體外法研究pH與脂多糖或組胺的交互作用對奶山羊瘤胃上皮細胞緊密連接蛋白mRNA表達量的影響

孫燕勇 高 民 徐 明 宋利文 李 洋 李 超 陳利青 胡紅蓮

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院動物營養(yǎng)與飼料研究所，呼和浩特 010031)

反芻動物瘤胃上皮為多層鱗片狀(stratified squamous epithelium，SSE)，從黏膜層到漿膜層依次為角質(zhì)層(stratum corneum，SC)、顆粒層(stratum granulosum，SG)、棘突層(stratum spinosum，SS)和基底層(stratum basale，SB)[1]，顆粒層細胞間存在緊密連接(tight junction，TJ)，緊密連接是維持黏膜屏障的重要結(jié)構(gòu)[2]。瘤胃上皮不僅為瘤胃微生物附著、生長提供有利環(huán)境，也是動物機體營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收、轉(zhuǎn)運代謝的主要場所。在集約化養(yǎng)殖的今天，反芻動物極易發(fā)生亞急性瘤胃酸中毒(SARA)，發(fā)病后瘤胃滲透壓升高、瘤胃內(nèi)產(chǎn)生大量的有害物質(zhì)或不穩(wěn)定環(huán)境因素[脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)[1]、組胺(histamine，HIS)[2]、高pH[3]等]，這些有害物質(zhì)被血液吸收，損傷緊密連接結(jié)構(gòu)，直接導(dǎo)致上皮屏障功能被破壞，從而干擾了瘤胃上皮對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，及對毒害物質(zhì)的抵御功能[4]?？梢?，緊密連接結(jié)構(gòu)的完整是保證瘤胃健康的前提。以往對緊密連接的研究多集中在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。有報道顯示人為的燒傷小鼠后，燒傷部位上皮的緊密連接功能失調(diào)，細胞間緊密連接受損，形成細胞間隙，破壞上皮通透性[2]。也有研究報道稱，腸道上皮細胞緊密連接蛋白zonula occludens-1(ZO-1)、Occludin、Claudin等能與骨架肌動蛋白相互作用，可能在腸上皮屏障功能損害的發(fā)生中起到重要作用[5]。從20世紀50年代初Ussing等[6]提出將尤斯灌流儀器(Ussing chamber)運用到上皮組織離子轉(zhuǎn)運開始，相繼有學(xué)者將該技術(shù)拓展到反芻動物瘤胃上皮通透性的研究中[7]。瘤胃上皮通透性的改變可準確反映瘤胃上皮的損傷程度，其通透性增加表明上皮完整性被破壞，屏障功能受損。Klenvenhusen等[8]采用Ussing chamber系統(tǒng)研究得出高精粗比飼糧下山羊瘤胃上皮的通透性顯著增加。隨后，楊淑青[11]通過遞增飼糧非纖維性碳水化合物/中性洗滌纖維(NFC/NDF)誘導(dǎo)奶山羊發(fā)生SARA，結(jié)果測得瘤胃上皮緊密連接蛋白Claudin-1、ZO-1和Occludin mRNA表達量顯著降低；同時該研究還采用Ussing chamber測定瘤胃上皮的通透性，發(fā)現(xiàn)SARA顯著升高了瘤胃上皮的短路電流(short-circuit current，Isc)、組織導(dǎo)電性(tissue conductance，Gt)，表明瘤胃上皮通透性增加。程萌[12]在此基礎(chǔ)上，增大了NFC/NDF范圍進一步誘導(dǎo)SARA，結(jié)果SARA組瘤胃上皮緊密連接蛋白Claudin-4 mRNA表達量顯著升高。間隙連接(gap junction，GJ)蛋白Connexin-43、橋粒芯蛋白Desmoglein-1 mRNA表達量顯著降低，同時，該團隊不僅測得SARA顯著降低瘤胃內(nèi)pH，還增加了瘤胃內(nèi)和血漿中的異常代謝產(chǎn)物(LPS、HIS等)含量。以上研究表明，反芻動物發(fā)生SARA后，瘤胃內(nèi)環(huán)境紊亂，進一步降低了瘤胃內(nèi)pH，同時，LPS、HIS都表現(xiàn)出顯著增加[9-10]，瘤胃上皮細胞緊密連接蛋白mRNA的表達量改變，使瘤胃上皮細胞間隙向著增大的方向改變，破壞了瘤胃上皮的完整性增加通透性。而這些異常代謝產(chǎn)物究竟是如何影響瘤胃上皮通透性的，是單因素pH，抑或是多因素pH與LPS或HIS共同作用的結(jié)果，有待深入研究。為此，本試驗采用Ussing chamber在體外研究pH與LPS或HIS對奶山羊瘤胃上皮緊密連接蛋白mRNA表達量的交互影響，從分子層面揭示pH與LPS或HIS對影響奶山羊瘤胃上皮通透性的機制。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與飼養(yǎng)管理

