組蛋白去乙?；?1的表達在霍奇金淋巴瘤中的臨床病理意義初探

黃仁宏，胡麗娜，王筱媛，曹婷，喬振東，閔志均，余明華，劉曉健

(復旦大學附屬浦東醫(yī)院 科研與創(chuàng)新中心，上海 201399)

經典型霍奇金淋巴瘤(classical Hodgkin lymphoma，cHL)是起源于B淋巴細胞的惡性腫瘤，其腫瘤細胞稱為霍奇金- 李- 斯(Hodgkin- Reed- Steinberg, HRS)細胞。放化療一直是治療cHL的主要方法，雖然患者5年生存率超過85%，但25%左右的患者會復發(fā)或根本不會對治療產生反應[1- 2]，免疫檢測點抑制劑Nivolumab(Opdivo?)獲FDA批準用于病情復發(fā)或進展的cHL患者[3]，提高了cHL患者客觀緩解率，但完全緩解率不高，其毒副作用、耐藥形成等現(xiàn)象仍需進一步研究克服。組蛋白去乙?；敢种苿?histone deacetylases inhibitors，HDACIs)的開發(fā)和臨床研究取得了很大進展[4]，HDACIs不僅誘導HRS細胞凋亡，還可以幫助重新激活微環(huán)境的細胞免疫功能[5]，給在免疫治療的基礎上進一步提高療效、減少毒副作用帶來了希望。

鋅指依賴型HDAC共11種，為HDAC 1～11，對不同腫瘤如前列腺癌、胃癌、結腸癌、皮膚T細胞淋巴瘤和乳腺癌細胞的研究顯示，HDAC亞型的表達及其與各自臨床病理特征及預后有相關性，但這些研究的結果不一致。瑞士研究人員研究了283例cHL中HDAC表達，發(fā)現(xiàn)cHL HDAC 1、2和3表達特征性增高[6]，HDAC1表達低與較差的預后相關；有研究人員對cHL組織標本進行HDAC 1～11的研究，結果顯示22例中HDAC1、2、3、8和10陽性率為100%，僅對4例檢測了HDAC11的表達，結果均為陰性，該研究沒有涉及HDAC表達與預后的關系，考慮到目前沒有針對HDAC11表達的較大樣本的研究以及我國cHL和歐美患者存在流行病學和遺傳學不同[7]，我們通過免疫組化檢測HDAC11在cHL組織中的表達，并初步分析其與臨床病理的相關性。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對象 56例cHL標本來自2002年8月至2010年3月復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院病理科存檔的石蠟包埋標本，病理分型特征見表1。所有患者入院治療并簽署知情同意書，有完整存檔病歷和隨訪資料,其中男30例，女26例，年齡9～77歲，中位年齡34.5歲，大于45歲22例，大腫塊形成16例。56例均接受ABVD方案化療，14例接受輔助放療，此14例均為就診時影像學判定為大腫塊患者。

1.1.2 主要實驗試劑 兔抗人HDAC11(Y- 25)多克隆抗體為美國Santa Cruz Biotechnology, Inc.產品(克隆號sc- 130776)，工作濃度為1∶100；二抗(抗兔Envision- AP)及DAB均購自丹麥DAKO公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化 采用EnVision兩步法,標本蠟塊連續(xù)切片4 μm厚，73 ℃烤片20 min，62 ℃烤片2 h，脫蠟水化，置于EDTA抗原修復液加熱煮沸修復15 min；3%H2O210 min封閉內源性過氧化氫酶，PBS洗3次，每次5 min；滴加一抗，37 ℃ 2 h，PBS洗3次，每次5 min；滴加二抗，37 ℃ 30 min，PBS洗3次，每次5 min；DAB顯色、蘇木精復染，脫水干燥中性樹脂封片。以TBS作空白對照，已知陽性切片作陽性對照。

表1HDAC11在反應性增生淋巴結和cHL中的表達

Tab1HDAC11proteinexpressioninreactiveproliferativelymphnodesandinthepatientswithcHLHodgkinlymphoma

組織來源和病理分型nHDAC11的表達程度/例陰性弱陽性陽性高表達率/%χ2值P值cHL5614281425．013．0040．014結節(jié)硬化型28616621．4混合細胞型22412627．2淋巴細胞消減型2002100富于淋巴細胞型44000

1.2.2 結果判斷 由2名病理科專家獨立閱讀免疫組化切片和HE切片,明確病理類型和診斷,病理類型按WHO2008淋巴造血腫瘤分類法進行分類。以被觀察細胞核有棕黃色或棕褐色顆粒染色為陽性細胞，采用雙盲法隨機選取10個高倍(400倍)視野,每個高倍視野下計數(shù)10個腫瘤細胞。觀察陽性細胞所占的百分數(shù)及染色強度，對陽性細胞所占的百分數(shù)計分≤5%計0分、>5%～25%計1分、>25%～50%計2分、>50%～75%計3分、>75%計4分。細胞著色強度：不著色計0分、淡黃色計1分、棕黃色計2分、棕褐色計3分。累積0分為(-)，1～2分為(+)，3～4分為(++)，5～7分為(+++)。將0～2分定義為陰性，3～4分定義為弱陽性，5～7分定義為陽性(高表達)。

