JLN綜合征中國家系研究新發(fā)現(xiàn)的KCNE1基因錯(cuò)義突變

丁軒詣　丁旵東　楊二麗

【摘要】 目的：對伴發(fā)室性心律失常電風(fēng)暴的Jervell-Lange-Nielsen綜合征（JLNS）（先天性QT間期延長綜合征伴先天性耳聾亞型）一家系進(jìn)行基因突變檢測，以期發(fā)現(xiàn)中國人特有的基因突變。方法：采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）及DNA直接測序法對JLNS一家系進(jìn)行KCNE1檢測。結(jié)果：先證者及7位家系成員的KCNE1基因的第112位外顯子發(fā)現(xiàn)一錯(cuò)義突變：A→G，致絲氨酸密碼子（AGT）變成甘氨酸密碼子（GGT）。結(jié)論：JLNS可由KCNE1基因的突變引起，KCNE1基因第112位A→G錯(cuò)義突變是首次發(fā)現(xiàn)的中國JLNS的突變基因及位點(diǎn)。

【關(guān)鍵詞】 QT延長綜合征； 基因； 突變

Newly Discovered Missense Mutation of KCNE1 Gene in Chinese Family Study of JLN Syndrome/DING Xuanyi，DING Chandong，YANG Erli，et al.//Medical Innovation of China，2018，15（03）：139-142

【Abstract】 Objective：To detected gene mutation in Chinese family with Jervell-Lange-Nielsen syndrome（JLNS） associated with electrical storm of ventricular arrhythmia（congenital long QT syndrome with congenital deafness subtype），in order to find a specific gene mutation in Chinese.Method：Polymerase chain reaction（PCR） and direct sequencing of DNA were used to detect KCNE1 in a family of JLNS.Result：A missense mutation was found in the 112nd exons of the KCNE1 gene of the proband and 7 members of family：A→G，causing serine codon（AGT） to turn into glycine codon（GGT）.Novel heterozygous mutation in the exon 112 of KCNE1 was identified in proband and 7 of 9 her relatives，nucleotide A was replaced by G，which led to change of amino acid.Conclusion：JLNS can be caused by the mutation of the KCNE1 gene，and the A to G missense mutation of the 112nd gene of the KCNE1 gene is the first found mutation gene and site of the Chinese JLNS.

【Key words】 Long QT syndrome； Genes； Mutation

First-authors address：Hefei No.1 Middle School，Hefei 230601，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.03.038

先天性QT間期延長綜合征（long QT syndrome，LQTS）是一種家族遺傳性疾病，臨床表現(xiàn)為QTc間期異常延長、反復(fù)發(fā)作致命性心律失常導(dǎo)致暈厥甚至猝死，同時(shí)伴有或不伴有先天性耳聾，并且稱伴有先天性耳聾的為Jervell-Lange-Nielsen綜合征（JLNS），不伴先天性耳聾的稱Romano-Ward綜合征（RWS）。其中，JLNS是較RWS更為罕見的類型[發(fā)病率（1～6）∶1 000 000]，JLNS患者發(fā)生暈厥和猝死等惡性事件的概率也更高[1-2]。由于JLNS是罕發(fā)疾病，目前國內(nèi)外深入研究較少，國外先前研究發(fā)現(xiàn)JLNS發(fā)病與KCNQ1或KCNE1基因突變有關(guān)，但國內(nèi)研究僅有KCNQ1基因突變的病例報(bào)道[3-5]。安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院收住了一例發(fā)作室性心律失常電風(fēng)暴（24 h內(nèi)發(fā)生2次以上室性心動(dòng)過速或心室顫動(dòng)）的JLNS患者，急診消融觸發(fā)心室電風(fēng)暴的室性早搏病灶，對患者及其家系成員進(jìn)行了KCNE1基因檢測，以便能夠進(jìn)一步推動(dòng)對JLNS基因突變位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 先證者及其家系臨床資料 先證者女性51歲，自幼耳聾，近年多次發(fā)生暈厥，入院后24 h內(nèi)心電監(jiān)護(hù)多次記錄到室性早搏觸發(fā)的尖端扭轉(zhuǎn)性室性心動(dòng)過速甚至短暫心室顫動(dòng)，可自行緩解，發(fā)作時(shí)患者意識喪失，四肢抽搐。發(fā)作間期心電圖（ECG）提示QTc>500 ms。耳鼻喉?？茩z查提示雙側(cè)極重度感音神經(jīng)性耳聾。符合JLNS診斷：（1）先天性耳聾；（2）QTc>460 ms；（3）有暈厥史或尖端扭轉(zhuǎn)型室性心動(dòng)過速/心室顫動(dòng)的發(fā)作[6-10]。為降低猝死風(fēng)險(xiǎn)，急診在三維導(dǎo)航指引下行室性早搏觸發(fā)病灶的消融治療[11-16]。該家系來自中國安徽省，共3代、10人（含先證者），均進(jìn)行ECG及相關(guān)臨床檢查。2例患有先天性聽力障礙（先證者及其兒）被診斷為JLNS。