選用8只體況良好、體重(43.58±2.77) kg、泌乳量相近的經(jīng)產(chǎn)薩能奶山羊為試驗動物，飼養(yǎng)在內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院動物試驗基地。試驗動物采取單籠飼養(yǎng)，每天06：00和18：00等量飼喂。自由飲水，試驗期30 d。

1.2 基礎(chǔ)飼糧

基礎(chǔ)飼糧參照NRC(2007)[11]，并結(jié)合國內(nèi)《奶山羊飼養(yǎng)標準》[12]配制，為以玉米、豆粕、麥麩、苜蓿、青干草為主要原料設(shè)計的NFC/NDF為1.40的飼糧?；A(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.3 試驗設(shè)計

本試驗采用3×3雙因素試驗設(shè)計。向Ussing chamber(6通道)黏膜側(cè)添加配制好的不同處理的緩沖液。試驗1：因子1為pH，設(shè)7.4(對照)、5.5、5.2 3個水平，因子2為LPS濃度，分別為0、30、60 kEU/mL；試驗2：因子1為pH，設(shè)7.4(對照)、5.5、5.2 3個水平，因子2為HIS濃度，分別為0、0.5、10.0 ng/mL。試驗共15個組(2項試驗pH為7.4、未添加LPS或HIS的組共用)，每組3個重復(fù)，每屠宰1只羊得到的瘤胃上皮用于2組試驗。Ussing chamber培養(yǎng)時長為80 min(前20 min為平衡期)。pH及HIS和LPS濃度的設(shè)置是根據(jù)本課題組前期研究結(jié)果與國內(nèi)外相關(guān)研究結(jié)論[3,12,13-14]。

1.4 主要儀器與試劑

主要儀器：Ussing chamber系統(tǒng)(EM-CSYS-4，PI公司，美國)、電泳儀(BG-Power600，北京百晶生物技術(shù)有限公司)、高速冷凍離心機(1730R，耐士科技有限公司)、PCR儀[毅新興業(yè)(北京)科技有限公司]、實時定量PCR儀(Illuminer公司,美國)、凝膠成像儀(Snap Gene公司，美國)、漩渦振蕩器(ST-T256，其林貝爾儀器制造有限公司)、酶標儀(Bio Tek公司，美國)、掌上離心機(CX-200，國華電器有限公司)、酶標儀(MultiSkan 3，Thermo公司,美國)、低溫冷凍離心機(Fresco，Thermo公司,美國)、電泳槽(Mini P-4，北京凱元信瑞儀器有限公司)、電泳儀(Bio-Rad公司,美國)、電動組織勻漿器(Fluka公司，德國)、濕轉(zhuǎn)電泳槽(北京凱元信瑞儀器有限公司)。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1)每千克預(yù)混料含有One kilogram of premix contained the following：MnSO4·5H2O 1 560 mg，F(xiàn)eSO4·7H2O 6 240 mg，ZnSO4·7H2O 3 500 mg，KI 17 mg，NaSeO3130 mg，CoCl2·6H2O 206 mg，CuSO4·5H2O 300 mg，VA 1 620 000 IU，VD3324 000 IU，VE 540 IU，VB120.9 mg，VB5450 mg，VK3150 mg，葉酸folic acid 15 mg，泛酸鈣calcium pantothenate 750 mg。

2)粗蛋白質(zhì)、中性洗滌纖維、鈣、磷為實測值，其余為計算值。非纖維性碳水化合物(%)=1-中性洗滌纖維-粗蛋白質(zhì)-粗脂肪-粗灰分。CP，NDF，Ca and P were measured values, while the others were calculated values. NFC(%)=1-NDF-CP-EE-Ash。

主要試劑：Ussing chamber系統(tǒng)緩沖液、3 mol/L KCl溶液、瓊脂、KH2PO4-NaHPO4緩沖液、H2O2溶液、3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺溶液(TMB)、LPS、HIS、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸。

