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    關(guān)于131I標(biāo)記酪氨酸修飾的血管靶向肽GX1用于消化道腫瘤診治的實(shí)驗(yàn)研究

    2018-05-23 11:48:25曲士穎王鐵黃京偉
    關(guān)鍵詞:放射性結(jié)腸癌靶向

    曲士穎,王鐵,黃京偉

    (北京朝陽醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科,北京 100020)

    胃腸道腫瘤是人類常見的一類惡性腫瘤,而且很多患者發(fā)現(xiàn)時就已處于腫瘤的進(jìn)展期或晚期,加之目前的醫(yī)療技術(shù)尚缺乏有效的治療對策,故死亡率很高??茖W(xué)家們也因此在不斷地探索更高效的新的診斷和治療方法[1]。隨著腫瘤生長依靠新生血管生成學(xué)說的出現(xiàn),關(guān)于腫瘤新生血管抑制相關(guān)的治療方法的研究也應(yīng)運(yùn)展開[2]。近年來放射性核素標(biāo)記小分子多肽輔助腫瘤顯影在腫瘤的診斷與治療中悄然興起,其中包括對治療性放射性核素標(biāo)記靶向性小肽或單抗進(jìn)行放射治療的方法[3]。放射性靶向治療是其中的一種,即采用放射性核素標(biāo)記配體做示蹤劑,使之與高表達(dá)的受體或分子結(jié)合,可使腫瘤部位顯影并可利用其放射效應(yīng)對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷[4]。此外,將其與腫瘤導(dǎo)向治療藥物聯(lián)合,可以達(dá)到增強(qiáng)腫瘤治療療效、降低身體其它部位藥物毒性和不良反應(yīng)的目的[5]。GX1短肽是一種新近篩選開發(fā)出的環(huán)狀小肽,其氨基酸序列為CGNSNPKSC。大量的研究結(jié)果提示GX1在體內(nèi)外都具有腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞靶向性,不失為一種新的腫瘤血管標(biāo)記配體,可以聯(lián)合其他抗腫瘤藥物,在腫瘤的抗血管生成治療領(lǐng)域大展身手[6]。本研究擬合成酪氨酸(Tyr)修飾的GX1短肽,探討131I標(biāo)記該修飾短肽(Tyr- GX1)標(biāo)記消化道腫瘤的相關(guān)分子影像敏感性,為診斷以及進(jìn)一步開發(fā)體外放射治療研究提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 試劑與儀器 主要試劑包括:Tyr修飾GX1短肽:為上海吉爾生化公司合成并純化;Iodogen包被管:按照J(rèn).M.Walker所述方法制備[7];Na131I溶液:為北京原子高科股份有限公司生產(chǎn);單通道γ射線放射性測量儀:為西安志達(dá)科技有限公司生產(chǎn);CRC- 15PET型活度計(jì):為美國CAPINTEC公司生產(chǎn);SPECT顯像儀:為美國GE公司生產(chǎn)的Millennium Hawkeye VG型雙探頭SPECT顯像儀。

    1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物 取雌性4~6周Balb/c裸鼠(上海邦耀生物科技有限公司)36只用于試驗(yàn)研究,于SPF清潔級環(huán)境喂養(yǎng),符合動物實(shí)驗(yàn)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

    1.1.3 細(xì)胞與試劑 人結(jié)腸癌細(xì)胞LOVO,人胃低分化腺癌細(xì)胞系SGC7901細(xì)胞(均由中科院上海細(xì)胞生物研究所提供),細(xì)胞培養(yǎng)使用RPMI- 1640培養(yǎng)液(Hyclone公司),胎牛血清購自上海翊圣生物科技有限公司。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 標(biāo)記方法及放化純測定 應(yīng)用Iodogen碘標(biāo)法標(biāo)記Tyr- GX1短肽。在包被管中迅速按順序依次加入Tyr- GX1短肽(10 μg·20 μl-1)、Na131I溶液(11.1 MBq),在pH 7.4的磷酸鹽緩沖液控制反應(yīng)體系體積40 μl,于室溫靜置完成標(biāo)記。使用紙層析法測定標(biāo)記產(chǎn)物的標(biāo)記率和放射化學(xué)純度,并計(jì)算比活度。丙酮(展開劑Ⅰ),氨水(展開劑Ⅱ)∶乙醇∶水按照1∶2∶5配制,131I- Tyr- GX1肽的Rf=0.0~0.1,游離131I的Rf=0.8~1.0。

    1.2.2 標(biāo)記率測定 測定其中131I放射性百分率:通過131I- Tyr- GX1肽于室溫下分別與人血清、鼠血清、PBS等溶液混合,分別在0、6、12、24 h測定標(biāo)記率。

