鐵線蓮‘Avant-Garde’組織培養(yǎng)及快速繁殖試驗

黃 婧，張 敏，周 鵬，周 潔，蔣澤平

(江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院，江蘇 南京 211153)

鐵線蓮(ClematisfloridaThunb.)是毛茛科(Ranunculaceae)鐵線蓮屬植物，多數(shù)為落葉或常綠草質(zhì)藤本，有“藤本皇后”的美稱。在我國主要分布于廣西、廣東、湖南、江西等地區(qū)[1]。生于陽光充足、濕潤、開闊的地方，喜肥沃、排水良好的堿性壤土。鐵線蓮的花期從早春到晚秋，果期夏季，花色艷麗，花形獨特，具有較高的觀賞價值[2]。此外，鐵線蓮一直作為傳統(tǒng)中藥材使用，根和全株都可入藥[3]。國外對鐵線蓮的培育馴化工作開展較早，引進觀賞性較強的國外品種，可以擴大鐵線蓮屬植物的應(yīng)用范圍，也能促進我國鐵線蓮屬植物育種事業(yè)的發(fā)展。歐洲的鐵線蓮品種‘Avant-Garde’屬于晚花大花型(Late Large-flowered Group)類群，有很高的觀賞價值和經(jīng)濟價值?；t色，大而漂亮?；ǘ湫切危ò晟罘奂t色，花朵中部為重瓣花，淺粉紅色，花藥黃色。‘Avant-Garde’的種子繁殖非常困難，只能采用無性繁殖手段，扦插繁殖的成活率較低，采用組織培養(yǎng)技術(shù)可以有效地解決這些問題。本試驗研究了鐵線蓮品種‘Avant-Garde’的組織培養(yǎng)技術(shù)，包括莖段增殖和瓶內(nèi)生根的培養(yǎng)基配方選擇，以期為產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)和推廣應(yīng)用提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1．1 材料處理

剪取當(dāng)年生嫩莖10 cm左右，用自來水清洗，接著用洗潔精浸泡10 min，再用自來水沖洗干凈。放置于超凈臺內(nèi)的無菌瓶中，用1%次氯酸鈉溶液浸泡消毒10 min，再用純水沖洗干凈。經(jīng)表面消毒后的莖段用滅過菌的濾紙吸干，切成1 cm左右的具節(jié)莖段待用。

1.2 培養(yǎng)基設(shè)計

1.2.1 基本培養(yǎng)基篩選 將表面消毒后的莖段作為外植體，切下接種在培養(yǎng)基中，每個處理10瓶，每瓶接種莖段4個，重復(fù)3次。基本培養(yǎng)基配方是MS和WPM。每種培養(yǎng)基附加3%(30 g/L)的蔗糖，0.6%(6 g/L)的卡拉膠，pH5.8。20 d后統(tǒng)計出芽外植體數(shù)和誘導(dǎo)的腋芽數(shù)。

1.2.2 增殖培養(yǎng) 以具節(jié)莖段為外植體，接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每個處理10瓶，每瓶接種莖段4個，3次重復(fù)。選擇篩選出的較適宜基本培養(yǎng)基進行增殖培養(yǎng)，按照處理組合(見表1)添加不同質(zhì)量濃度的NAA和6-BA，附加3%(30 g/L)的蔗糖，0.6%(6 g/L)的卡拉膠，pH5.8。20 d后統(tǒng)計新出的不定芽數(shù)，計算增殖系數(shù)。增殖系數(shù)=不定芽總數(shù)/誘導(dǎo)出不定芽的外植體總數(shù)。

表1 增殖培養(yǎng)基中植物生長調(diào)節(jié)劑 mg/L

1.2.3 生根培養(yǎng) 將新生的無菌苗切取3—4 cm左右的帶頂芽莖段作為生根苗，接入生根培養(yǎng)基中，每個處理10瓶，每瓶接種莖段1個，重復(fù)3次。生根培養(yǎng)基的配方以1/2 WPM作為基本培養(yǎng)基，按照處理組合(見表2)添加不同質(zhì)量濃度的NAA和IBA，附加3%(30 g/L)的蔗糖，0.6%(6 g/L)的卡拉膠，pH 5.8。20 d后統(tǒng)計生根幼苗數(shù)量，計算生根率。

表2 生根培養(yǎng)基中植物生長調(diào)節(jié)劑 mg/L

1.3 組織培養(yǎng)條件

光照時間12 h/d，光照強度1 000 lx，溫度(20±2) ℃，相對濕度60%。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和分析，對增殖系數(shù)和生根數(shù)量進行方差分析和Duncan檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基本培養(yǎng)基對具節(jié)莖段生長的影響