1.5 試驗方法

1.5.1 瘤胃上皮采集與處理

首先安裝好Ussing chamber半室和夾片，按順序分別安裝電壓電極和電流電極。之后在Ussing chamber系統(tǒng)每個半室中加入5 mL預(yù)熱的緩沖液，通入95% O2和5% CO2混合氣體，點開軟件運行系統(tǒng)，平衡大約10 min并且待電腦顯示曲線穩(wěn)定后，進行試驗動物屠宰，打開腹腔立即采集新鮮的瘤胃腹囊上皮組織2 cm×3 cm，用預(yù)熱好的緩沖液反復(fù)沖洗干凈，將瘤胃上皮樣品迅速剝離肌層后剪成1 cm×1 cm，將固定環(huán)夾片取下后固定樣品(黏膜側(cè)朝左)，插入到Ussing chamber半室中央。分別在漿膜側(cè)半室加入5 mL緩沖液，黏膜側(cè)加入配制好的不同組的培養(yǎng)液5 mL，每組3個重復(fù)。瘤胃上皮經(jīng)過80 min的培養(yǎng)后，使用消毒的鑷子夾入無菌無酶的凍存管中，立刻放于液氮中，隨后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱凍存待測瘤胃上皮緊密連接蛋白Claudin-1、Claudin-4、Claudin-7、Occludin、ZO-1 mRNA表達量。

1.5.2 緩沖液及不同培養(yǎng)液的配制

Ussing chamber緩沖液的配制參照Klenvenhusen等[10]和程萌[12]，具體成分及濃度如下：NaCl 80.00 mmol/L，KCl 5.00 mmol/L，NaH2PO4·H2O 0.40 mmol/L，Na2HPO4·2H2O 2.40 mmol/L，C3H5NaO210.00 mmol/L，C2H3NaO2·3H2O 25.00 mmol/L，C4H7NaO25.00 mmol/L，MgCl2·6H2O 1.20 mmol/L，CaCl2·2H2O 1.20 mmol/L，NaHCO325.00 mmol/L。將配制好的緩沖液置于4 ℃保存。

調(diào)整培養(yǎng)液pH所用試劑添加量見表2。按表中添加量在緩沖液中添加，配制不同pH的緩沖液。按照試驗設(shè)計的添加量添加LPS或HIS。

1.5.3 電極的制備

Ussing chamber電極套管結(jié)構(gòu)如圖1所示。先稱取2 g瓊脂放于50 mL離心管內(nèi)，加入3 mol/L KCl溶液50 mL，放入100 ℃水浴鍋中靜止加熱直至離心管中液體成透明黏稠狀，無氣泡后取出。用5 mL注射器吸取適量KCl-瓊脂溶液，向電極套管尖部注射0.5～1.0 cm的KCl-瓊脂。選出電極套管中KCl-瓊脂部分無氣泡并且長度適宜的備用，并將制作好的電極套管存放于3 mol/L KCl溶液中。

表2 調(diào)整培養(yǎng)液pH所用試劑添加量

圖1 尤斯灌流儀器電極套管結(jié)構(gòu)

1.6 瘤胃上皮細胞緊密連接基因mRNA表達量測定

1.6.1 提取總RNA及反轉(zhuǎn)錄

取凍存的奶山羊瘤胃上皮組織50～100 mg放入已裝滿液氮的研缽中研磨成粉末，將粉末移至1.5 mL離心管中。參照RNAprep Pure Tissue Kit說明書提取總RNA，并用酶標儀測總RNA濃度，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA樣品質(zhì)量。將總RNA參照TIANScript RT Kit說明書進行反轉(zhuǎn)錄。最后把反轉(zhuǎn)錄所得cDNA產(chǎn)物放入冰箱-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 PCR引物設(shè)計及合成

根據(jù)GenBank中相應(yīng)的cDNA序列，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計實時定量PCR(RT-PCR)擴增特異性引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物參數(shù)見表3。

1.6.3 實時定量PCR

本試驗用SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)(天根生化科技公司)進行實時定量PCR擴增。PCR反應(yīng)體系(20 μL)如下：2×SuperReal PreMix Plus 10.00 μL，正向引物(10 μmol/L)0.60 μL，反向引物(10 μmol/L)0.60 μL，cDNA模板2.00 μL，RNase-free ddH2O 6.80 μL。

經(jīng)反復(fù)試驗優(yōu)化后得到的反應(yīng)程序如下:1)預(yù)變性，95 ℃30 s。2)PCR反應(yīng)，95 ℃10 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，40個循環(huán)。3)熔解曲線分析，95 ℃15 s，60 ℃15 s，95 ℃15 s。在擴增完成后分析各個基因的熔解曲線，來確保RT-PCR產(chǎn)物的專一性，操作重復(fù)3次。最后，將β肌動蛋白(β-actin)設(shè)為內(nèi)參使用2-△△Ct法計算基因mRNA的表達量。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用SAS 8.0對所有數(shù)據(jù)進行分析，采用MIXED程序進行雙因素方差分析，差異顯著的采用Duncan氏法進行多重比較，混合模型包括主效應(yīng)LPS、HIS、pH，pH與LPS的交互作用，pH與HIS的交互作用。P<0.05為差異顯著判斷標準，P>0.05為差異不顯著判斷標準。