1.2 血樣標(biāo)本的收集與處理 首先抽取患者及其家庭成員的靜脈血2～5 mL，進(jìn)行抗凝處理后冷藏在-70 ℃的冰柜中。

1.3 主要試劑 選擇Sigma公司生產(chǎn)的蛋白酶和biostar公司生產(chǎn)的聚合酶、DNTP，以及基因公司生產(chǎn)的試劑盒和試劑等。

1.4 基因組DNA的獲取 常規(guī)酚/氯仿提取白細(xì)胞基因組DNA。

1.5 基因組聚合酶鏈反應(yīng)（PCR） （1）引物合成：PAGE方式合成KCNE1基因的3對引物[4]，由廣州廣譽(yù)生物科技有限公司合成，引物序列，見表1。（2）PCR擴(kuò)增：使用高保真PCR酶KOD-Plus-Neo，以基因組DNA為模板配制以下反應(yīng)體系（50 μL），見表2。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性

3 min，98 ℃變性10 s（循環(huán)30次），58 ℃退火30 s（循環(huán)30次），68 ℃延伸20 s（循環(huán)30次），68 ℃再延伸5 min[4]。

1.6 DNA測序 使用3700DNA測序儀對濃度為5 μmol/L的純化后的聚合酶反應(yīng)物進(jìn)行DNA正反雙向測序。為進(jìn)一步驗(yàn)證檢測結(jié)果的正確性，使用T-VECTOR對純化后的PCR產(chǎn)物導(dǎo)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過正反雙向檢測所提取的陽性克隆質(zhì)粒發(fā)現(xiàn)，直接測序的結(jié)果與其相同。

1.7 突變位點(diǎn)的確定 對測序結(jié)果KCNE1 DNA全長使用Genebank blast軟件進(jìn)行比對，以便其突變位點(diǎn)的進(jìn)一步確定。同時(shí)經(jīng)過在Human Mutation Database網(wǎng)站上的進(jìn)一步確定其無新的突變產(chǎn)生。另選取10名普通人的DNA進(jìn)行提取并進(jìn)行KCNE1外顯子112的PCR擴(kuò)增，經(jīng)直接測序發(fā)現(xiàn)在普通人中無該突變點(diǎn)的存在[17]。

2 結(jié)果

（1）先證者在三維導(dǎo)航指引下急診行室性早搏觸發(fā)病灶消融治療后，住院期間心電監(jiān)護(hù)及出院隨訪6個(gè)月均未再出現(xiàn)暈厥或惡性室性心律失常發(fā)作。（2）基因組DNA提取及PCR擴(kuò)增結(jié)果，見圖1、2。（3）測序結(jié)果：家系成員除女兒和三舅孫女外其余8人都在KCNE1基因的第112位發(fā)生A→G的錯(cuò)義突變，引起絲氨酸密碼子（AGT）改變成甘氨酸密碼子（GGT）。見圖3、4。