    1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)與動物模型的建立 腫瘤細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中,于37 ℃、5% CO2及飽和濕度的孵箱中培養(yǎng),觀察細(xì)胞生長并取對數(shù)生長期的細(xì)胞,用0.25%胰酶消化后培養(yǎng)基重懸收集離心細(xì)胞,洗滌后調(diào)整細(xì)胞密度用于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)動物制成荷結(jié)腸癌裸鼠、荷胃癌裸鼠等實(shí)驗(yàn)動物模型。具體方法:準(zhǔn)備瘤源,將腫瘤組織放置在無菌生理鹽水中,用無菌眼科剪剔除出血及壞死組織,分割成若干小塊,每塊直徑約1 mm備用。麻醉裸鼠,消毒,腹腔注射4%水合氯醛0.1 ml·kg-1,裸鼠四肢緊張度明顯降低,角膜反射遲鈍,皮膚痛覺消失時完成麻醉,取仰臥位固定四肢,75%酒精消毒。將切好備用的腫瘤組織移植到裸鼠體內(nèi)。

    1.2.4 標(biāo)記肽在荷瘤裸鼠體內(nèi)的生物學(xué)分布 荷人胃癌移植瘤和結(jié)腸癌移植瘤裸鼠每種腫瘤設(shè)3只一組,共設(shè)6組,兩種腫瘤模型合計(jì)裸鼠共36只。每只裸鼠通過尾靜脈注射7.4 MBq·200 μl-1的131I- Tyr- GX1肽,于注射后不同時間點(diǎn)處死裸鼠,解剖并取其相關(guān)組織稱重、測定放射性計(jì)數(shù),經(jīng)物理衰變校正后計(jì)算每克組織百分?jǐn)z取率(%ID·g-1)和腫瘤與非腫瘤組織的放射性攝取比值(T/NT)。

    1.2.5 荷瘤裸鼠體內(nèi)SPECT顯像 荷瘤裸鼠分別經(jīng)尾靜脈注射11.1 MBq·300 μl-1的131I- Tyr- GX1肽,于注射后不同時間點(diǎn)分別行裸鼠SPECT顯像。利用ROI技術(shù)計(jì)算不同時相T/NT。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包用于相關(guān)數(shù)據(jù)的分析,統(tǒng)計(jì)分析采用卡方檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)以及方差分析等所有統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05,即P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 標(biāo)記肽的標(biāo)記率與穩(wěn)定性

    用直接標(biāo)記法標(biāo)記Tyr- GX1、GX1短肽,測定標(biāo)記率在90%~97%范圍,無需純化,比活度也滿足成像的需求。通過與生理鹽水和EDTA、新鮮人血清以及半胱氨酸在一定條件下混合,觀察24 h內(nèi)標(biāo)記率變化情況,未見各個混合溶液中標(biāo)記率的明顯變化,提示穩(wěn)定性良好。詳見表1。

    表1標(biāo)記率與穩(wěn)定性情況分析

    時間點(diǎn)/hRCP/%生理鹽水EDTA血清半胱氨酸09695949669594939512959492952495949095

    2.2 24 h顯影結(jié)果分析

    131I標(biāo)記Tyr- GX1后經(jīng)尾靜脈注射入裸鼠體內(nèi),分析24 h顯像等結(jié)果,探討Tyr- GX1短肽的腫瘤血管靶向性等特征。本研究中荷胃癌動物Tyr- GX1組自8 h開 始,實(shí)驗(yàn)動物右后肢背側(cè)荷瘤部位放射性濃聚灶高于心血池本底,隨時間延長逐漸遞增;腫瘤部位和心血池本底放射性比值隨時間遞增。荷結(jié)腸癌動物Tyr- GX1組也自8 h開始實(shí)驗(yàn)動物右后肢背側(cè)荷瘤部位放射性濃聚灶高于心血池本底,隨時間延長逐漸遞增,到18 h達(dá)到高峰后略有下降;腫瘤部位和心血池本底放射性比值始終高于1。結(jié)腸癌組T/NT數(shù)值持續(xù)高于胃癌組。兩種消化道腫瘤的濃聚及達(dá)到峰值時間各有特征。詳見表2。

    表2Tyr-GX1在胃癌與結(jié)腸癌成像中的T/NT水平

    時間點(diǎn)/hT/NT胃癌Tyr?GX1結(jié)腸癌Tyr?GX180.871.11120.811.22160.821.30241.211.26

    2.3 Tyr- GX1對腫瘤血管靶向性的情況

    分批處死動物,分別取血、心、肝、腎等不同器官組織樣本,稱重后測量實(shí)驗(yàn)動物體內(nèi)放射性計(jì)數(shù)(%ID·g-1)。計(jì)算公式:每克組織注射劑量分布(%ID·g-1)=各組織器官的放射性分布(cpm)/各組織器官的重量(g)/注射劑量。本研究中在荷胃癌和結(jié)腸癌組,示蹤劑在各器官均顯示出快速清除,其中腎臟的放射性較高,腫瘤組織的放射性也比較高,高于肌肉、腸、甲狀腺和胃。在肝臟、肺臟以及血液中早期放射性濃聚較高,隨時間延長逐漸下降,檢測結(jié)果提示甲狀腺的放射性含量在胃癌組和結(jié)腸癌組分別是0.08和0.10% ID·g-1。腫瘤組織的放射性在0.5 h分別為1.29和1.31% ID·g-1,24 h降為 0.55和0.42% ID·g-1,是肌肉組織的3~4倍。詳見表3。