2 結(jié) 果

2.1 總RNA質(zhì)量

將提取完畢的瘤胃上皮總RNA經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖2所示，18S和28S條帶清晰，經(jīng)酶標儀檢測260 nm吸光度值/280 nm吸光度值(OD260 nm/OD280 nm)在1.8～2.2，沒有蛋白質(zhì)和DNA的污染，總RNA質(zhì)量完好。

表3 RT-PCR引物參數(shù)

F：正向引物forward primer；R：反向引物reverse primer。

圖2 奶山羊瘤胃上皮總RNA電泳圖

2.2 緊密連接蛋白基因的PCR擴增和克隆測序

β-actin、Claudin-1、Claudin-4、Claudin-7、Occludin與ZO-1的PCR擴增產(chǎn)物分別在158、186、132和89 bp處呈現(xiàn)1條特異性條帶，對其進行純化、克隆和菌液PCR鑒定后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，將測序所得序列同GenBank中登錄號為NM_001009784、XM_005697785.1、HM_117762.1、XM_013972136.1、XM_004016906.1和XM_004018080.1的基因進行對比，同源性為100%。

2.3 pH和LPS對瘤胃上皮緊密連接蛋白基因mRNA表達量的影響

如表4所示，以LPS為主效應(yīng)時，60 kEU/mL LPS組Claudin-7 mRNA表達量顯著高于30 kEU/mL LPS組(P<0.05)，這2組均顯著低于0 kEU/mL LPS組(P<0.05)；60 kEU/mL LPS組ZO-1 mRNA表達量與0、30 kEU/mL LPS組相比顯著升高(P<0.05)；60 kEU/mL LPS組Occludin mRNA表達量與0、30 kEU/mL LPS組相比，顯著降低(P<0.05)。

以pH為主效應(yīng)時，pH 5.2組Claudin-1、Claudin-7與ZO-1 mRNA表達量顯著高于pH 7.4組(P<0.05)。與pH 7.4組相比，pH 5.5組Claudin-7 mRNA表達量顯著升高(P<0.05)。

pH與LPS的交互作用對Claudin-1、Claudin-7、ZO-1 mRNA表達量影響顯著(P<0.05)。多重比較發(fā)現(xiàn)：與pH 7.4×0 kEU/mL LPS組相比，降低pH或添加LPS均顯著降低了Claudin-1、Claudin-7 mRNA表達量(P<0.05)。ZO-1 mRNA表達量變化趨勢不規(guī)律，在pH5.2×60 kEU/mL LPS組最高，顯著高于pH 7.4×0 kEU/mL LPS組(P<0.05)。

2.4 pH和HIS對瘤胃上皮緊密連接蛋白mRNA表達量的影響

如表5所示，以HIS為主效應(yīng)時，0.5 ng/mL HIS組Claudin-1、Claudin-7 mRNA表達量顯著低于0、10.0 ng/mL HIS組(P<0.05)；10.0 ng/mL HIS組ZO-1 mRNA表達量顯著高于0、0.5 ng/mL HIS組(P<0.05)，0.5 ng/mL HIS組顯著高于0 ng/mL HIS組(P<0.05)。

以pH為主效應(yīng)時，與pH 7.4組相比，pH 5.2組和pH 5.5組Claudin-1 mRNA表達量均顯著降低(P<0.05)，pH 5.2組最低(P<0.05)；pH 5.2組和pH 5.5組Claudin-7 mRNA表達量顯著升高(P<0.05)，pH 5.5組最高；pH 5.5組ZO-1 mRNA表達量顯著低于pH 5.2組和pH 7.4組(P<0.05)，pH 5.2組顯著高于pH 5.5組和pH 7.4組(P<0.05)。

表4 pH和LPS對奶山羊瘤胃上皮緊密連接蛋白mRNA表達量的影響

同一項目、同列數(shù)據(jù)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

In the same column, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

pH與HIS的交互作用對Claudin-1、Claudin-7與ZO-1 mRNA表達量有顯著影響(P<0.05)。多重比較發(fā)現(xiàn)：與pH 7.4×0 ng/mL HIS組相比，降低pH或添加HIS均顯著降低了Claudin-1 mRNA表達量(P<0.05)，以pH 7.4×10.0 ng/mL HIS組最低。pH 5.5×10.0 ng/mL HIS組Claudin-7 mRNA表達量最低，顯著低于pH 7.4×0 ng/mL HIS組(P<0.05)。與pH 7.4×0 ng/mL HIS組相比，降低pH或添加HIS整體上提高了ZO-1 mRNA表達量，以pH 5.2×10.0 ng/mL HIS組最高，顯著高于其他各組(P<0.05)。

