乳腺癌術(shù)前外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞計數(shù)的臨床應(yīng)用價值研究

單海琳，邵清，蘇瑛，周斌，鄒潤龍

(東南大學(xué)附屬江陰市人民醫(yī)院 乳甲外科，江蘇 江陰 214400)

自1869年Ashworth[1]首次探查到循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)后，經(jīng)過多年的努力探索揭示了CTCs及CTCs微栓(CTM)在腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中扮演的重要角色。多項研究表明,CTCs不僅與腫瘤患者的生存預(yù)后密切相關(guān)，還在預(yù)測療效和預(yù)后方面發(fā)揮重要作用[2- 3]，CTCs檢測較穿刺或手術(shù)活檢等有創(chuàng)檢查的局限性及影像學(xué)檢查的滯后性[4- 5]能更有效、經(jīng)濟(jì)、及時地評估患者預(yù)后和監(jiān)測病情進(jìn)展。

本研究旨在應(yīng)用免疫磁珠陰性富集聯(lián)合熒光原位雜交法檢測乳腺癌患者術(shù)前CTCs，通過與臨床病理特征的相關(guān)性研究探討原發(fā)灶的CTCs作為早中期乳腺癌預(yù)后的一種潛在腫瘤分子標(biāo)志物的價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象

以2015年1月至2016年5月本院136例初發(fā)乳腺癌患者及60例良性乳腺結(jié)節(jié)患者為研究對象，取其術(shù)前1 d的外周血，排除接受新輔助化療及存在第二原發(fā)腫瘤的患者。年齡29～86歲，中位年齡51歲。術(shù)后按WHO腫瘤病理學(xué)及遺傳學(xué)分類(2004年)行病理組織學(xué)分類及病理分級，病理類型均為浸潤性導(dǎo)管癌，Ⅰ～Ⅲ期。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者簽署有關(guān)收集臨床及病理資料的知情同意書。

1.2 檢測方法

1.2.1 富集實驗 采用ACD抗凝真空抽取3.2 ml外周血，移至離心管，補充磷酸鹽緩沖液至45 ml,離心5 min，去上清至12 ml，加氯化銨緩沖液至45 ml混勻，室溫下以20 r·min-1離心8 min，棄上清至500 μl，混勻后加磷酸鹽緩沖液至5 ml。吸取150 μl·人-1磁微粒混懸液至2 ml EP管中，用磷酸鹽緩沖液清洗磁珠，每份加入150 μl磁微粒，35°～40°室溫?fù)u動20 min(100～120 r·min-1)。取50 ml離心管中加入3 ml磷酸鹽分離緩沖液，將所有含磁微粒液體輕輕疊加到頂層，1 ml磷酸鹽緩沖液清洗離心管管壁后亦轉(zhuǎn)移至上述頂層，移取最上2層，加磷酸鹽緩沖液至14 ml，顛倒混勻3次后離心，棄上清至300 μl，加入1 ml 磷酸鹽緩沖液，輕柔吹打5次重懸沉淀細(xì)胞。將標(biāo)本轉(zhuǎn)移至2 ml離心管中，靠于磁力架上2～3 min，將液體轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管中離心(2 070×g，3 min)，棄上清至100 μl，加入100 μl醇類固定液，輕柔吹打混勻10次以上，涂片至標(biāo)本框中干燥。

1.2.2 熒光原位雜交實驗 取醇類磷酸鹽固定液200～300 μl完全覆蓋標(biāo)本區(qū)域，室溫固定8 min。吸去固定液，放入預(yù)熱的2×SSC中靜置10 min，脫水，取10 μl探針加入標(biāo)本區(qū)，蓋片，封片。76 ℃變性5 min，37 ℃雜交1.5 h。43 ℃甲酰胺工作液中靜置3次,5 min·次-1。室溫下在染色缸Ⅰ、Ⅱ(2×SSC)中各靜置1次、5 min。

1.2.3 免疫熒光染色操作 按每人份20 μl CD45- AF594熒光抗體、180 μl 2%BSA溶液的比例配制抗體工作液，避光待用。0.2% BSA洗標(biāo)本區(qū)2次，每次300 μl，將配置好的抗體加至標(biāo)本區(qū)，室溫并避光孵育1 h。用0.2% BSA洗標(biāo)本區(qū)2次，吸凈殘留液體，取10 μl DAPI染液復(fù)染，蓋片。

