培養(yǎng)液中總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)濃度、乙酸和丁酸含量各組之間無顯著差異(P>0.05)，其中A組體外培養(yǎng)液的TVFA濃度和乙酸含量均為最高，C組體外培養(yǎng)液的丁酸含量最高；不同調(diào)控劑組合對體外培養(yǎng)液中丙酸含量和乙酸/丙酸值具有顯著影響(P≤0.05)，其中I組培養(yǎng)液中丙酸含量最高，為28.53%，顯著高于A、B、D、E組(P≤0.05)，I組體外培養(yǎng)液的乙酸/丙酸值最低，顯著低于A、B、D組(P≤0.05)。

2.3 OTU聚類分析

本試驗選取A和I組2個調(diào)控劑組合，共6個瘤胃體外培養(yǎng)液樣品(A1、A2、A3、I1、I2、I3)進(jìn)行高通量測序，共獲得426 895條序列，平均每個樣品71 149條。序列在97%的相似度下共獲得12 531個物種分類的OTU，平均每個樣品2 089個OTU。A1、A2、A3的OTU數(shù)分別為2 012、1 522和2 050個；I1、I2、I3的OTU數(shù)分別為2 482、1 662和2 803個。

由圖1-A可知，來自同一組的樣品聚類在一起，主成分分析(PCA)獲得主成分1(PC1)的貢獻(xiàn)率為77%，主成分2(PC2)的貢獻(xiàn)率為16%；門水平分類上的豐度熱圖(圖1-B)顯示體外培養(yǎng)液中主要菌群來自擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicultes)、變形菌門(Proteobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、浮霉菌門(Planctomycetes)、螺旋體門(Spirochaetes)。

表4 不同調(diào)控劑組合對體外培養(yǎng)液VFA含量的影響

圖1 體外培養(yǎng)液菌群OTU主成分分析圖(A)及其門水平分類熱圖(B)

2.4 菌群α多樣性分析

α多樣性反映了單個樣品內(nèi)部物種的多樣性，其中Chao指數(shù)和Ace指數(shù)反映樣品中菌群的豐富度，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)反映樣品中菌群的多樣性。由表5可知，與A組相比，I組體外培養(yǎng)液的Chao指數(shù)、Ace指數(shù)和Shannon指數(shù)均較高，而Simpson指數(shù)較低，因此I組體外培養(yǎng)液具有更高的菌群多樣性。

2.5 菌群結(jié)構(gòu)分析

A和I組體外培養(yǎng)液的差異菌群統(tǒng)計結(jié)果見表6。在門水平上，2組之間存在4個差異顯著的菌群(P≤0.05)，分別是Spirochaetes、黏膠球形菌門(Lentisphaerae)、互養(yǎng)菌門(Synergistetes)和軟壁菌門(Tenericutes)。在屬水平上，2組之間存在15個差異顯著的菌群(P≤0.05)，分別是普氏菌屬(Prevotella)、Paraprevotella、未分類的亞門5(subdivision 5_genera_incertae_sedis)、施氏菌屬(Schwartzia)、假丁酸弧菌屬(Pseudobutyrivibrio)、密螺旋體菌屬(Treponema)、梭菌屬14a(ClostridiumⅩⅣa)、Victivallis、未分類的亞門3(subdivision 3_genera_incertae_sedis)、依賴桿菌屬(Fretibacterium)、寡糖菌屬(Oligosphaera)、梭菌屬14b(ClostridiumⅩⅣb)、月單胞菌屬(Selenomonas)、Hydrogenibacillus、嗜熱菌屬(Defluviitalea)。

表5 體外培養(yǎng)液菌群α多樣性分析

表6 體外培養(yǎng)液差異菌群分析

3 討 論

3.1 煙酸、果寡糖及檸檬酸稀土組合對肉牛瘤胃體外培養(yǎng)液pH、NH3-N和MCP含量的影響

瘤胃液的pH是衡量瘤胃發(fā)酵的綜合指標(biāo)，適宜的瘤胃液pH是瘤胃微生物正常活動所必需的，瘤胃液pH的正常變化范圍為5.5～7.5，本次試驗中各組體外培養(yǎng)液pH均在正常瘤胃pH范圍內(nèi)。在正常情況下，飼糧添加寡糖會降低瘤胃液pH，而本次試驗中，體外培養(yǎng)液的pH隨著果寡糖添加水平的增加而顯著提高，但仍在正常范圍之內(nèi)，這與Vidová等[17]的研究結(jié)果不一致，原因可能與煙酸的添加有關(guān)，煙酸可顯著降低瘤胃內(nèi)乳酸含量，提高瘤胃液pH，表明果寡糖和煙酸之間存在交互作用。