3 討 論

3.1 pH對瘤胃上皮緊密連接蛋白mRNA表達量的影響

瘤胃上皮的細胞連接主要分為緊密連接、橋粒連接(desmosome junction，DJ)、黏著連接(adhesion junction，AJ)和間隙連接，而緊密連接是細胞間最重要的連接方式。瘤胃中的緊密連接位于顆粒層細胞之間，是維持瘤胃黏膜屏障的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，是決定細胞間通透性大小的主要因素。緊密連接作為動態(tài)的通透性屏障，具有雙重功能，不僅能夠阻止?jié)撛诘挠泻ξ镔|(zhì)或病原體入侵瘤胃上皮，維持瘤胃上皮的完整性，還可以允許營養(yǎng)物質(zhì)、離子和水的出入，保證了瘤胃上皮的通透性。緊密連接這種特殊的生理功能在胃腸道黏膜屏障的維護中起著舉足輕重的作用。但病理狀態(tài)下，緊密連接若被破壞，細胞間隙就會增大，細菌與毒素等大分子物質(zhì)便趁機移位，黏膜的選擇性屏障作用喪失。當緊密連接發(fā)生變異、減少或缺失時，緊密連接再分配和基因表達就會下調(diào)，使上皮細胞受損、萎縮，屏障功能下降，細胞間緊密連接被破壞，進而使上皮細胞通透性增加[15]。但是從分子水平研究影響瘤胃上皮屏障功能的相關(guān)機制的報道甚少，有學(xué)者提出瘤胃上皮中存在的緊密連接膜內(nèi)蛋白有Claudin-1、Claudin-4、Claudin-7和Occludin，GJ蛋白有Connexin-43及橋粒芯蛋白Desmoglein-1。采用免疫印跡定位發(fā)現(xiàn)Claudin-1、ZO-1和Connexin-43存在于瘤胃黏膜顆粒層，從顆粒層到棘突層和基底層逐漸減少[16]。

表5 pH和HIS對奶山羊瘤胃上皮緊密連接蛋白mRNA表達量的影響

瘤胃酸中毒根據(jù)pH的大小和持續(xù)時間長短分為急性瘤胃酸中毒和SARA。通常認為pH<5.5并超過3 h即為SARA，而pH<5.2基本判定為急性酸中毒[20]。pH是瘤胃內(nèi)一項重要的生理指標，可以反映瘤胃發(fā)酵生理。但是對瘤胃發(fā)生SARA的臨界pH仍然說法不一，有學(xué)者提出瘤胃內(nèi)pH5.5～5.8屬于正常生理狀態(tài)，但是pH 5.0～5.5則屬于SARA狀態(tài)，pH在5.2～5.5屬于中度酸中毒[21]。近年來常以pH 5.2作為衡量急性酸中毒的臨界值，以pH低于5.5持續(xù)3 h以上判定為SARA發(fā)生的標志。

本試驗中pH是參照國內(nèi)外研究結(jié)果設(shè)定為7.4、5.5、5.2。由結(jié)果看出，隨著pH的降低，Claudin-1、Claudin-4 mRNA表達量下調(diào)，與王娟[22]研究結(jié)果相似。Claudin-7 mRNA在pH 5.5時表達量最低，可能說明pH 5.5時瘤胃上皮緊密連接功能部分受到破壞，所以pH 5.5作為公認的SARA界定標準比較合理，而當pH為5.2時，Claudin-1、Claudin-4 mRNA表達量下調(diào)可能說明發(fā)生了急性酸中毒。此時對瘤胃上皮緊密連接的破壞程度加深。Occludin隨pH降低表現(xiàn)上調(diào)趨勢，但變化不顯著。這與王娟[22]的報道不同，即Occludin mRNA的表達量主要受到pH的影響并且隨pH降低而降低。可能是由于培養(yǎng)方式不同所致，Ussing chamber的環(huán)境是模擬瘤胃環(huán)境，為保證短時間內(nèi)瘤胃上皮組織不失活。而多數(shù)學(xué)者是采用培養(yǎng)瘤胃上皮細胞為研究對象[23-24]。

3.2 pH和LPS對瘤胃上皮緊密連接蛋白mRNA表達量的影響

研究表明，飼糧NFC/NDF增加后，血漿LPS濃度升高，并引發(fā)奶山羊內(nèi)毒素血癥[25]。也有資料顯示，高谷物誘導(dǎo)反芻動物發(fā)生SARA時往往會伴隨血漿或者瘤胃液中LPS濃度的增加[26]。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，飼糧NFC/NDF由1.40增加到3.23時，血漿中LPS濃度也逐漸增加，由15.76×103EU/mL顯著增加到85.55×103EU/mL，與前人報道[13]相符。Chin等[27]對小腸上皮細胞研究發(fā)現(xiàn)，隨著LPS濃度的增加會一氧化氮(NO)的生成增加，減少ZO-1，改變緊密連接蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。此外，本課題組前期研究是體外通過Ussing chamber測定pH與HIS或LPS組合后，研究瘤胃上皮的電生理參數(shù)的變化，進而得出對于瘤胃上皮通透性，pH與HIS或LPS的交互作用大于單因素pH、HIS或LPS濃度[23]。結(jié)合以上試驗結(jié)果，探索損傷瘤胃上皮緊密連接的分子機制。

