烏飯樹組織培養(yǎng)苗瓶外生根技術研究

周 鵬，張 敏，黃 婧，孫海楠

(江蘇省林業(yè)科學研究院，江蘇 南京 211153)

烏飯樹(Vacciniumbracteatum)為杜鵑花科(Ericacece)越桔屬常綠灌木，分布于長江以南各省，適應性強，富含黃酮類、氨基酸和礦質(zhì)元素等成分，具有重要的食用和藥用價值，是一種極具開發(fā)利用潛力的樹種[1-2]。國內(nèi)外學者已在烏飯樹種質(zhì)資源收集和優(yōu)良品種選育方面開展了大量研究工作，而扦插和組織培養(yǎng)是良種繁育最主要的方式。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，烏飯樹扦插繁殖生根難，成苗率低于50%[3-4]，無法在短期內(nèi)獲得大量無性系苗木。因此，組織培養(yǎng)已成為烏飯樹良種快繁的重要手段，其中，試管苗生根是組織培養(yǎng)快繁的必經(jīng)過程[5]。目前，烏飯樹試管苗生根仍采用瓶內(nèi)生根[6]，存在生產(chǎn)成本高、育苗周期長、移栽成活率低等問題。因此，如何提高組織培養(yǎng)苗生根移栽效率成為烏飯樹規(guī)模化繁育的重要研究方向。

瓶外生根技術是瓶內(nèi)快速繁殖與試管外扦插技術相結合的繁殖方法，繼代增殖苗經(jīng)過處理后，在有菌和自養(yǎng)環(huán)境中進行移栽生根，有效地將試管苗生根和馴化結合起來，既降低了生產(chǎn)成本，又縮短育苗周期，提高了生產(chǎn)效率[5, 7, 8]。高方可等[9]研究發(fā)現(xiàn)，黑果腺肋花楸在瓶內(nèi)生根和移栽共需40 d，而瓶外生根可縮短 15—20 d。王蓉等[8]研究表明，葡萄瓶外生根的根系質(zhì)量優(yōu)于瓶內(nèi)，移栽馴化時間較瓶內(nèi)縮短了20 d，移栽成活率可提高34%。Debergh等[10]研究認為，組織培養(yǎng)苗瓶外生根可降低試管苗生產(chǎn)成本35%—75%。本研究探討了植物生長調(diào)節(jié)劑和扦插基質(zhì)對烏飯樹試管苗瓶外生根的影響，優(yōu)化烏飯樹試管苗瓶外生根技術，以降低組織培養(yǎng)成本，簡化操作程序，為實現(xiàn)烏飯樹工廠化育苗提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 試驗材料

供試材料為江蘇省林業(yè)科學研究選育的烏飯樹良種“蘇林南燭1號”組織培養(yǎng)苗。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計 設計L9(34)正交表，考察植物生長調(diào)節(jié)劑的種類、質(zhì)量濃度、處理時間及基質(zhì)4個因素對瓶外生根的影響，每因素3個水平，不考慮交互作用(見表1)。隨機以50根插穗為1個處理，共有9組處理組合，重復3次。

表1 正交設計試驗因素與水平

1.2.2 瓶外生根 將苗從瓶內(nèi)取出，選擇生長健壯、長勢一致的苗作為瓶外生根的插穗供體，用剪刀剪去芽苗根部膨大部分，清水清洗掉培養(yǎng)基，剪成長度為3 cm帶1個葉片的莖段。

根據(jù)試驗方案，將處理的插穗分別進行植物生長調(diào)節(jié)劑處理。隨后，用鑷子捏住插穗基部，插入基質(zhì)，深度為1.5—2 cm。插后用薄膜覆蓋保濕，膜內(nèi)濕度保持在 80%左右。置于溫度 25 ℃，光照 2 000—2 500 lx，光周期16 h的環(huán)境條件下培養(yǎng)，處理30 d后調(diào)查幼苗的生根生長情況。

1.3 數(shù)據(jù)處理

統(tǒng)計各處理的生根率、生根數(shù)和最長根長，數(shù)據(jù)采用SPSS統(tǒng)計軟件進行方差和極差分析。方差分析前對生根率進行反正弦轉(zhuǎn)換，多重比較采用Dancan法。同時，通過隸屬函數(shù)法對生根效果進行綜合評價。

隸屬函數(shù)值計算公式[11]：R(Xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)，i=1，2，3，…，n

式中，Xi為指標測定值；Xmin和Xmax分別為不同處理中某一指標的最小值和最大值。將測定值Xi利用公式換算成相應的隸屬函數(shù)值R(Xi)，并加和計算不同處理各指標綜合隸屬函數(shù)值。