NH3-N是瘤胃內(nèi)肽、氨基酸、蛋白質(zhì)和尿素等其他非蛋白氮化合物共同分解的終產(chǎn)物，也是瘤胃微生物合成MCP的主要原料。瘤胃內(nèi)最佳NH3-N含量為0.35～29.00 mg/dL[18]，本試驗各組體外培養(yǎng)液中NH3-N含量介于9.77～12.04 mg/dL，在正常范圍內(nèi)。本試驗中，體外培養(yǎng)液NH3-N含量隨果寡糖添加水平的增加而顯著降低，這與瞿明仁等[2]的研究結(jié)果一致，通過比較本次試驗與瞿明仁等[2]的試驗結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，本次試驗的整體NH3-N含量更低，說明瘤胃微生物對NH3-N的利用效果更好，原因可能是添加煙酸和檸檬酸稀土均可以促進(jìn)能量代謝，為瘤胃微生物利用NH3-N合成MCP提供能量，表明這3種瘤胃調(diào)控劑之間存在正組合效應(yīng)。此外，本試驗還發(fā)現(xiàn)，添加0.8%的檸檬酸稀土?xí)@著降低體外培養(yǎng)液NH3-N含量，這與Liu等[19]的研究結(jié)果相一致，原因可能是適量的稀土元素會促進(jìn)瘤胃微生物對NH3-N的利用。

MCP是反芻動物最主要的氮源，可滿足反芻動物氮需要量的40%～80%，本次試驗中各組體外培養(yǎng)液中MCP含量差異不顯著，但以I組體外培養(yǎng)液的MCP含量最高，為37.55%，且MCP含量的整體水平隨果寡糖添加水平的增加而提高，導(dǎo)致各組之間差異不顯著的原因可能與3種瘤胃調(diào)控劑之間的交互作用有關(guān)。

3.2 煙酸、果寡糖及檸檬酸稀土組合對肉牛瘤胃體外培養(yǎng)液VFA含量的影響

丙酸是反芻動物體內(nèi)糖異生的主要前體物質(zhì)，且丙酸發(fā)酵時可以利用氫氣，使甲烷產(chǎn)量減少，能量轉(zhuǎn)化效率提高[20]。乙酸/丙酸值反映瘤胃發(fā)酵類型，其值越小，丙酸比例越高，飼料能量利用率也相應(yīng)越高。本試驗中，不同調(diào)控劑組合對體外培養(yǎng)液中丙酸含量和乙酸/丙酸值存在顯著影響，說明添加不同調(diào)控劑組合顯著影響了瘤胃發(fā)酵類型，其中I組體外培養(yǎng)液中丙酸含量最高，乙酸/丙酸值最低，原因可能與I組瘤胃調(diào)控劑組合的比例有關(guān)，I組中果寡糖和煙酸的添加水平均為本次試驗設(shè)計的最高值，檸檬酸稀土添加水平為0.8%。張學(xué)峰等[21]通過體外試驗研究發(fā)現(xiàn)，在綿羊飼糧中添加寡糖能降低發(fā)酵產(chǎn)物中乙酸/丙酸值，Schaetzel等[22]研究發(fā)現(xiàn)添加煙酸對瘤胃微生物的生長有影響，可顯著降低瘤胃中乙酸/丙酸值，Liu等[19]研究發(fā)現(xiàn)，添加適量的稀土添加劑[氯化鑭(LaCl3)]后，肉牛瘤胃中丙酸含量顯著高于對照組，乙酸/丙酸值顯著低于對照組，這些結(jié)果均與本試驗結(jié)果相一致。通過比較本試驗與張學(xué)峰等[21]的試驗結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，在同等試驗條件下，本次試驗整體丙酸含量更高，乙酸/丙酸值更低，說明3種瘤胃調(diào)控劑組合之間存在正組合效應(yīng)，其中煙酸發(fā)揮了更顯著的作用，有效地促進(jìn)了丙酸發(fā)酵。本次試驗中各組體外培養(yǎng)液中乙酸和丁酸含量差異不顯著，原因可能是在添加的3種瘤胃調(diào)控劑中，煙酸對碳水化合物的發(fā)酵具有更顯著影響，煙酸可提高丙酸含量，降低乙酸和丁酸含量[23]，削弱果寡糖提高瘤胃內(nèi)乙酸和丁酸含量的作用，造成各組乙酸和丁酸含量差異不顯著。