本試驗結(jié)果看出，這些緊密連接蛋白mRNA表達量有很大變化。pH與LPS處理對瘤胃上皮緊密連接蛋白mRNA的表達量的影響有所不同，其中以LPS為主效應(yīng)時，60 kEU/mL LPS的添加降低了Claudin-7 mRNA表達量，增加了ZO-1 mRNA表達量，降低了Occludin mRNA表達量。以pH為主效應(yīng)，與pH 7.4相比，pH 5.2顯著增加了Claudin-1、Claudin-7、ZO-1 mRNA表達量。pH與LPS的交互作用降低了Claudin-1、Claudin-7 mRNA表達量，且隨著pH的降低和LPS濃度的升高而呈現(xiàn)作用增強趨勢。

王娟[22]采用體外培養(yǎng)的瘤胃上皮細胞，通過設(shè)定培養(yǎng)液不同pH與短鏈脂肪酸(SCFA)濃度組合處理，發(fā)現(xiàn)對瘤胃上皮細胞Occludin mRNA表達量與對照組比無顯著差異；SCFA的添加顯著下調(diào)ZO-1 mRNA表達量。但SCFA的添加和低pH(<6.8)均顯著上調(diào)Claudin-1和Claudin-4 mRNA表達量。當反芻動物發(fā)生SARA后，瘤胃內(nèi)SCFA濃度增加，進一步降低了瘤胃內(nèi)pH，可見pH與SCFA能夠影響瘤胃上皮細胞緊密連接蛋白的表達。劉軍花[20]試驗發(fā)現(xiàn)，高谷物飼糧顯著降低了Claudin-4、Occludin和ZO-1 mRNA表達量。而本研究采用不同濃度的SCFA來配制的3個梯度的pH，在Ussing chamber中培養(yǎng)后測得ZO-1 mRNA表達量隨pH降低而先降低后升高。通過以上研究可以看出，在短期內(nèi)將瘤胃上皮置于不同pH的體外瘤胃模擬環(huán)境中，與正常pH相比，降低pH下調(diào)了緊密連接蛋白Claudin-1 mRNA表達量，綜合來看，且在pH 5.5處理下，對瘤胃上皮通透性的影響最嚴重。

3.3 pH和HIS對瘤胃上皮緊密連接蛋白mRNA表達量的影響

HIS是重要的生物活性物質(zhì)之一，也是Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)的重要介質(zhì)，參與變態(tài)反應(yīng)、過敏反應(yīng)、血管收縮和舒張；同時也是炎癥反應(yīng)和免疫損傷的重要介質(zhì)。當發(fā)生SARA時，瘤胃內(nèi)環(huán)境發(fā)生紊亂，瘤胃內(nèi)長期處于低pH狀態(tài)，組氨酸脫羧形成HIS，異常代謝產(chǎn)物HIS等增多[24]，造成瘤胃黏膜損傷，破壞了瘤胃屏障功能。反芻動物瘤胃上皮的屏障功能對維護瘤胃吸收、消化和代謝功能非常關(guān)鍵，上皮細胞可以通過細胞間隙的緊密連接蛋白調(diào)控小分子電中性溶質(zhì)和離子被動擴散。因此，緊密連接的健康是實現(xiàn)屏障功能所必需的[28]。程萌[12]的研究表明，當山羊瘤胃發(fā)生SARA時，其通透性發(fā)生改變，與對照組相比，SARA組瘤胃上皮緊密連接Claudin-4 mRNA的表達量顯著升高，且比對照組升高了38.61%。本研究對山羊瘤胃上皮緊密連接蛋白Claudin-1、Claudin-4、Claudin-7、Occludin和ZO-1 mRNA表達量進行研究。加入HIS后，瘤胃上皮緊密連接蛋白Claudin-1 mRNA表達量下調(diào)，而隨HIS濃度增加，Claudin-4 mRNA表達量先升高后降低。pH 5.5時的Claudin-1 mRNA表達量與pH 5.2時差異不顯著。Claudin-7 mRNA表達量有降低趨勢，且在pH 5.5×10.0 ng/mL HIS處顯著低于其他組。各組Occludin mRNA表達量無顯著差異。這與楊淑青[11]的研究不完全一致，楊淑青[11]指出發(fā)生SARA后緊密連接蛋白Occludin、ZO-1 mRNA表達量顯著降低，分別下降了51.3%和51.8%，這一研究的方法是誘導(dǎo)奶山羊發(fā)生SARA后屠宰，采集新鮮的瘤胃上皮樣本測定緊密連接蛋白mRNA表達量，而本研究是在Ussing chamber內(nèi)短期模擬誘導(dǎo)，這可能是造成差異的原因。

