結(jié)腸癌差異DNA甲基化位點(diǎn)初篩及糞便樣本細(xì)胞中RUNX3基因的異常甲基化譜構(gòu)建

吳鵬，吳平平，馬常蘭，施風(fēng)

(1.江蘇建康職業(yè)學(xué)院 臨床與護(hù)理學(xué)院，江蘇 南京 210029； 2.江蘇省腫瘤醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，江蘇 南京 210009)

我國(guó)結(jié)腸癌的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)，是威脅國(guó)人健康的重大疾病[1- 2]。腸鏡侵入檢查是目前最主要的檢查方法之一，但臨床上常會(huì)碰到許多問(wèn)題，比如取材時(shí)組織損傷或組織量少難以做出正確的預(yù)后判斷；電子計(jì)算機(jī)體層攝影(CT)等影像學(xué)檢查因經(jīng)濟(jì)或造影劑毒性而限制了使用；外周血活檢也存在患者理解不足、畏于抽血而致依從性差等[3]。糞便中含有來(lái)自腸道腫瘤的脫落細(xì)胞，具有一定的特異性，是結(jié)直腸癌預(yù)后評(píng)估理想的無(wú)創(chuàng)檢測(cè)素材，且患者接受程度高，依從性好，其將推動(dòng)結(jié)直腸癌預(yù)后研究的重大變革，具有重要的科研和應(yīng)用價(jià)值[4]。

表觀遺傳機(jī)制在基因表達(dá)調(diào)控上提供了一種高層次的調(diào)控模式，被認(rèn)為是控制基因活動(dòng)的“開(kāi)關(guān)”，已成為后基因組時(shí)代研究的熱點(diǎn)[5- 6]。脫氧核糖核酸(DNA)甲基化是目前發(fā)現(xiàn)的最主要的一種表觀遺傳修飾形式，其在結(jié)腸癌等多種腫瘤的研究中有了長(zhǎng)足的進(jìn)展[7]。我們前期在85例結(jié)直腸癌及45例腸道良性病變患者血清標(biāo)本中，通過(guò)甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(MSP)檢測(cè)基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化，發(fā)現(xiàn)DLC1、p16和RUNX3基因甲基化比例分別為42.4%、44.7%和34.1%，均顯著高于良性病變組(P<0.01)，三者聯(lián)合檢測(cè)可顯著提高結(jié)直腸癌檢出率，并且特異性未降低[8]。甲基化的DNA片段可以在糞便中檢測(cè)到，這種非侵襲性的檢查方法使甲基化檢測(cè)有了更好的應(yīng)用前景，可成為結(jié)腸癌預(yù)后評(píng)估新突破口[9- 10]。

作者將系統(tǒng)性研究糞便樣本細(xì)胞中異常甲基化譜，尤其是RUNX3基因的甲基化研究，有望獲得一組能應(yīng)用于臨床的新型分子標(biāo)記，為結(jié)腸癌的診斷、治療及預(yù)后提供有力的支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇結(jié)腸癌患者的癌組織和癌旁組織的存檔蠟塊，用于差異DNA甲基化位點(diǎn)初篩。收集江蘇省腫瘤醫(yī)院2015年1月至2015年12月間100例結(jié)腸癌患者新鮮糞便，100例健康體檢者為健康對(duì)照組。所有病例均有完整的臨床及隨訪資料，用于異常甲基化譜的構(gòu)建。

1.2 樣本處理

對(duì)于癌組織和癌旁組織的存檔蠟塊用激光捕獲顯微切割技術(shù)收集細(xì)胞[11]，經(jīng)研磨、勻漿后提取基因組DNA。對(duì)于新鮮糞便樣本，使用Qiagen QIAmp? DNA Stool Mini Kit按照產(chǎn)品操作規(guī)程來(lái)分離提取DNA。樣本的分組情況見(jiàn)表1。