在不加任何植物生長調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基和WPM培養(yǎng)基上接種鐵線蓮具節(jié)莖段，接種20 d后，對莖段生長情況和出芽外植體數(shù)進行了調(diào)查，結(jié)果見表3。鐵線蓮莖段在2種培養(yǎng)基上都能被100%誘導(dǎo)出芽，莖段在WPM培養(yǎng)基中的誘導(dǎo)腋芽數(shù)多于在MS培養(yǎng)基中的數(shù)量。同時，通過肉眼觀察發(fā)現(xiàn)，在WPM培養(yǎng)基中生長的莖段更粗壯(未測量莖段粗度)，顏色更綠。由此，選擇WPM培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，進行后續(xù)的增殖和生根培養(yǎng)。

表3 不同培養(yǎng)基對腋芽誘導(dǎo)的影響

2.2 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對具節(jié)莖段增殖的影響

在WPM培養(yǎng)基上添加不同質(zhì)量濃度的NAA和6-BA進行增殖培養(yǎng)基篩選，培養(yǎng)20 d后進行調(diào)查。從表4中可見，不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合處理對鐵線蓮的繼代增殖有較大影響，增殖系數(shù)從1.41至2.83不等。方差分析(見表5)顯示，不同質(zhì)量濃度的6-BA處理之間有極顯著差異(P< 0.01)，而不同質(zhì)量濃度的NAA處理間沒有顯著差異(P> 0.05)。具體而言(見表6)，6-BA的3個質(zhì)量濃度(0.5，1.0 mg/L和2.0 mg/L)之間有顯著差異(P< 0.05)，其中，1.0 mg/L的處理與另外2個質(zhì)量濃度的處理相比，有極顯著差異(P< 0.01)。從數(shù)據(jù)的平均值來看，當(dāng)6-BA為1.0 mg/L時，增殖系數(shù)最高，平均值為2.66，所以最佳增殖培養(yǎng)的6-BA質(zhì)量濃度是1.0 mg/L；此外，當(dāng)6-BA為2.0 mg/L時，增殖系數(shù)最低，平均值為1.47，而其他2個質(zhì)量濃度的增殖系數(shù)較高。這可能是由于較高質(zhì)量濃度的6-BA在一定程度上抑制了莖段芽苗的生長。同時，隨著NAA質(zhì)量濃度的上升，增殖系數(shù)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當(dāng)NAA質(zhì)量濃度為0.1 mg/L時，增殖系數(shù)最高，平均值為2.13，所以最佳增殖培養(yǎng)的NAA質(zhì)量濃度是0.1 mg/L。因此鐵線蓮品種‘Avant-Garde’的最佳增殖培養(yǎng)基配方為WPM+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA。

表4 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對莖段增殖培養(yǎng)的影響

表5 增殖系數(shù)的方差分析結(jié)果

表6 增殖系數(shù)的Duncan檢驗

2.3 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對幼苗生根的影響

通過添加不同質(zhì)量濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑來刺激幼苗在組織培養(yǎng)瓶內(nèi)生根，結(jié)果統(tǒng)計見表7。處理B3中生根數(shù)最多，生根率達(dá)到50.00%；其次是處理B6，B2和B9，生根率分別為43.33%，40.00%和40.00%。方差分析(見表8)顯示，每種植物生長調(diào)節(jié)劑的不同質(zhì)量濃度處理間都存在極顯著差異(P< 0.01)。Duncan檢測結(jié)果顯示(見表9)，NAA的3種質(zhì)量濃度水平之間存在顯著差異(P< 0.05)，其中，0.15 mg/L與另外2種質(zhì)量濃度處理之間有極顯著差異(P< 0.01)。生根幼苗數(shù)量隨著NAA質(zhì)量濃度升高而增加，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.15 mg/L時，幼苗生根數(shù)量最多，平均12.25個，由此認(rèn)為誘導(dǎo)生根的NAA最適合質(zhì)量濃度為0.15 mg/L。IBA在0.2 mg/L水平與其他3種質(zhì)量濃度之間，有極顯著差異(P< 0.01)，且生根幼苗數(shù)量隨著IBA質(zhì)量濃度升高而減少，在0.2 mg/L時，生根幼苗數(shù)量最多，平均12.67個，由此認(rèn)為誘導(dǎo)生根的IBA最適合質(zhì)量濃度為0.2 mg/L。因此鐵線蓮品種‘Avant-Garde’的最佳生根培養(yǎng)基配方為1/2 WPM+0.15 mg/L NAA+0.2 mg/L IBA。

表7 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對生根培養(yǎng)的影響

表8 幼苗生根數(shù)量的方差分析結(jié)果

表9 生根數(shù)量的Duncan檢驗

3 結(jié)論與討論

本試驗對適合鐵線蓮品種‘Avant-Garde’生長的增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基進行了篩選，并對培養(yǎng)基中的不同植物生長調(diào)節(jié)劑質(zhì)量濃度進行了比較分析，最終獲得的最適增殖培養(yǎng)基配方是WPM+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA，增殖系數(shù)達(dá)到2.83；最佳生根培養(yǎng)基配方為1/2 WPM+0.15 mg/L NAA +0.2 mg/L IBA，生根率達(dá)到50%。