郭鵬等[29]指出血液中HIS含量隨飼糧NFC/NDF增加而表現(xiàn)增加趨勢。Aschenbach等[4]調(diào)查顯示，HIS誘導(dǎo)細胞凋亡，或增加細胞脫落，或干涉細胞核分裂和細胞成熟，這些變化意味著在SARA過程中異常代謝產(chǎn)物HIS能干擾上皮細胞的再生，進而造成細胞損傷，引發(fā)炎癥反應(yīng)。而在本試驗結(jié)果看出，pH與HIS交互作用對瘤胃上皮緊密連接蛋白mRNA的表達量的影響有所不同。降低pH或添加HIS均能顯著降低瘤胃上皮Claudin-1、Claudin-7 mRNA表達量。以HIS為主效應(yīng)，添加10.0 ng/mL HIS的ZO-1 mRNA表達量顯著高于添加0.5 ng/mL HIS，而這2者均顯著高于不添加HIS；以pH為主效應(yīng)，與pH 7.4相比，pH 5.5和pH 5.2時的Claudin-1 mRNA表達量均顯著降低，并且在pH 5.2時達最低。Claudin-7 mRNA表達量有降低趨勢。pH與HIS的交互作用對Claudin-1、Claudin-7與ZO-1 mRNA表達量有顯著影響。pH 5.5×0.5 ng/mL HIS組Claudin-1 mRNA表達量最低，但與pH 5.2×0.5 ng/mL HIS組差異不顯著，pH 7.4×10.0 ng/mL HIS組Claudin-7 mRNA顯著低于pH 7.4×0 ng/mL HIS組，但與pH 5.5×10.0 ng/mL HIS組差異不顯著。與pH 7.4×0 ng/mL HIS組相比，降低pH或添加HIS整體上提高了ZO-1 mRNA表達量，且 pH 5.2×10.0 ng/mL HIS組時顯著高于其他組。以上研究可見，瘤胃內(nèi)pH與HIS的交互影響下，顯著降低了部分緊密連接蛋白基因mRNA表達量，破壞瘤胃上皮結(jié)構(gòu)與功能，是引起SARA的主要誘因之一。

4 結(jié) 論

SARA發(fā)生后，pH與LPS或HIS交互作用于瘤胃上皮，降低瘤胃上皮緊密連接蛋白mRNA表達量，進而增大瘤胃上皮黏膜通透性。

參考文獻：

[1] HARHA N S,ANTONETTI D A.Regulation of tight junctions and loss of barrier function in pathophysiology[J].The International Journal of Biochemistry & Cell Biology,2004,36(7):1206-1237.

[2] STEELE M A,CROOM J,KAHLER M,et al.Bovine rumen epithelium undergoes rapid structural adaptation during grain-induced subacute ruminal acidosis[J].American Journal of Physiology:Regulatory,Integrative and Comparative Physiology,2011,300(6):R1515-R1523.

[3] EMMANUEL D G V,MADSEN K L,CHURCHILL T A,et al.Acidosis and lipopolysaccharide fromEscherichiacoliB∶055 cause hyperpermeability of rumen and colon tissues[J].Journal of Dairy Science,2007,90(12):5552-5557.

[4] ASCHENBACH J R,FüRLL B,GBEL G.Histamine affects growth of sheep ruminal epithelial cells kept in primary culture[J].Zentralblatt Fur Veterinarmdizin Reihe A,1998,45(6/7):411-416.

[5] PENNER G B,TANIGUCHI M,GUAN L L,et al.Effect of dietary forage to concentrate ratio on volatile fatty acid absorption and the expression of genes related to volatile fatty acid absorption and metabolism in ruminal tissue[J].Journal of Dairy Science,2009,92(6):2767-2781.

[6] BARTOLOVIC S, GRACNER G G, BEDRICA L, et al. Subacute ruminal acidosis in dairy cows[J].The Veterinal Journal,2012(1):32-38.

[7] 何雯.缺氧對LIMK1介導(dǎo)的cofilin磷酸化的影響及其在腸上皮屏障功能損害中的作用研究[D].碩士學(xué)位論文.重慶:第三軍醫(yī)大學(xué),2015.