1.2.4 結(jié)果判讀 任一探針信號點>2個，且無血源性白細(xì)胞表面抗原著色時計為一個陽性細(xì)胞；當(dāng)細(xì)胞有血源性白細(xì)胞表面抗原，或信號≤2個計為陰性細(xì)胞；Cut- off值=2個CTCs/3.75 ml血液。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，本資料數(shù)據(jù)為非正態(tài)分布，數(shù)據(jù)描述采用中位數(shù)及四分位數(shù)間距，多分類變量統(tǒng)計采用卡方檢驗。多因素分析采用Logistic回歸模型。雙側(cè)檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 乳腺癌患者與乳腺良性結(jié)節(jié)患者CTCs的檢測結(jié)果

136例乳腺癌患者外周血中CTCs陽性率為46.32%，60例乳腺良性結(jié)節(jié)均未檢出CTCs，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

2.2 CTCs與乳腺癌癌組臨床特征的關(guān)系

卡方檢驗分析表明，136例乳腺癌患者CTCs陽性率在年齡、腫瘤大小、分級、淋巴結(jié)分期、AJCC分期、ER、PR、Ki67狀態(tài)、分子分型表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。Her2陽性乳腺癌檢出率低于Her2陰性組(36.2%vs51.7%)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表1乳腺癌患者與乳腺良性結(jié)節(jié)患者CTCs的檢測結(jié)果

病理性質(zhì)nCTCs陰性/例CTCs陽性/例χ2值P值惡性136736340．9600．000良性60600

2.3 乳腺癌患者CTCs與其臨床病理特征的Logistic回歸分析

Logistic回歸結(jié)果表明，CTCs陽性水平與AJCC分期及Her2狀態(tài)具有相關(guān)性。

AJCC分期：OR=1.882，P=0.011；Her2狀態(tài)：OR=0.477，P=0.057。見表3。

表2乳腺癌患者CTCs與臨床病理特征的關(guān)系

病理特征nCTCs陰性/例CTCs陽性/例CTCs陽性率/%數(shù)據(jù)分布特征χ2值P值年齡<3532133．30(0，1)35～70127695946．50(0，2)≥7062350．01(0，4．5)0．5870．746腫瘤大小T184493541．70(0，2)T248232552．11(0，2．75)T341375．05．5(1．25，6．75)0．9530．621Grade分級Ⅰ42250．02(0，4．75)Ⅱ65353046．20(0，2)Ⅲ67363146．30(0，3)0．0070．997淋巴結(jié)分期pN073442939．70(0，1)pN133171648．40(0，4)pN21971263．21(0，5)pN3116654．55(0，6)1．1090．775AJCC分期Ⅰ48321633．30(0，1)Ⅱ57292849．10(0，2．5)Ⅲ31121961．32(0，6)1．8930．388ER狀態(tài)陰性54292546．30(0，2)陽性82443846．30(0，2．25)0．0000．998PR狀態(tài)陰性84473744．00(0，2)陽性52262650．05(0，2)0．1390．709Her2狀態(tài)陰性89434651．71(0，3)陽性47301736．20(0，1)2．9780．084Ki67狀態(tài)陰性31131858．11(0，3)陽性105604542．90(0，2)2．2260．136分子分型LuminalA24111354．21(0，3．75)LuminalB54312342．60(0，2)Her2陽性26151142．30(0，2．252)三陰性32161650．05(0，2)1．2380．744

表3乳腺癌CTCs與病理特征的Logistic回歸分析納入模型的變量檢驗結(jié)果

BS．E．WalddfSig．Exp(B)95．0%CIforEXP(B)LowerUpperStep1AJCC分期0．5560．2405．56510．0181．7621．1012．820Constant-1．1870．4816．08310．0140．305Step2Her2-0．7400．3893．63010．0570．4770．2231．021AJCC分期0．6320．2476．53310．0111．8821．1593．056Constant-0．3230．6520．24610．6200．724

3 討 論

CTCs是自發(fā)或因診療操作由原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶釋放進(jìn)入外周血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，是惡性腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要原因。多項分析顯示CTCs是腫瘤患者PFS 和OS 的獨立預(yù)測指標(biāo)[6- 7]，既往研究肯定了CTCs在評判轉(zhuǎn)移性乳腺癌預(yù)后中的作用，治療后的CTCs數(shù)量也是影響患者生存的獨立預(yù)測因子。