2 結果與分析

2.1 不同處理因素對組織培養(yǎng)苗生根率的影響

表3方差分析結果表明，不同處理因素對組織培養(yǎng)苗生根率的影響不同，各處理因素F比值由大到小順序為基質(zhì)、處理時間、調(diào)節(jié)劑質(zhì)量濃度及種類?；|(zhì)、處理時間、質(zhì)量濃度顯著影響生根率(P< 0.05)，而生長調(diào)節(jié)劑種類對生根率影響差異不顯著(P>0.05)。

由表4可以看出，不同質(zhì)量濃度生長調(diào)節(jié)劑處理，500 mg/L處理的生根率最高，顯著高于200 mg/L處理和1 000 mg/L處理(P<0.05)；處理時間為5 s時生根率顯著高于其他處理(P<0.05)；不同基質(zhì)中，珍珠巖和泥炭生根率較大，分別比蛭石提高了19.8% 和 24.9%，且達到顯著差異(P<0.05)，而珍珠巖和泥炭之間的生根率差異不顯著(P>0.05)。

表2 正交設計L9 (34)試驗結果

2.2 不同處理因素對生根數(shù)的影響

在生根數(shù)方面，表3方差分析結果表明，各處理因素F比值由大到小順序為生長調(diào)節(jié)劑的質(zhì)量濃度、處理時間、基質(zhì)及生長調(diào)節(jié)劑種類。生長調(diào)節(jié)劑的種類對幼苗生根數(shù)影響不顯著(P>0.05)，其他因素對生根數(shù)的影響均達到顯著水平(P< 0.05)。

多重比較結果(見表4)表明，不同質(zhì)量濃度生長調(diào)節(jié)劑處理，500 mg/L處理的生根數(shù)最大，顯著高于200 mg/L處理(P<0.05)，而與1 000 mg/L之間差異不顯著(P>0.05)；5 s和1 min處理水平生根數(shù)較大，與1 h處理的差異達顯著水平(P<0.05)；不同基質(zhì)中，蛭石處理生根數(shù)最小，顯著低于泥炭和珍珠巖(P<0.05)。

表3 正交試驗方差分析

2.3 不同處理因素對根長的影響

在根長方面，表3結果表明，各處理因素F比值由大到小順序生長調(diào)節(jié)劑種類、基質(zhì)、質(zhì)量濃度、處理時間。其中，生長調(diào)節(jié)劑種類、基質(zhì)、質(zhì)量濃度對根長影響顯著(P< 0.05)。

由表4可知，IBA和ABT處理根長顯著高于NAA(P<0.05)，但2者間差異不顯著(P>0.05)；不同質(zhì)量濃度生長調(diào)節(jié)劑處理，200 mg/L處理根長最大，顯著高于其他2個水平(P<0.05)；不同基質(zhì)中，珍珠巖處理根長最大，分別比泥炭和蛭石提高了10.6% 和27.3%。

表4 不同因素處理下生根性狀及多重比較

2.4 不同處理因素對株高的影響

在株高方面，各處理因素F比值由大到小順序為基質(zhì)、生長調(diào)節(jié)劑種類、處理時間、質(zhì)量濃度。除生長調(diào)節(jié)劑質(zhì)量濃度，其他3個因素對株高影響均達到顯著水平(P< 0.05)(見表3)。

經(jīng)多重分析(見表4)可知，ABT處理根長值最大，且顯著高于NAA處理(P< 0.05)，但與IBA處理差異不顯著；不同生長調(diào)節(jié)劑處理時間，5 s和1 min處理幼苗株高較大，顯著高于1 h處理(P< 0.05)；不同基質(zhì)中，泥炭處理株高最大，顯著高于蛭石(P< 0.05)，但與珍珠巖之間差異不顯著(P>0.05)。

2.5 不同處理因素對植株鮮質(zhì)量的影響

在鮮質(zhì)量方面，由表3可知，各處理因素F比值由大到小順序為生長調(diào)節(jié)劑種類、處理時間、質(zhì)量濃度、基質(zhì)。生長調(diào)節(jié)劑種類、處理時間和質(zhì)量濃度均顯著影響植株質(zhì)量(P<0.05)，基質(zhì)對植株鮮質(zhì)量影響不顯著(P>0.05)。

不同生長調(diào)節(jié)劑處理，NAA和ABT處理后幼苗鮮質(zhì)量較大，顯著高于IBA(P<0.05)；不同質(zhì)量濃度處理中，200 mg/L處理的鮮質(zhì)量最小，顯著低于其他2個水平(P<0.05)；激素處理為5 s時，幼苗鮮質(zhì)量最大，顯著高于1 min處理，但與1 h處理差異不顯著(P>0.05)。