表1樣本的分組情況

樣本分組實(shí)驗(yàn)編號(hào)樣本例數(shù)(男∶女)/例結(jié)腸癌組織T63∶3結(jié)腸癌旁組織N63∶3結(jié)腸癌患者新鮮糞便S?T10059∶41正常人新鮮糞便S?N10055∶45

1.3 差異DNA甲基化位點(diǎn)初篩

針對(duì)RUNX3基因，經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾、擴(kuò)增、斷裂、沉淀、重懸等操作，在Illumina Infinium Methylation EPIC BeadChip(850 k)甲基化芯片上進(jìn)行雜交、洗滌、延伸、染色、掃描等過(guò)程獲得全基因組甲基化譜，通過(guò)生物信息學(xué)初步篩選差異性甲基化位點(diǎn)。

1.4 MSP方法

RUNX3啟動(dòng)子區(qū)的甲基化引物(M)和未甲基化引物(U)序列如表2所示，以亞硫酸氫鹽修飾后的基因組DNA為模板，進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR反應(yīng))。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)含有EB的2%瓊脂糖凝膠電泳、紫外觀察、凝膠成像系統(tǒng)掃描成像后拍照，檢測(cè)擴(kuò)增效果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

在原始數(shù)據(jù)扣除背景后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，然后計(jì)算甲基化程度水平(Beta值)，同時(shí)使用Beta混合物分位數(shù)擴(kuò)張(BMIQ)的方法進(jìn)行Beta值的標(biāo)準(zhǔn)化處理[12]，作為衡量甲基化程度的指標(biāo)，同時(shí)采用層次聚類(lèi)算法對(duì)差異甲基化位點(diǎn)進(jìn)行聚類(lèi)分析。進(jìn)一步進(jìn)行甲基化位置變化(methylation variable position)分析，即針對(duì)差異化甲基化位點(diǎn)最近鄰基因進(jìn)行基因本體(gene ontology,GO)功能富集分析和京都基因與基因組(KEGG)功能富集分析。對(duì)于MSP結(jié)果，使用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2RUNX3啟動(dòng)子區(qū)MSP引物序列及反應(yīng)條件

引物名稱引物序列溫度/℃大小/bpM58115 F5′?ATAATAGCGGTCGTTAGGGCGTCG?3′ R5′?GCTTCTACTTTCCCGTTCTCGCG?3′U57115 F5′?ATAATAGTGGTTGTTAGGGTGTTG?3′ R5′?ACTTCTACTTTCCCACTTCTCACA?3′

2 結(jié) 果

2.1 差異DNA甲基化位點(diǎn)分析

2.1.1 甲基化差異分析 使用Beta值的樣本密度箱形圖來(lái)評(píng)估甲基化芯片數(shù)據(jù)的整體分布。在箱形圖(圖1)中，癌組織(T)和癌旁組織(N)兩組之間最大值、最小值及中位數(shù)顯示兩者之間正態(tài)分布差異不明顯，適合聚類(lèi)芯片分析。

圖1標(biāo)準(zhǔn)化處理后Beta值的箱式圖

熱圖結(jié)果顯示T和N兩組之間甲基化位點(diǎn)差異性排布，顏色越深代表甲基化位點(diǎn)差異越明顯，顏色越淺代表甲基化位點(diǎn)差異越不明顯，因此T組中存在較多高甲基化位點(diǎn)，而N組中存在較多低甲基化位點(diǎn)(圖2)。進(jìn)一步通過(guò)主成分分析(PCA)發(fā)現(xiàn)T和N兩組之間呈現(xiàn)組內(nèi)顯著富集，表明檢測(cè)結(jié)果無(wú)交叉影響，結(jié)果客觀可靠(圖3)。

圖2差異甲基化位點(diǎn)的熱圖

圖3差異甲基化位點(diǎn)的PCA分析

甲基化位點(diǎn)的差異性可以使用火山圖(圖4)來(lái)表示，其中紅點(diǎn)富集區(qū)域?yàn)門(mén)和N兩組之間甲基化位點(diǎn)呈顯著性差異(P<0.01)，偏右區(qū)域?yàn)榕cN組相比甲基化位點(diǎn)水平升高，偏左區(qū)域?yàn)榕cN組相比甲基化位點(diǎn)水平降低；黑點(diǎn)富集區(qū)域?yàn)門(mén)和N兩組之間甲基化位點(diǎn)呈不顯著性差異(P>0.01)。