以往CTCs在乳腺癌中的研究多集中在晚期，這是由于晚期腫瘤負(fù)荷大及多發(fā)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶形成，較早期患者易捕獲。隨著細(xì)胞富集技術(shù)、免疫學(xué)技術(shù)在CTCs檢測中的應(yīng)用，提高了檢測的敏感性和特異性[8]，如將間質(zhì)特異性抗原納入檢測系統(tǒng)后，靈敏度和特異度較之Cellsearch分別由47%和83%提升為85%和94%，使得在早期乳腺癌中檢測CTCs成為可能。近年免疫磁珠陰性富集法對外周血CTCs具有更高效的回收率，其優(yōu)點是去除外周血腫大部分白細(xì)胞，不受腫瘤細(xì)胞表達(dá)上皮抗原量的影響。根據(jù)該原理，我們采用免疫磁珠陰性富集聯(lián)合熒光免疫化學(xué)染色法檢測其在Ⅰ～Ⅲ期乳腺癌病例中的表達(dá)。

乳腺癌組檢出CTCs總陽性率為46.32%，乳腺良性結(jié)節(jié)組陽性率為0(P<0.01)，特異性100%，與蔡清清等[9]報道接近。既往較多研究報道CTCs和乳腺癌病理特征缺乏相關(guān)性[10]，如Lang等[11]認(rèn)為，Her2狀態(tài)是唯一與CTCs有關(guān)的腫瘤特征；Ferro等[12]認(rèn)為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小、ER陽性的腫瘤更易檢出CTCs;國內(nèi)原曉燕[13]認(rèn)為腫瘤直徑是CTCs陽性的獨立影響因素;李蕾等[14]認(rèn)為轉(zhuǎn)移性乳腺癌CTCs水平與組織學(xué)Her2狀態(tài)及轉(zhuǎn)移灶數(shù)目具有相關(guān)性，對早期患者進(jìn)行CTCs檢測可能對腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移具有預(yù)測作用。本研究卡方檢驗分析表明CTCs 陽性率在Her2狀態(tài)有微弱差異(P=0.084)，而與其它病理特征缺乏相關(guān)性。Logistic回歸結(jié)果表明CTCs陽性水平與乳腺癌AJCC分期具有相關(guān)性(P<0.01)，分期越晚CTCs檢出率越高，提示CTCs是腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的早期事件，這在有關(guān)文獻(xiàn)中也有證實[15- 16]。回歸分析也表明CTCs陽性水平與原發(fā)灶Her2狀態(tài)顯示出微弱的負(fù)相關(guān)性，Her2陰性者有更高的CTCs表達(dá)，這與卡方檢驗的結(jié)果一致，但該結(jié)果是否具有現(xiàn)實臨床意義有待進(jìn)一步研究，因為這與有些研究得出的結(jié)論不盡相同。有學(xué)者推測腫瘤細(xì)胞可能是間歇性成群釋放,使單點檢測值低于實際表達(dá)情況,致CTCs陽性檢出率仍有限，建議連續(xù)多次取樣或加大樣本量可能會提高檢出率；還有報道在腫瘤原發(fā)灶與CTCs中檢測Her2狀態(tài)不符合率達(dá)14%～48%，原因是腫瘤在脫落、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中CTCs 可獲得Her2基因的擴(kuò)增，建議檢測CTCs中Her2水平顯得更有意義，對于那些原發(fā)灶Her2陰性而CTCs Her2陽性的患者應(yīng)用靶向治療仍然可能有效；另外還需考慮到不同檢測方法、每個患者抽取的外周血容積不盡相同、標(biāo)準(zhǔn)化程序上的不同、陽性界定標(biāo)準(zhǔn)不同等原因都可能造成上述結(jié)論的差異。

2017年AJCC第8版乳腺癌分期系統(tǒng)中作為Ⅱ級證據(jù)提出，早期乳腺癌CTCs≥1個，晚期乳腺癌CTCs≥5個時提示預(yù)后不良。本研究僅初步探討了早中期乳腺癌患者CTCs與臨床病理特征之間的關(guān)系，提示術(shù)前檢測對病情評估有一定的臨床應(yīng)用價值。下一步應(yīng)追蹤早中期患者治療后的CTCs數(shù)量變化及進(jìn)行長期隨訪綜合治療后相關(guān)性和判斷預(yù)后的臨床價值研究；隨著捕獲技術(shù)的不斷進(jìn)步，研究關(guān)注的焦點也應(yīng)從單純CTCs計數(shù)轉(zhuǎn)移到對CTCs表型及分子特征的探討，為制訂個體化治療方案提供依據(jù)。

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