表5 不同處理隸屬函數(shù)值

2.6 生根效果的綜合評價

由表5可以看出，各處理綜合隸屬函數(shù)值排序為處理8>處理1>處理9>處理4>處理5>處理6>處理3>處理2>處理7。由此可知，處理8的綜合效果最好。依據(jù)每個處理的平均值P進行極差分析(見表6)，極差R值大小為基質(zhì)類型(1.710)>處理時間(1.580)>調(diào)節(jié)劑質(zhì)量濃度(0.550)>調(diào)節(jié)劑種類(0.445)，說明基質(zhì)類型對烏飯樹瓶外生根效果影響最大，調(diào)節(jié)劑處理時間次之，第3是質(zhì)量濃度，調(diào)節(jié)劑種類影響最小。較佳方案是A3B2C1D3，即處理8，調(diào)節(jié)劑種類為ABT1號，質(zhì)量濃度為500 mg/L，處理時間為5 s，基質(zhì)為珍珠巖，此時烏飯樹生根率為100.0%，生根數(shù)19.0，最長根長4.42 cm，株高3.24 cm，鮮質(zhì)量0.272 g(見表2)。

3 結論與討論

通過瓶外生根技術，烏飯樹組織培養(yǎng)莖段的生根率可達100%，遠超過嫩枝扦插[3-4]，其關鍵原因是瓶外生根使用的插穗供體為經(jīng)過組織培養(yǎng)返幼復壯的叢芽，具有更強發(fā)根能力[12]。植物生長調(diào)節(jié)劑有利于根原基的誘導及養(yǎng)分的調(diào)配，從而促進不定根形成[13]。本試驗中發(fā)現(xiàn)，所用的3種植物生長調(diào)節(jié)劑處理之間對生根率、根數(shù)的影響差異均不顯著，這與紫斑牡丹[14]的研究結果類似，但與歐洲云杉[13]、崖柏[15]、永福石櫟[16]研究得到的結果不一致，這說明不同生長調(diào)節(jié)劑對不同植物或同一植物不同類型插穗生根的影響不同。插穗的生根除與生長調(diào)節(jié)劑種類有關，還受生長調(diào)節(jié)劑質(zhì)量濃度和處理時間的影響。在一定范圍內(nèi)，生長調(diào)節(jié)劑質(zhì)量濃度越高，處理時間越長，生根效果越好，但生長調(diào)節(jié)劑質(zhì)量濃度過高和處理時間過長則抑制生根[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，短時間生長調(diào)節(jié)劑處理最利于組織培養(yǎng)苗瓶外生根，隨著處理時間增加生根效果顯著下降，且最佳生長調(diào)節(jié)劑質(zhì)量濃度和處理時間均低于烏飯樹嫰枝扦插試驗結果[3]，這可能是由于組織培養(yǎng)苗繼代過多，體內(nèi)生長調(diào)節(jié)劑積累[18-19]，從而導致組織培養(yǎng)苗生根較嫰枝對生長調(diào)節(jié)劑更為敏感。

表6 綜合隸屬函數(shù)值極差分析

扦插基質(zhì)的選擇不僅取決于植物的生物學特性，還必須滿足生根期間切口呼吸作用對氧氣、水分及養(yǎng)分供給的需求[20]。生根率方差分析(見表3)結果表明，基質(zhì)類型對組織培養(yǎng)苗誘導不定根起主導作用。蛭石通透性較泥炭和珍珠巖差，本試驗中發(fā)現(xiàn)，在蛭石處理生根率及生根數(shù)均顯著低于泥炭和珍珠巖，說明烏飯樹瓶外生根對基質(zhì)通透性要求較高。珍珠巖保水、通氣性好，有利于烏飯樹組織培養(yǎng)苗生根及發(fā)育，但pH較高，且其養(yǎng)分少[21]，在促進植株生長方面，與其他基質(zhì)差異不顯著(見表4)。與烏飯樹嫰枝扦插基質(zhì)試驗結果[4]不相同，泥炭對組織培養(yǎng)苗生根和根系生長的影響與珍珠巖差異均不顯著，這可能是因為泥炭雖具有較好的保溫、保肥效果，且偏酸性，但容易引起幼嫩組織培養(yǎng)苗及根系霉爛[22]。因此，從大規(guī)模生產(chǎn)的角度分析，珍珠巖廉價易得[4]，更適合作為烏飯樹規(guī)?；a(chǎn)的材料。

綜上，綜合考慮生根效果(見表6)，烏飯樹組織培養(yǎng)苗瓶外生根最佳方案是A3B2C1D3，即生長調(diào)節(jié)劑種類為ABT 1號，質(zhì)量濃度為500 mg/L，處理時間為5 s，基質(zhì)為珍珠巖。生根是一個復雜的生理生化過程，今后應繼續(xù)探討溫度、濕度和光照等對瓶外生根的影響，尋求更佳的外界環(huán)境條件；并以此為基礎，加強生根機理研究，為烏飯樹擴繁提供技術支持。

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