3 討論

JLNS1和JLNS2是目前確定的兩種類型的JLNS，其中KCNQ1基因和KCNE1基因分別為JLNS1型和JLNS2型的致病基因[18-19]。在以前的研究中普遍覺得JLNS是由于這兩種基因的結(jié)合和突變產(chǎn)生的，但經(jīng)過前一段時(shí)間的研究發(fā)現(xiàn)，JLNS也可能會因?yàn)镵CNQ1基因的復(fù)雜的雜合突變而產(chǎn)生，患者的體內(nèi)會產(chǎn)生來自于父方和母方兩個(gè)方面的雜合突變，這兩種突變同時(shí)產(chǎn)生并發(fā)揮作用[6-7]。本研究結(jié)果顯示，該家系成員除女兒及三舅孫女外的KCNE1基因第112位外顯子發(fā)生A→G的錯(cuò)義突變，致AGT變成GGT，使編碼的絲氨酸被甘氨酸所代替。按照上述致病基因分型，本研究的先證者系JLNS2型患者。JLNS2型是否也存在雜合突變，目前尚沒有報(bào)道。本研究初步結(jié)果表明，JLNS2型也可以只是KCNE1基因的雜合突變，至于是否合并有其他基因的雜合突變有待于后續(xù)研究進(jìn)一步證實(shí)。

KCNE1基因又稱minK，由Murai在1989年最先報(bào)道，基因定位于21q22.1-22.2，長約40 bp，有三個(gè)外顯子，其中兩個(gè)位于5-UTR，該基因編碼的minK由129個(gè)氨基酸殘基組成，分為胞外區(qū)、跨膜區(qū)、胞漿區(qū)三個(gè)部位組成，只有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，其中胞外區(qū)、跨膜區(qū)均為小片段。KCNE1基因主要在多種人體組織及外周血白細(xì)胞中表達(dá)。minK起主要作用機(jī)制是輔助α-亞基和β-亞基組成復(fù)合離子門控通道，并通過調(diào)節(jié)α-亞基門控，增強(qiáng)復(fù)合離子通道的穩(wěn)定性。KCNE1在異源表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生的電流動(dòng)力學(xué)特征與慢速激活鉀通道電流（IKs）相似，且心臟各處均有KCNE1的表達(dá)，心臟電流由KCNE1蛋白異源多聚體所介導(dǎo)，KCNE1異?？梢饜盒允倚孕穆墒С５陌l(fā)生，臨床表現(xiàn)反復(fù)暈厥甚至猝死[8-10]。

而先天性神經(jīng)性耳聾，則是JLNS和RWS區(qū)別的重要表現(xiàn)。造成耳聾的機(jī)制為：KCNQ1或KCNE1基因在內(nèi)耳的血管紋狀細(xì)胞中發(fā)生基因異常突變從而產(chǎn)生異常的亞單位，導(dǎo)致淋巴系統(tǒng)分泌紊亂和耳蝸中室的塌陷，從而引起耳聾的發(fā)生[11-12]。本研究結(jié)果顯示，先證者KCNE1基因突變A→G錯(cuò)義突變，使編碼的AGT被GGT所代替，產(chǎn)生結(jié)構(gòu)功能異常的亞單位，是產(chǎn)生先天性耳聾的基礎(chǔ)。

Russell等[13]發(fā)現(xiàn)，JLNS型LQTS并沒有完全遵循隱性遺傳的規(guī)律，其基因攜帶者表現(xiàn)出常染色體顯性遺傳的特點(diǎn)，其QT間期輕、中度延長，并可有暈厥發(fā)作，但不伴有耳聾。本研究家系部分成員也存在KCNE1的錯(cuò)義突變，但并沒有伴有先天性耳聾。為何出現(xiàn)相同的基因位點(diǎn)突變，只有部分家系成員呈現(xiàn)JLNS表型特征，是否呈現(xiàn)JLNS表型特征的成員還存在其他相關(guān)基因的突變，即存在幾個(gè)基因的復(fù)合的雜合突變，尚有很多未知的領(lǐng)域值得探討[20]。

綜上所述，JLNS可由KCNE1基因的突變引起，KCNE1基因第112位A→G錯(cuò)義突變是首次發(fā)現(xiàn)的中國JLNS的突變基因及位點(diǎn)。

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（收稿日期：2017-12-15） （本文編輯：董悅）