2.1.2 差異甲基化位點(diǎn)功能分析 GO功能富集分析結(jié)果表明，共有145個(gè)差異甲基化基因的功能類(lèi)別(FDR<0.05)，涵蓋了3 155個(gè)基因，其中生物過(guò)程、細(xì)胞組成和分子功能分別含有的基因功能類(lèi)別為102、22和21個(gè)。KEGG功能富集分析結(jié)果表明共有28個(gè)差異甲基化基因的功能類(lèi)別(P<0.05)，涵蓋了697個(gè)基因。經(jīng)過(guò)上述分析，共篩選出RUNX3等10個(gè)差異顯著的DNA甲基化基因位點(diǎn)。

圖4T和N兩組甲基化位點(diǎn)差異程度的火山圖紅色虛線表示P=0.01

2.2 MSP檢測(cè)RUNX3啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)

根據(jù)甲基化芯片結(jié)果選取RUNX3啟動(dòng)子甲基化位點(diǎn)，應(yīng)用MSP做進(jìn)一步組織樣本驗(yàn)證及新鮮糞便樣本的檢測(cè)。使用MF、MR和UF、UR兩對(duì)引物擴(kuò)增經(jīng)亞硫酸鹽修飾后的DNA，若只有甲基化的引物能擴(kuò)展出條帶則是完全甲基化的；若只有未甲基化的引物能擴(kuò)增出條帶則是完全未甲基化；若兩對(duì)引物均能擴(kuò)增出條帶則稱為半甲基化，也判斷為甲基化。

T和N兩組的擴(kuò)增條帶如圖5和表3所示，檢測(cè)T樣本6例，其中5例為甲基化，1例為非甲基化，甲基化率為83.3%；N中1例為甲基化，5例為非甲基化，甲基化率為16.7%，經(jīng)卡方檢驗(yàn)兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。新鮮糞便樣本的擴(kuò)增條帶如圖6和表3所示，對(duì)于結(jié)腸癌患者(S- T)RUNX3啟動(dòng)子的甲基化率為45.5%，而正常人(S- N)的甲基化率只有18.2%，經(jīng)卡方檢驗(yàn)兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

圖5兩對(duì)引物在T(A)和N(B)兩組中擴(kuò)展出條帶的電泳圖

表3結(jié)腸癌和正常樣本的甲基化率

樣本分組RUNX3(+)(-)甲基化率/%χ2值P值T組5183．35．330．02N組1516．7S?T組445644．015．80<0．001S?N組188218．0

圖6兩對(duì)引物在結(jié)腸癌患者(A)和正常人(B)糞便樣本中擴(kuò)展出條帶的電泳圖

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)T組中存在較多高甲基化位點(diǎn)，而N組中存在較多低甲基化位點(diǎn)。GO功能富集分析結(jié)果表明共有145個(gè)差異甲基化基因的功能類(lèi)別(FDR<0.05)，涵蓋了3 155個(gè)基因。生物過(guò)程部分包含的基因功能類(lèi)別最多。本次研究表明，差異甲基化的功能基因主要集中在細(xì)胞膜、受體活性以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移等過(guò)程密切相關(guān)。與此同時(shí)，KEGG功能富集分析結(jié)果表明這些基因主要參與消化液分泌、神經(jīng)突觸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、阿米巴樣運(yùn)動(dòng)等與結(jié)腸癌高度相關(guān)的分子事件。