經(jīng)過比較試驗，發(fā)現(xiàn)鐵線蓮品種‘Avant-Garde’在WPM培養(yǎng)基上生長狀態(tài)更好，所以選擇WPM培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基。根據(jù)前人的研究[4-6]，發(fā)現(xiàn)不同的植物生長調(diào)節(jié)劑配比會對鐵線蓮的組織分化、生根誘導(dǎo)和次生代謝產(chǎn)生不同的影響。試驗中發(fā)現(xiàn)，6-BA的質(zhì)量濃度過高會使幼苗基部的愈傷組織膨大、腋芽的生長速率變慢，這與前人研究的結(jié)果類似[7-8]。這說明6-BA具有促進植株芽生長和誘導(dǎo)愈傷組織的雙重功能，在今后應(yīng)該根據(jù)培育目標(biāo)采用合適的用量。

課題組前期的試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鐵線蓮品種‘Avant-Garde’的扦插成活率較低(數(shù)據(jù)未發(fā)表)，需要進行瓶內(nèi)生根培養(yǎng)。瓶內(nèi)生根技術(shù)可以使組織培養(yǎng)苗逐步適應(yīng)外部環(huán)境，為幼苗成功移植到瓶外環(huán)境奠定基礎(chǔ)，目前這種技術(shù)已經(jīng)在鐵線蓮和許多其他植物中得到良好的應(yīng)用[9-11]。生根培養(yǎng)需要降低培養(yǎng)基中的礦物元素濃度，減少幼苗體內(nèi)積累的細(xì)胞分裂素，并加入適當(dāng)?shù)纳L素。因此，本試驗在生根階段采用1/2 WPM作為基本培養(yǎng)基，去掉細(xì)胞分裂素6-BA，并根據(jù)前人的研究經(jīng)驗[12-14]，加入不同質(zhì)量濃度的生長素IAA和NAA誘導(dǎo)鐵線蓮生根。當(dāng)NAA質(zhì)量濃度為0.15 mg/L，同時IBA質(zhì)量濃度為0.2 mg/L時，生根效率最高，可達(dá)到50%。今后，需要研究分析鐵線蓮‘Avant-Garde’扦插生根和組織培養(yǎng)瓶內(nèi)生根過程中的植物生長調(diào)節(jié)劑水平、次生代謝和基因表達(dá)的異同，找出該品種生根困難的原因，提高品種的生根率、生根速度和移栽成活率。

參考文獻：

[1] 王文采, 云南植物志[M]. 昆明:云南科學(xué)技術(shù)出版社, 2000.

[2] 章銀柯, 江 燕. 我國鐵線蓮屬植物研究現(xiàn)狀及其園林應(yīng)用[J]. 北方園藝, 2007(3):122-124.

[3] 劉玉國, 劉玉紅. 鐵線蓮屬藥用植物化學(xué)研究概況[J]. 新疆中醫(yī)藥, 2000(1):58-59.

[4] 倪 新, 馬 毓. 紅花鐵線蓮(Clematiscoccinea)的組織培養(yǎng)[J]. 植物學(xué)報, 1984, 2(23): 71-73.

[5] 王玉敏. 辣蓼鐵線蓮根芽愈傷組織試管苗培養(yǎng)研究[J]. 河南科學(xué), 2014(3):372-375.

[6] 張啟香, 胡恒康, 方炎明. 鐵線蓮‘Multi-Blue’體細(xì)胞胚誘導(dǎo)和植株再生[J]. 南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2010,34(6):18-22.

[7] 成 璐. 兩種鐵線蓮植物組織培養(yǎng)的初步研究[D]. 哈爾濱:東北林業(yè)大學(xué), 2014.

[8] 李麗容, 金開正. 鐵線蓮組培快繁技術(shù)研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2016, 44(15):138-139.

[9] 王 輝. 三種中國野生鐵線蓮組織培養(yǎng)研究[D]. 南京:南京林業(yè)大學(xué), 2012.

[10] 高麗霞, 鄒春萍. 花卉試管苗瓶內(nèi)生根介質(zhì)改進的研究[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技, 2008(12):37-37.

[11] 劉紅堅, 范業(yè)賡, 何為中,等. 甘蔗試管苗瓶內(nèi)生根與瓶外生根培養(yǎng)方法比較研究[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, 40(18):13-15.

[12] 黃余磊, 呂枷薪, 蔣 明, 等. 單葉鐵線蓮Clematishenryi愈傷組織誘導(dǎo)與植株再生[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2011,23(4):731-735.

[13] 李宗艷, 唐 岱, 黃開勇. 轉(zhuǎn)子蓮的繁殖研究[J]. 西南林學(xué)院學(xué)報, 2004, 24(3):4-6.

[14] 吳 榮, 林 萍, 樊國盛, 等. 鐵線蓮‘Gispy Queen’組織培養(yǎng)與快速繁殖(簡報)[J]. 亞熱帶植物科學(xué), 2011, 40(2):69-69.