炎癥小體蛋白AIM2負調(diào)節(jié)抗RNA病毒反應發(fā)生

李健，劉雪，楊碩

(南京醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院，江蘇 南京 211166)

在清除病原感染過程中一類被稱為炎癥小體(inflammasome)的固有免疫細胞多蛋白復合體發(fā)揮了重要的作用。炎癥小體通過其核心蛋白NLR(NOD- like receptor)或PYHIN(Pyrin and HIN domain- containing)感應細菌和病毒等病原刺激，在有或沒有接頭蛋白ASC(apoptosis- associated speck- like protein containing a CARD)的幫助下，激活蛋白酶Caspase- 1和Caspase- 11(人中Caspase- 4/5)，然后促進炎癥因子IL- 1β和IL- 18前體剪切成熟和釋放，誘導炎癥反應來激活固有免疫防御和適應免疫應答的發(fā)生[1]。此外最近還發(fā)現(xiàn)炎癥小體能剪切激活GSDMD蛋白，隨后GSDMD蛋白N端寡聚化與胞膜結(jié)合來誘導焦亡(pyroptosis)形成，促進了炎癥反應發(fā)生以及胞內(nèi)寄生病原釋放和清除[2- 3]。炎癥小體不僅可識別病原還可感知體內(nèi)危險信號，參與了機體慢性炎癥反應疾病的發(fā)生。根據(jù)炎癥小體組成和結(jié)構(gòu)，當前研究較多的炎癥小體主要包括NLRP3、NLRC4、NLRP1和AIM2等，其中AIM2炎癥小體核心蛋白AIM2的C端包含有HIN- 200結(jié)構(gòu)域，能識別病毒雙鏈DNA來激活炎癥小體組裝[4]。已有報道病毒感染會引起線粒體壓力誘導的線粒體活性氧(mROS)產(chǎn)生，進而激活NLRP3炎癥小體引起炎癥反應，參與抗病毒反應[5]。雖然病毒激活炎癥小體誘導炎癥反應產(chǎn)生已被廣泛報道，但炎癥小體本身是否能直接調(diào)控抗病毒通路目前還是了解不多。最近Immunity上有報道，炎癥小體ASC、Caspase- 1/11和AIM2分子可通過Caspase- 1/11激活來切割DNA病毒識別受體cGAS，進而負調(diào)節(jié)DNA病毒誘導的抗病毒反應，維持抗病毒炎癥反應的平衡[6]。由于固有免疫抗病毒作用通路復雜，是否炎癥小體蛋白在抗病毒反應中還存在其它調(diào)節(jié)作用，以及是否能調(diào)節(jié)抗RNA病毒反應仍需深入研究。

在本研究中，我們通過基因敲除方法發(fā)現(xiàn)AIM2分子可以負調(diào)節(jié)RNA病毒誘導的抗病毒反應。相對于野生型巨噬細胞，AIM2基因敲除細胞在RNA病毒感染后有更少的病毒存在，與此相一致，抗病毒效應分子在AIM2敲除細胞中表達明顯升高。機制上我們發(fā)現(xiàn)AIM2基因敲除可促進RNA抗病毒通路下游TBK1和IRF3的激活。因此，本研究豐富了我們對炎癥小體在抗病毒通路調(diào)節(jié)功能的認識，并為深入理解影響抗病毒反應的調(diào)控機制提供了線索。

1 材料和方法

1.1 材料

AIM2敲除小鼠由Genentech公司提供，VSV- GFP(vesicular stomatitis virus carrying green fluorescent protein)/HSV- GFP(herpes simplex virus carrying green fluorescent protein)病毒、Vero細胞由廣州醫(yī)科大學免疫所贈送，Sendai virus(SEV)購自Charles river公司，Poly(I∶C)購自Invivogen公司，甲基纖維化素、結(jié)晶紫由Sigma公司購得，DMEM和1640培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗、胰酶由GIBCO公司購得，Trizol試劑盒由Invitrogen公司購得，IFNβ Elisa試劑盒由作者所在實驗室自己制備，IL- 6 ELISA試劑盒于R&D公司購得。