3.3 煙酸、果寡糖及檸檬酸稀土組合對肉牛瘤胃體外培養(yǎng)液菌群多樣性的影響

本試驗利用Illumina Miseq測序平臺，采用16S rDNA高通量測序技術(shù)比較研究了不同調(diào)控劑組合對肉牛瘤胃體外培養(yǎng)液菌群多樣性的影響，結(jié)果表明，與A組相比，I組菌群的豐富度和多樣性相對較高，通過分析A和I組的瘤胃調(diào)控劑組合可以發(fā)現(xiàn)，I組中果寡糖和煙酸添加水平均為本次試驗設(shè)計的最高值，分別為1.2%和1 200 mg/kg，而A組均為最低值，這說明在低精料飼糧中適量增加寡糖和煙酸可以促進(jìn)瘤胃微生物的生長，提高瘤胃中菌群的多樣性，這一結(jié)果與閔力等[24]、潘龍等[25]和Ottou等[26]的研究結(jié)果相一致。高雨飛等[27]研究了在高精料飼糧中添加煙酸對瘤胃菌群多樣性的影響，結(jié)果表明添加煙酸降低了瘤胃菌群多樣性，這一結(jié)果與本試驗結(jié)果不一致，原因可能與添加檸檬酸稀土有關(guān)，檸檬酸稀土是一種生理激活劑，可促進(jìn)微生物生長，提高瘤胃菌群多樣性。

3.4 煙酸、果寡糖及檸檬酸稀土組合對肉牛瘤胃體外培養(yǎng)液菌群結(jié)構(gòu)的影響

本次試驗結(jié)果表明，在不同調(diào)控劑組合處理下，錦江黃牛瘤胃體外培養(yǎng)液中優(yōu)勢菌群均為Bacteroidetes和Firmicultes，這與其他反芻動物的研究結(jié)果[28-29]相一致。黃色瘤胃球菌(Ruminococcusflavefaciens)、白色瘤胃球菌(Ruminococcusalbus)和琥珀酸絲狀桿菌(Fibrobactersuccinogenes)是瘤胃中主要的纖維分解菌[30]。但也有研究報道，有些非纖維降解菌能與纖維降解菌發(fā)生協(xié)同作用，提高瘤胃中纖維素的降解率[31]，如棲瘤胃普雷氏菌(Prevotellaruminicola)[32]、Treponema[33]等，本試驗中，與A組相比，I組體外培養(yǎng)液中Prevotella和Treponema的豐度顯著提高了，這2種菌屬可能與纖維降解菌發(fā)生了協(xié)同作用，促進(jìn)纖維分解菌的活性。產(chǎn)琥珀酸菌(Succiniclasticumruminis)[34]和Schwartzia[35]可以將瘤胃中的琥珀酸鹽轉(zhuǎn)化為丙酸，為反芻動物提供葡萄糖合成的前提物質(zhì)。反芻獸月形單胞菌(Selenomonasruminantium)也是非纖維降解菌，它可以協(xié)同F(xiàn)ibrobactersuccinogenes和Ruminococcusflavefaciens進(jìn)行纖維素的降解，并提高瘤胃中丙酸的產(chǎn)生量[36]。本試驗中，與A組相比，I組體外培養(yǎng)液中Schwartzia和Selenomonas的豐度顯著提高，由上述可知，這2種菌群均可促進(jìn)瘤胃中丙酸的產(chǎn)生，這與本試驗中瘤胃發(fā)酵參數(shù)的結(jié)果相一致，即I組體外培養(yǎng)液VFA中丙酸的比例最高。

4 結(jié) 論

① 不同煙酸、果寡糖及檸檬酸稀土組合可以顯著改變?nèi)馀Ａ鑫赴l(fā)酵模式，提高體外培養(yǎng)液中丙酸含量。

② 不同煙酸、果寡糖及檸檬酸稀土組合顯著影響了肉牛瘤胃菌群中Prevotella、Schwartzia、Treponema和Selenomonas等的豐度。

③ 肉牛玉米-豆粕-稻草型飼糧條件下，較優(yōu)的調(diào)控劑組合為1.2%果寡糖+1 200 mg/kg煙酸+0.8%檸檬酸稀土和1.2%果寡糖+400 mg/kg煙酸+1.0%檸檬酸稀土。

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