飼糧添加亮氨酸和谷氨酸對肥育豬肌肉脂肪酸組成和脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達的影響

胡誠軍 張 婷 張 濤 印遇龍 孔祥峰* 江青艷

(1.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點實驗室，動物營養(yǎng)生理與代謝過程實驗室，畜禽養(yǎng)殖污染控制與資源化技術(shù)國家工程實驗室，長沙 410125；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，動物科學(xué)學(xué)院，廣州 510642；3.贏創(chuàng)德固賽(中國)投資有限公司，北京 100600)

隨著我國居民生活水平的提高，消費者對豬肉品質(zhì)的要求越來越高，優(yōu)質(zhì)豬肉更易受到消費者的青睞。脂肪是影響胴體品質(zhì)和肉品風(fēng)味的關(guān)鍵因素，腹部和皮下脂肪沉積過多會降低胴體品質(zhì)，肌內(nèi)脂肪含量增加則可提高肉的嫩度和風(fēng)味；脂肪酸組成也是影響肉品質(zhì)的關(guān)鍵因素，其不僅決定肉的嫩度和多汁性，還與肉的營養(yǎng)價值密切相關(guān)[1]。育種手段提高瘦肉率的同時又會引起肌內(nèi)脂肪含量降低等問題[2]，而飼糧營養(yǎng)調(diào)控機體脂肪代謝效果顯著，這使其成為優(yōu)質(zhì)豬肉生產(chǎn)的一個重要調(diào)控手段。近年來的研究表明，亮氨酸不僅可以調(diào)節(jié)哺乳動物骨骼肌蛋白質(zhì)的代謝[3]，還可加速體內(nèi)脂肪氧化分解，減少脂肪在體內(nèi)的沉積以及脂肪細胞中甘油三酯的含量[4-5]。另外，亮氨酸還可顯著增加肥育豬肌內(nèi)脂肪的含量[6]。飼糧添加谷氨酸可降低肥育豬背膘厚[7]，提高肌內(nèi)脂肪含量[8]，改善肌肉中脂肪酸的組成[9]。不過也有研究表明，飼糧添加谷氨酸可增加脂肪在體內(nèi)的沉積，引起肥胖[10]。筆者前期研究表明，飼糧添加1.00%亮氨酸可提高背最長肌和股二頭肌中肌內(nèi)脂肪含量，且不影響肥育豬的生長性能；添加1.00%谷氨酸后，肥育豬背膘厚降低了34.3%；而添加1.00%亮氨酸+1.00%谷氨酸提高了股二頭肌肌內(nèi)脂肪含量，且不影響肥育豬的生長性能[11]。由上可見，亮氨酸和谷氨酸在調(diào)控動物機體脂質(zhì)代謝方面均具有一定作用，且其作用靶點不盡相同，但其具體作用機制尚不明確。脂肪的沉積取決于脂肪合成和分解2個動態(tài)過程，該過程受到多個基因的調(diào)控。因此，本試驗進一步探討飼糧添加亮氨酸和谷氨酸對肌肉脂肪酸組成和脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達的影響，旨在揭示其調(diào)控脂質(zhì)代謝的分子機制，為功能性氨基酸用于優(yōu)質(zhì)豬肉的生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物、分組與飼養(yǎng)管理

試驗選取平均體重為77 kg左右的杜×長×大肥育豬60頭，隨機分為5組，每組12頭，公母各占1/2，飼喂于HHIS-02A型全自動飼喂系統(tǒng)(河南河順自動化設(shè)備有限公司產(chǎn)品)中。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，在基礎(chǔ)飼糧中添加2.05%L-丙氨酸(L-丙氨酸可被機體多個組織分解代謝，因而可調(diào)節(jié)飼糧氮平衡[12])作為等氮對照組，試驗組在基礎(chǔ)飼糧中分別添加1.00%亮氨酸+1.37%L-丙氨酸(亮氨酸組)、1.00%谷氨酸+1.44%L-丙氨酸(谷氨酸組)、1.00%亮氨酸+1.00%谷氨酸(亮氨酸+谷氨酸組)。參照NRC(2012)豬營養(yǎng)需要推薦量配制玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧，其組成及營養(yǎng)水平見表1。飼養(yǎng)試驗在位于湖南新五豐股份有限公司永安分公司的中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所動物試驗基地開展，試驗期為60 d。飼養(yǎng)試驗期間自由采食和飲水。