1.2 方法

1.2.1 病毒的制備與滴度檢測

1.2.1.1 病毒的制備 按常規(guī)方法培養(yǎng)Vero細胞，當細胞匯合度達80%～90%時制備病毒液。將T175培養(yǎng)瓶中10%FBS DMEM培養(yǎng)基吸干。加入8 ml 2%FBS DMEM培養(yǎng)基，HSV以感染復數(shù)(multiplicity of infection, MOI)0.01感染細胞，VSV以MOI 0.4感染細胞，置于培養(yǎng)箱中，2 h后補充培養(yǎng)基至20 ml，VSV12～18 h后、HSV24～36 h后細胞變性80%，細胞刮刮取細胞收集到離心管，3 000 r·min-1、4 ℃離心10 min，收集上清并加入適量培養(yǎng)基重懸細胞，將細胞于-80 ℃/4 ℃反復凍融3次讓病毒析出，再3 000 r·min-1、4 ℃離心10 min，收集上清，和第1次收集上清混勻，分裝后-80 ℃保存。

1.2.1.2 病毒的滴度檢測 6孔板，每孔鋪3×105Vero細胞，過夜培養(yǎng)，細胞匯合度90%左右時進行滴度測定。將病毒梯度稀釋，6孔板吸凈培養(yǎng)基，加入不同梯度稀釋的病毒液(一般為10-5、10-6、10-7)，每個梯度做兩個復孔，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h，期間每15 min晃動1次，吸凈病毒稀釋液，隨后加入4 ml 1.2%甲基纖維化素與2%FBS DMEM培養(yǎng)基混液，培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～3 d，吸掉甲基纖維化素液，加入0.5 ml·孔-14%多聚甲醛固定15 min，棄掉多聚甲醛加入0.5 ml·孔-1結(jié)晶紫染色1 h，洗脫結(jié)晶紫，倒置晾干，空斑計數(shù)，計算公式：病毒滴度PFU/ml=平均空斑數(shù)×稀釋倍數(shù)。

1.2.2 原代小鼠骨髓巨噬細胞(BMDMs)分離與培養(yǎng)

處死的小鼠用75%酒精浸泡2 min，晾干酒精后后肢脫毛至足，剪下后肢，于培養(yǎng)皿中剔除肌肉，沿大轉(zhuǎn)子剪下股骨，用PBS清洗兩遍，再用1ml注射器取1640培養(yǎng)基注入骨髓腔沖洗2～3次，收集細胞，1 000 r·min-1離心5 min，再用10%L929上清的1640培養(yǎng)基重懸細胞并于T75培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，隔天換液，至第5天貼壁細胞為BMDMs，胰酶消化，1.5106孔-1種板，培養(yǎng)箱過夜，病毒刺激檢測mRNA或取細胞上清ELISA檢測蛋白表達。

1.2.3 分離mRNA，逆轉(zhuǎn)錄和實時定量PCR分析

Trizol試劑盒提取細胞總RNA，取500 ng RNA逆轉(zhuǎn)錄，定量PCR檢測基因表達，詳細實驗步驟見試劑盒。引物序列如下:Ifnβ sense 5- CCCTATGGAGATGACGGAGA- 3, antisense 5- CCCAGTGCTGGAGAAATTGT- 3;Ifnα sense 5- CTTTCCTCATGATCCTGGTAATGAT- 3,antisense 5- AATCCAAAATCCTTCCTGTCCTTC- 3;Cxcl10 sense 5- AAGTGCTGCCGTCATTTTCTG- 3,antisense 5- TTCCCTATGGCCCTCATTCTC- 3;Il6 sense 5- CTTGGGACTGATGCTGGTGAC- 3,antisense 5- GCCATTGCACAACTCTTTTCTC- 3。