經(jīng)過(guò)差異甲基化芯片分析，共篩選出RUNX3等10個(gè)差異顯著的DNA甲基化基因位點(diǎn)。RUNX3基因位于人類(lèi)染色體1q36.1，廣泛表達(dá)于消化道上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞中。RUNX3基因是研究比較多的抑癌基因，其編碼的RUNX3蛋白是TGF- β介導(dǎo)的抑癌途徑的重要組分，與腫瘤的發(fā)生等過(guò)程密切相關(guān)[13]。RUNX3基因的甲基化則會(huì)抑制RUNX3基因的表達(dá)，進(jìn)而影響TGF- β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。MSP結(jié)果表明，T RUNX3基因的甲基化水平明顯高于N，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，進(jìn)而驗(yàn)證了差異DNA甲基化位點(diǎn)分析的結(jié)果，說(shuō)明RUNX3基因甲基化檢測(cè)對(duì)結(jié)腸癌患者具有重要的意義。新鮮糞便樣本結(jié)果中結(jié)腸癌患者RUNX3啟動(dòng)子的甲基化率明顯大于正常人，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步證明了實(shí)驗(yàn)的結(jié)論。

本研究篩選出RUNX3等10個(gè)差異顯著的DNA甲基化基因位點(diǎn)，進(jìn)一步分析了T/N、S- T/S- N新鮮糞便樣本細(xì)胞中RUNX3甲基化水平，結(jié)果提示RUNX3啟動(dòng)子的甲基化可以用于結(jié)腸癌的診斷以及療效評(píng)價(jià)等方面。

[參考文獻(xiàn)]

[1] CHEN W,ZHENG R,BAADE P D,et al.Cancer statistics in China,2015[J].CA:a Cancer Journal for Clinicians,2016,66(2):115- 132.

[2] 李道娟,李倩,賀宇彤.結(jié)直腸癌流行病學(xué)趨勢(shì)[J].腫瘤防治研究,2015(3):305- 310.

[3] CLARKE E,WOOLSON K,SAUNDERS M,et al.PWE- 100 missed rates of colorectal cancer- diagnostic limitations[J].Gut,2016,65(Suppl 1):A187- A188.

[4] BAILEY J R,AGGARWAL A,IMPERIALE T F.Colorectal cancer screening:stool DNA and other noninvasive modalities[J].Gut and Liver,2016,10(2):204.

[5] EASWARAN H,TSAI H C,BAYLIN S B.Cancer epigenetics:tumor heterogeneity,plasticity of stem- like states,and drug resistance[J].Molecular Cell,2014,54(5):716- 727.

[6] 劇宏燕,柴秀坤,白文元.結(jié)直腸癌的表觀遺傳學(xué)[J].世界華人消化雜志,2014,22(15):2128- 2133.

[7] 李莉,魯英,楊曉燕,等.新疆乳腺癌患者外周血中 p16 基因甲基化的檢測(cè)意義[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2014,33(6):691- 696.

[8] 鄒繼紅,吳平平,湯日寧,等.結(jié)直腸癌血清中 DLC1,p16 和 RUNX3 基因甲基化檢測(cè)的臨床意義[J].江蘇醫(yī)藥,2011,37(24):2938- 2940.

[9] 王裴,張明鑫,張超,等.糞便 DNA 甲基化檢測(cè)在結(jié)直腸癌早期診斷中的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2015,23(6):874- 880.

[10] 周婷婷,丁家華.異基因造血干細(xì)胞移植治療骨髓增生異常綜合征的時(shí)機(jī)選擇[J].現(xiàn)代醫(yī)學(xué),2013,41(4):279- 281.

[11] JENSEN E.Laser- capture microdissection[J].The Anatomical Record,2013,296(11):1683- 1687.

[12] TESCHENDORFF A E,MARABITA F,LECHNER M,et al.A beta- mixture quantile normalization method for correcting probe design bias in illumina infinium 450 k DNA methylation data[J].Bioinformatics,2013,29(2):189- 196.

[13] MU W,WANG J,NIU Q,et al.Clinical significance and association of RUNX3 hypermethylation frequency with colorectal cancer:a meta- analysis[J].OncoTargets and Therapy,2014,7:1237- 1245.