[8] USSING H H,ZERAHN K.Active transport of sodium as the source of electric current in the short-circuited isolated frog skin[J].Acta physiologica Scandinavica,1951,23(2/3):110-127.

[9] 楊淑青,胡紅蓮,歐陽效晴,等.瘤胃上皮機械屏障的評定方法[J].中國畜牧獸醫(yī),2014,41(1):136-140.

[10] KLENVENHUSEN F,HOLLMANN M,PODSTATZKY-LICHTENSTEIN L,et al.Feeding barley grain-rich diets altered electrophysiological properties and permeability of the ruminal wall in a goat model[J].Journal of Dairy Science,2013,96(4):2293-2302.

[11] 楊淑青.亞急性瘤胃酸中毒對奶山羊瘤胃上皮屏障功能影響機制的研究[D].碩士學(xué)位論文.呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),2014.

[12] 程萌.亞急性瘤胃酸中毒對奶山羊瘤胃上皮通透性及細胞連接蛋白表達的影響[D].碩士學(xué)位論文.呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),2016.

[13] 孫燕勇,胡紅蓮,高民,等.亞急性瘤胃酸中毒對奶山羊血漿異常代謝產(chǎn)物及生化指標的影響[J].動物營養(yǎng)學(xué)報,2017,29(3):1046-1055.

[14] 章森.不同日糧模式對奶牛血漿內(nèi)毒素、代謝產(chǎn)物和激素含量的影響[D].碩士學(xué)位論文.重慶:西南大學(xué),2013.

[15] NRC.Nutrient requirements of goats:angora,dairy,and meat goats in temperate and tropical countries[S].Washington,D.C.:National Academy Press,1989.

[16] 金公亮.奶山羊飼養(yǎng)標準[J].畜牧獸醫(yī)雜志,1989,8(2):7-12.

[17] KHAFIPOUR E,KRAUSE D O,PLAIZIER J C.Alfalfa pellet-induced subacute ruminal acidosis in dairy cows increases bacterial endotoxin in the rumen without causing inflammation[J].Journal of Dairy Science,2009,92(4):1712-1724.

[18] 胡紅蓮,盧德勛,劉大程,等.日糧不同NFC/NDF比對奶山羊瘤胃pH、揮發(fā)性脂肪酸及乳酸含量的影響[J].動物營養(yǎng)學(xué)報,2010,22(3):595-601.

[19] ASCHENBACH JR,GABEL G.Effect and absorption of histamine in sheep rumen:significance of acidotic epithelial damage[J].Journal of Animal Science,2000,78(2):464-470.

[20] 劉軍花.亞急性瘤胃酸中毒對山羊瘤胃上皮屏障功能的影響及其機制[D].博士學(xué)位論文.南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2014.

[21] KOERS W C,BRITTON R,KLOPFENSTEIN T J,et al.Ruminal histamine,lactate and animal performance[J].Journal of Animal Science,1976,43(3):684-691.

[22] 王娟.不同精粗比日糧對奶牛和山羊瘤胃上皮屏障的影響[D].碩士學(xué)位論文.南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2012.

[23] 孫燕勇.亞急性瘤胃酸中毒對奶山羊瘤胃上皮通透性的影響及其機制研究[D].碩士學(xué)位論文.呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),2017.

[24] 胡紅蓮.奶山羊亞急性瘤胃酸中毒營養(yǎng)生理機制的研究[D].博士學(xué)位論文.呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),2008.

[25] 趙培廳.日糧不同NFC/NDF比對奶山羊瘤胃發(fā)酵功能和微生物區(qū)系變化的影響[D].碩士學(xué)位論文.呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),2011.

[26] GOZHO G N,KRAUSE D O,PLAIZIER J C.Ruminal lipopolysaccharide concentration and inflammatory response during grain-induced subacute ruminal acidosis in dairy cows[J].Journal of Dairy Science,2007,90(2):856-866.

[27] CHIN A C,FLYNN A N,FEDWICH J P,et al.The role of caspase-3 in lipopolysaccharide-mediated disruption of intestinal epithelial tight junctions[J].Canadian Journal of Physiology and Pharmacology,2006,84(10):1043-1050.

[28] RADOSTITS O M,BLOOD D C,GAY C C.Diseases of the alimentary tract-Ⅱ[M]//RADOSTITS O M,BLOOD D C,GAY C C.Veterinary medicine:a textbook of the diseases of cattle,sheep,pigs,goats and horses.8th ed.London:Baillière Tindall,1994.

[29] 郭鵬,劉大程,趙培廳,等.不同NFC/NDF比日糧對奶山羊瘤胃細菌及瘤胃和血漿中內(nèi)毒素及組胺含量的影響[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報,2015,46(1):96-103.