1.2.4 ELISA檢測蛋白表達

ELISA檢測細胞分泌IFNβ表達,PBS緩沖液稀釋IFNβ一抗(Santa Cruz sc- 57201)，100 μl·孔-1鋪板過夜，洗板3次，加入100 μl樣品，常溫孵育2 h，洗板3次，加入Detection抗體(R&D 32400- 1)，100 μl·孔-1，常溫2 h，洗板6次，加入HRP(R&D)，100 μl·孔-1常溫2 h，洗板9次，100 μl·孔-1TMB(Moss substrates)顯色液顯色，10%硫酸終止，酶標儀讀取吸光值。IL- 6 ELISA檢測詳見試劑盒說明書(R&D 128967)。

1.2.5 流式細胞儀檢測病毒綠色熒光蛋白(GFP)

VSV- GFP或HSV- GFP以MOI1感染12孔板中BMDM，24 h后刮取細胞，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，1 ml PBS緩沖液重懸細胞，流式細胞儀檢測病毒GFP表達，數(shù)據(jù)用Flowjo軟件分析。

1.2.6 Western blot檢測

病毒刺激3、6 h后的BMDM細胞加入細胞裂解液提取蛋白，加入4倍上樣緩沖液加熱變性，9%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，后將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，用抗目的蛋白一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，5 min·次-1，二抗(Licor)室溫孵育1 h，TBST緩沖液洗膜3次，5 min·次-1，Odyssey掃膜。使用一抗包括：p- TBK1(CST 5483S)、p- IRF3(CST 4947)、AIM2(CST 13095S)、p- IKBα(CST 28595)和β- ACTIN(SIGMA A5441)。

1.3 統(tǒng)計學處理

SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，組間比較采用Two- way ANOVA unpairedt檢驗，*為P<0.05，**為P<0.01，***為P<0.001。

2 結(jié) 果

2.1 AIM2基因缺失抑制RNA病毒在細胞中的復制

為探究AIM2在抗RNA病毒反應中的角色，在WT和AIM2-/-BMDMs中，以MOI 1分別感染RNA病毒VSV- GFP和DNA病毒HSV- GFP 24 h后流式細胞儀檢測病毒GFP含量，對比WT BMDM，AIM2-/-BMDM中GFP明顯下降(圖1)，該結(jié)果說明AIM2不僅負調(diào)節(jié)DNA病毒也負調(diào)節(jié)RNA病毒清除。

WT和AIM2-/-小鼠BMDM病毒刺激24 h后，流式細胞儀檢測病毒報告基因蛋白GFP表達量，實驗重復2次

圖1AIM2基因缺失抑制RNA病毒在細胞中的復制

2.2 AIM2基因缺失促進抗病毒炎癥因子基因表達

在BMDMs中分別感染單股負鏈RNA病毒VSV、SEV、Poly(I∶C)以及DNA病毒HSV后，進行定量PCR檢測，對比WT BMDM，AIM2-/-BMDM細胞抗病毒炎癥因子mRNA表達水平均明顯上調(diào)(圖2)，該結(jié)果說明AIM2負調(diào)節(jié)了抗RNA病毒炎癥反應的發(fā)生。

定量PCR檢測WT和AIM2-/-BMDM在以MOI1感染VSV、HSV、SEV 12 h，1g·ml-1Poly(I∶C)刺激8 h后Ifnβ、Ifnα、Cxcl10和Il6的mRNA表達水平，實驗重復3次

圖2AIM2負調(diào)節(jié)抗RNA病毒炎癥因子基因表達

2.3 AIM2基因缺失促進抗病毒炎癥因子分泌

為進一步分析AIM2對抗病毒炎癥因子表達的影響，在BMDMs中分別感染VSV、SEV、Poly(I∶C)以及HSV后檢測培養(yǎng)基中炎癥因子。對比WT BMDM，AIM2-/-BMDM細胞培養(yǎng)基中抗病毒炎癥因子表達明顯上調(diào)(圖3)，該結(jié)果進一步表明AIM2負調(diào)節(jié)了抗RNA病毒炎癥因子產(chǎn)生。