1.2 樣品采集

飼養(yǎng)試驗結(jié)束后，頸動脈放血處死試驗豬，采集背最長肌和股二頭肌，液氮速凍后-80 ℃保存，用于分子生物學(xué)分析；另外各取100 g肌肉樣品于-20 ℃保存，用于脂肪酸含量測定。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1)預(yù)混料為每千克飼糧提供Premix provided the following per kg of the diet：Cu 15.10 mg，F(xiàn)e 150 mg，Se 0.30 mg，Zn 90 mg，Mn 61 mg，VD 386 IU，VA 9 100 IU，VE 135 IU，VK 2.24 mg，VB61.40 mg，泛酸鈣 calcium pantothenate 19.70 mg，煙酸 niacin 32.20 mg，VB120.028 mg，NaCl 4.10 g，CaHPO46.50 g，CaCO310.80 g。

2)營養(yǎng)水平為計算值。Nutrient levels were calculated values.

1.3 脂肪酸含量測定

取肌肉凍干樣品，用石油醚-乙醚(1∶1，體積比)提取脂肪后，用1 mL氫氧化鉀-甲醇溶液(0.4 mol/L)酯化30 min，然后熱水浴濃縮，加水分層，取500 μL上層液用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent Technologies，美國)測定，由微機按面積歸一化法計算脂肪酸各組分的含量，各脂肪酸含量以占總脂肪酸的百分比表示。

1.4 脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達測定

表2 PCR引物序列

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進行Duncan氏法多重比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧添加亮氨酸和谷氨酸對肥育豬背最長肌中脂肪酸組成的影響

由表3可知，與對照組相比，亮氨酸組背最長肌中C18∶0含量顯著降低(P<0.05)，C18∶2n-6和C20∶1含量顯著增加(P<0.05)；谷氨酸組背最長肌中C14∶0和C16∶0含量顯著降低(P<0.05)，C17∶0、C18∶2n-6和C20∶1含量顯著增加(P<0.05)。

2.2 飼糧添加亮氨酸和谷氨酸對肥育豬股二頭肌中脂肪酸組成的影響

由表4可知，與對照組相比，亮氨酸組股二頭肌中C16∶0含量顯著降低(P<0.05)，谷氨酸組股二頭肌中C18∶2n-6含量顯著增加(P<0.05)。

2.3 飼糧添加亮氨酸和谷氨酸對肥育豬背最長肌中脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達的影響

由表5可知，與對照組相比，亮氨酸組背最長肌中脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白1(FATP-1)mRNA的相對表達量顯著上調(diào)(P<0.05)，脂蛋白脂酶(LPL)mRNA的相對表達量顯著下調(diào)(P<0.05)；亮氨酸+谷氨酸組背最長肌中脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白4(FATP-4)mRNA的相對表達量顯著下調(diào)(P<0.05)。與等氮對照組相比，亮氨酸組背最長肌中FATP-1和FATP-4 mRNA的相對表達量顯著上調(diào)(P<0.05)，谷氨酸組和亮氨酸+谷氨酸組LPLmRNA的相對表達量顯著上調(diào)(P<0.05)。

表3 飼糧添加亮氨酸和谷氨酸對肥育豬背最長肌中脂肪酸組成的影響(占總脂肪酸的百分比)

表4 飼糧添加亮氨酸和谷氨酸對肥育豬股二頭肌中脂肪酸組成的影響(占總脂肪酸的百分比)Table 4 Effects of dietary Leu and Glu on fatty acid composition in biceps femoris muscle of finishing pigs (percentage of total fatty acids) %