    3 討 論

    放射性標(biāo)記短肽成像的相關(guān)研究是近年來興起的一門新的分支學(xué)科,為分子生物學(xué)與醫(yī)學(xué)影像學(xué)結(jié)合的學(xué)科,更先進(jìn)的造影劑增強(qiáng)劑不斷出現(xiàn),更先進(jìn)的成像儀器設(shè)備不斷發(fā)展,都推動了這個學(xué)科的發(fā)展,其中放射性核素成像就是一個方面,該領(lǐng)域主要關(guān)注腫瘤等疾病的先進(jìn)診斷、監(jiān)測和療效評估方法[8]。目前核素標(biāo)記抗體或者短肽已經(jīng)成功地在多種腫瘤的顯影診斷或治療領(lǐng)域中得到了應(yīng)用,因?yàn)椴煌怂鼐哂懈髯元?dú)特的理化性質(zhì),此外它們的獲得難易程度也不盡相同,加之價格等因素,目前臨床中應(yīng)用的核素包括18F、99Tcm還有131I等等[9]。

    表3 Tyr- GX1在荷人源胃癌與結(jié)腸癌移植瘤動物體內(nèi)生物學(xué)分布特征 %ID·g-1

    消化道腫瘤在內(nèi)的大多數(shù)惡性腫瘤在其生長以及轉(zhuǎn)移等過程中會需要依賴新生血管的生成,新生的腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞在其細(xì)胞膜上存在的受體分子表達(dá)往往出現(xiàn)異常狀態(tài),科學(xué)家們則正是利用了這些腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)的特異性,不斷在開發(fā)血管靶向治療的新方法,比如很多已經(jīng)應(yīng)用于臨床治療的腫瘤血管抑制療法、放射性靶向治療等[10]。GX1短肽是一種新近篩選開發(fā)出的環(huán)狀小肽,其氨基酸序列為CGNSNPKSC,大量的研究結(jié)果提示GX1在體內(nèi)外都具有腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞靶向性,不失為一種新的腫瘤血管標(biāo)記配體,可以聯(lián)合其他抗腫瘤藥物在腫瘤的抗血管生成治療領(lǐng)域大展身手[11]。然而不同類型的腫瘤細(xì)胞表面及新生血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)整合素受體的水平有很大差異,導(dǎo)致其對GX1短肽的攝取率也存在差異[12]。為此,采用局部修飾、多聚體化或連接耦合劑等方法增加配體與受體的結(jié)合力、改善藥代動力學(xué),提高腫瘤的攝取率;對多肽的化學(xué)修飾,加快其在正常組織中代謝清除,降低肝臟攝取和提高T/NT的數(shù)值[13]。因此本研究即在GX1短肽的環(huán)狀二硫鍵外引入Tyr以后,對其進(jìn)行生物學(xué)活性以及腫瘤靶向性等進(jìn)行分析探討,并使用放射性核素標(biāo)記該修飾肽,進(jìn)一步對結(jié)腸癌或胃癌的實(shí)驗(yàn)動物體內(nèi)的生物學(xué)分布等情況進(jìn)行探索。

    本次研究結(jié)果提示,在荷胃癌和結(jié)腸癌組示蹤劑在各器官均快速清除,腎臟的放射性較高,腫瘤組織的放射性也比較高。在肝臟、肺臟以及血液中早期放射性濃聚較高,24 h時檢測結(jié)果提示甲狀腺的放射性含量在胃癌組和結(jié)腸癌組分別是0.08和0.10% ID·g-1,隨時間延長逐漸下降,提示標(biāo)記物具有良好的體內(nèi)穩(wěn)定性。同時研究結(jié)果中還發(fā)現(xiàn),腫瘤組織的放射性在0.5 h分別為1.29和1.31% ID·g-1,24 h降為0.55和0.42% ID·g-1,是肌肉組織的3~4倍。提示131I標(biāo)記Tyr- GX1具有活體內(nèi)腫瘤組織血管的靶向性?;铙w內(nèi)腫瘤血管具有一定的靶向性,即生物分子進(jìn)入人或動物體內(nèi)后會不可避免地與內(nèi)環(huán)境因素相關(guān)聯(lián),包括涉及到被相關(guān)酶類分解、出現(xiàn)特異性的代謝特征等,另外還能同體內(nèi)一些分子結(jié)合而改變其原有的生物學(xué)行為。因此良好的腫瘤血管導(dǎo)向性分子應(yīng)該以生物學(xué)穩(wěn)定性為基礎(chǔ),以確保其可以快速從血液中得以清除,減少對正常血管的結(jié)合,同時提高靶組織結(jié)合率,為相關(guān)靶向治療提供良好的基礎(chǔ)[14- 15]。

    總之,本研究提示131I標(biāo)記Tyr- GX1具有良好的體內(nèi)腫瘤血管靶向性,與腫瘤組織結(jié)合率較高,且兩種消化道腫瘤的濃聚及達(dá)到峰值時間各有特征。

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