2.4 AIM2基因缺失促進抗病毒信號通路表達

在BMDMs中分別感染VSV、SEV、HSV，Western blot檢測抗病毒信號通路蛋白表達。對比WT BMDM, AIM2-/-BMDM全細胞裂解中抗病毒信號通路蛋白p- IRF3、p- TBK1、p- IKBα的表達明顯上調(diào)(圖4)，該結(jié)果表明AIM2負調(diào)節(jié)抗RNA病毒信號通路。

3 討 論

炎癥小體是機體固有免疫系統(tǒng)應對病原感染的重要蛋白質(zhì)分子，但其在抗病毒反應中的角色目前了解不多。我們的研究表明，能與DNA核酸相結(jié)合的炎癥小體蛋白AIM2不僅能負調(diào)節(jié)抗DNA病毒通路，而且也可以抑制抗RNA病毒反應。AIM2敲除巨噬細胞相對于野生型細胞存在更強RNA病毒誘導的TBK1和IRF3激活，產(chǎn)生更多的抗病毒基因和Ⅰ型干擾素，因而擁有更強的RNA病毒清除能力。

ELISA檢測WT和AIM2-/-BMDM在以MOI1感染VSV、SEV、HSV以及1 μg·ml-1Poly(I∶C)感染18 h后細胞培養(yǎng)基中IFNβ、IL- 6的蛋白表達水平，實驗重復3次。

圖3AIM2負調(diào)節(jié)抗RNA病毒炎癥因子產(chǎn)生

Western blot檢測WT和AIM2-/-BMDM在以MOI1感染VSV、SEV、HSV 3、6 h后抗病毒信號通路IRF3、TBK1和IKBα磷酸化水平，實驗重復2次

圖4AIM2負調(diào)節(jié)抗RNA病毒信號通路蛋白表達

最近有報道AIM2、ASC以及Caspase- 1/11在DNA病毒刺激后通過Caspase- 1/11切割cGAS蛋白來抑制抗DNA病毒反應，因此我們的發(fā)現(xiàn)拓展了對炎癥小體調(diào)控抗病毒反應的認識。DNA結(jié)合炎癥小體為什么能調(diào)節(jié)抗RNA病毒反應，是本研究將要探究的科學問題。目前有報道AIM2可以通過DNA鏈結(jié)合DNA- PK激酶來抑制DNA- PK對AKT激酶的活化，而AKT可以正向調(diào)控炎癥通路NFkB以及抗病毒通路TBK1的活性[7- 8]。因此AIM2可能不僅通過炎癥小體激活切割cGAS來負調(diào)節(jié)抗DNA病毒反應，也有可能采用其它機制調(diào)節(jié)抗病毒反應，即AIM2缺失釋放了對DNA- PK激酶的抑制，進而激活AKT通路，AKT信號的激活又促進抗病毒反應的發(fā)生，在接下來研究中我們將對此假說作進一步探索。由于本研究主要是在小鼠細胞上進行，接下來工作中我們也將在人細胞以及動物體內(nèi)水平來進一步研究AIM2在抗RNA病毒反應中的作用和機制。

AIM2負調(diào)節(jié)抗病毒反應可避免過度激活導致的自身免疫病發(fā)生[9]，我們的研究結(jié)果也表明AIM2可能是機體抵御自身免疫炎癥疾病的重要效應分子。此外AIM2負調(diào)節(jié)抗RNA病毒通路也體現(xiàn)了炎癥小體蛋白在機體固有免疫防御中作用的多樣性，突出了炎癥小體蛋白在固有免疫防御反應中的“非炎癥小體功能”[10]。綜上所述，本研究增加了對炎癥小體抗病毒調(diào)節(jié)作用的認識，并為深入理解固有免疫系統(tǒng)抗病毒機制提供了線索。

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