表5 飼糧添加亮氨酸和谷氨酸對肥育豬背最長肌中脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達的影響

續(xù)表5項目Items對照組Controlgroup等氮對照組Iso-nitrogenouscontrolgroup亮氨酸組Leugroup谷氨酸組Glugroup亮氨酸+谷氨組Leu+Glugroup脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白1FATP-11.00±0.19b1.23±0.11b2.37±0.56a0.82±0.23b0.98±0.05b脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白4FATP-41.00±0.13a0.38±0.07c1.04±0.18a0.56±0.11abc0.50±0.30bc脂肪酸合成酶FAS1.00±0.140.98±0.211.25±0.290.80±0.131.09±0.36激素敏感脂酶HSL1.00±0.130.99±0.231.17±0.201.11±0.310.92±0.20脂蛋白脂酶LPL1.00±0.36a0.20±0.05b0.71±0.11b1.05±0.29a0.91±0.22a過氧化物酶體增殖物激活受體γPPARγ1.00±0.170.97±0.221.12±0.231.19±0.291.20±0.21

2.4 飼糧添加亮氨酸和谷氨酸對肥育豬股二頭肌中脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達的影響

由表6可知，與對照組相比，谷氨酸組和亮氨酸+谷氨酸組股二頭肌中FATP-4 mRNA的相對表達量顯著下調(diào)(P<0.05)。

表6 飼糧添加亮氨酸和谷氨酸對肥育豬股二頭肌中脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達的影響

3 討 論

肌肉中脂肪的含量及脂肪酸的組成對豬肉品質(zhì)具有重要影響，深入了解營養(yǎng)素調(diào)控肌肉中脂質(zhì)代謝的分子機制，將有助于提高動物的胴體性狀和肉品質(zhì)，為消費者提供優(yōu)質(zhì)的肉類產(chǎn)品。脂肪酸組成是影豬肉風(fēng)味、營養(yǎng)價值及氧化穩(wěn)定性的一個重要因素。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，飼糧添加亮氨酸可顯著降低肥育豬背最長肌中C18∶0[屬于飽和脂肪酸(SFA)]，顯著增加C18∶2n-6[屬于多不飽和脂肪酸(PUFA)]的含量；添加谷氨酸可顯著降低肥育豬背最長肌中C14∶0和C16∶0(屬于SFA)，顯著增加背最長肌和股二頭肌中C18∶2n-6(屬于PUFA)的含量；而同時添加亮氨酸和谷氨酸對肥育豬肌肉中脂肪酸組成未產(chǎn)生顯著影響。SFA攝入過多不但會增加消費者患心血管疾病的風(fēng)險[13]，還易引起肌肉組織胰島素抵抗[14]，而PUFA則可預(yù)防心血管疾病[13]。C18∶2n-6，即亞麻油酸，是一種必需脂肪酸，具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)等作用[15-16]。上述結(jié)果提示，飼糧添加亮氨酸或谷氨酸可通過降低肌肉中SFA含量來改善肌肉中脂肪酸的組成，進而提高豬肉的營養(yǎng)價值。然而Kong等[17]研究表明，飼糧添加谷氨酸提高了生長豬背最長肌中C16∶0的含量，上述差異可能是由于基礎(chǔ)飼糧和肥育豬的生長階段不同造成的。

筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加1.00%亮氨酸和1.00%谷氨酸顯著提高了肥育豬背最長肌和股二頭肌中肌內(nèi)脂肪的含量[11]，因此本研究進一步檢測了肌肉中與脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達情況，進一步探討亮氨酸和谷氨酸影響肌內(nèi)脂肪代謝的機制。本研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加亮氨酸可顯著上調(diào)肥育豬背最長肌中FATP-1和FATP-4基因的表達。FATP-1和FATP-4是脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白家族的2個成員，在脂肪酸轉(zhuǎn)運過程中發(fā)揮著重要作用。敲除FATP-1基因可減少肌肉細胞對長鏈脂肪酸(LCFA)的攝取、降低肌肉中甘油三酯的沉積[18]，過表達FATP-1基因可提高肌肉細胞對葡萄糖的氧化[19]；而FATP-4基因的表達量則與肥胖有關(guān)[20]。上述結(jié)果提示，飼糧添加亮氨酸可能通過促進肌肉細胞對LCFA的攝取，進而促進脂肪在肌肉中的沉積。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)飼糧同時添加亮氨酸和谷氨酸組合可顯著提高背最長肌肌內(nèi)脂肪含量[11]，然而本試驗中飼糧同時添加亮氨酸和谷氨酸則顯著下調(diào)了背最長肌中FATP-1和FATP-4基因表達，其具體機制還有待進一步研究。

乙酰輔酶A羧化酶(ACC)和脂肪酸合成酶(FAS)是合成脂肪酸的2個關(guān)鍵酶[21]，F(xiàn)AS基因表達量上升可顯著促進甘油三酯的沉積，進而引起肥胖[22]。過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)是調(diào)節(jié)脂肪分化的核心調(diào)控因子，具有脂肪組織特異性，除了直接參與脂肪分化外，還可調(diào)節(jié)FAS、ACC、LPL和激素敏感脂酶(HSL)等基因的表達[23]，間接影響脂質(zhì)代謝?？梢姡珹CC、FAS和PPARγ基因均與脂肪合成代謝有關(guān)。在本試驗中，飼糧添加亮氨酸、谷氨酸和亮氨酸+谷氨酸均未對育肥豬肌肉中ACC、FAS和PPARγ的表達產(chǎn)生顯著影響，提示亮氨酸和谷氨酸增加肌內(nèi)脂肪含量可能不是通過上調(diào)脂肪合成基因表達實現(xiàn)的。本研究結(jié)果與Madeira等[24]的結(jié)果一致，即飼糧添加亮氨酸不顯著影響背最長肌中ACC和FAS基因的表達；而Kong等[17]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加谷氨酸可提高背最長肌中肌內(nèi)脂肪含量，上調(diào)ACC基因的表達。結(jié)果不一致的原因可能是因為基礎(chǔ)飼糧不同，Kong等[17]是在高脂飼糧中添加谷氨酸。

FAS可催化乙酰輔酶A生成C16∶0[25]。在本研究中，飼糧添加谷氨酸顯著降低了肥育豬背最長肌中C16∶0的含量，飼糧添加亮氨酸顯著降低了股二頭肌中C16∶0的含量，但未對肌肉中FASmRNA的相對表達量產(chǎn)生顯著影響，提示亮氨酸和谷氨酸可能不影響C16∶0的合成代謝，但可上調(diào)與C16∶0分解相關(guān)基因的表達。LPL的主要功能是催化水解乳糜微粒和極低密度脂蛋白中的甘油三酯，動物體內(nèi)LPL活性是決定外周組織從血漿中攝取甘油三酯的重要因素，其表達量增加能夠顯著增加脂肪在皮下和肌肉中的沉積[25-26]。本試驗結(jié)果表明，飼糧添加谷氨酸和亮氨酸+谷氨酸可顯著上調(diào)肥育豬背最長肌中LPL基因的表達，提示其可通過調(diào)控LPL基因的表達影響肌肉中脂肪的沉積。

4 結(jié) 論

飼糧添加亮氨酸可顯著降低肥育豬背最長肌中C18∶0含量，顯著增加C18∶2n-6含量；飼糧添加谷氨酸可顯著降低肥育豬背最長肌中C14∶0和C16∶0含量，顯著增加C18∶2n-6含量；飼糧同時添加亮氨酸和谷氨酸對肥育豬肌肉中脂肪酸的組成未產(chǎn)生顯著影響，但可顯著上調(diào)背最長肌中LPL基因的表達。

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