1.3 研究結果評價

參照美國國家癌癥綜合網(NCCN)評價標準，療效評價分為完全緩解(CR)、未證實的CR(CRu)、部分緩解(PR)、疾病穩(wěn)定(SD)、疾病進展(PD)或復發(fā)、死亡。采用電話及門診復診的方式對患者進行隨訪。隨訪截止時間為2016年2月17日，平均隨訪時間為105.89(65～158)個月。無進展生存(PFS)時間定義為治療結束至隨訪終點發(fā)生疾病進展等事件時間?？偵嫫?OS)時間定義為開始治療至隨訪終點或任何原因死亡的時間。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，統(tǒng)計描述資料分析采用卡方檢驗或Fisher精確檢驗，生存分析采用Kaplan—Meier法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 HDAC11在cHL中的表達

cHL組織中HDAC11主要位于HRS細胞核，呈黃色或棕褐色顆粒狀陽性反應(圖1)。全組患者HDAC11的表達14例陰性、28例弱陽性和14例陽性，高表達率僅為25%。其中結節(jié)硬化型共28例，陰性6例、弱陽性16例和陽性6例，高表達率僅21.4%;混合細胞型共22例，陰性4例、弱陽性12例和陽性6例，高表達率僅為27.2%;淋巴細胞消減型2例均為陽性；富于淋巴細胞型4例均為陰性(表1)。HDAC11的表達在結節(jié)硬化型cHL和混合細胞型cHL之間無差異(P=0.21)，富于淋巴細胞型和淋巴細胞消減型由于病例數(shù)很少沒有進行統(tǒng)計分析。周圍反應性增生的淋巴細胞均為陽性。

2.2 HDAC11的表達與cHL臨床病理特征的關系

統(tǒng)計學分析顯示：HDAC11在cHL的組織HRS中的表達與是否有結外累犯有明顯相關性(χ2=8.185,P=0.011)，而與性別、年齡、腫瘤分期、大腫塊和B癥狀的關系不明顯(表2)。

2.3 HDAC11的表達與預后的關系

56例cHL患者隨訪至2016年2月17日，12例死亡，其余44例均在隨訪中，平均隨訪時間為105.89(65～158)個月。全組中位PFS為140個月(95%CI為90.1～189.9)、OS為108個月(95%CI為96.0～119.9)。HDAC11陰性表達組的10 年 PFS大于HDAC11弱陽性組，也大于 HDAC11陽性組(分別為86%、70%和15%)，兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義(Log- rank 檢驗P=0.013)；HDAC11陰性表達組的10 年OS大于 HDAC11弱陽性組，也大于HDAC11陽性組(分別為100%、78%和45%)，兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義 (圖2)。分析結果提示，HDAC11表達增高與cHL患者的PFS和OS呈負相關。

A.HDAC11在HRS細胞中表達陰性(箭頭所示)；B.HDAC11在cHL HRS細胞中低表達(箭頭所示)；C.HDAC11在cHL HRS細胞中高表達(箭頭所示)

圖1HDAC11在cHL組織中的表達SP×200

Fig1TheexpressionofHDAC11incHL(SP×200)

表2HDAC11的表達和cHL臨床病理特征的關系

Tab2TherelationshipofHDAC11proteinexpressionwithclinicopathologicalfeatures

特征 nHDAC11的表達程度/例陰性弱陽性陽性高表達率/%χ2值P值性別 男268126230．8970．693 女30616826年齡 <45歲3410168230．9140．867 ≥45歲22412627分期 Ⅰ20612210 Ⅱ204106308．100．20 Ⅲ1224650 Ⅳ42200大腫塊 是16664252．1270．324 否408221025B癥狀 有248106251．7640．390 無32618825結外受侵 有6402338．1850．011 無5010281224

圖2HDAC11在HRS細胞中表達強度和經典霍奇金淋巴瘤預后的關系

Fig2TheexpressionofHDAC11andtheprognosisofpatientswithclassicalHodgkinlymphoma

3 討 論

目前HDACs共有4類18種，Ⅰ類包括HDAC1、2、3和8，Ⅱ類為HDAC4、5、6、7、9和10，Ⅲ類為SIRT1～7以及Ⅳ類HDAC11，除Ⅲ類為尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD)依賴型，其他HDAC為鋅指依賴型。HDAC1、2、3、8和11多在核內檢測到，HDAC6多在胞漿內表達，而HDAC4、5、7、9和10常穿梭于胞漿和胞核之間[4]。在我國對不同腫瘤研究各種HDAC的表達有利于開拓新的研究領域、尋找到新的治療靶點和促進選擇性HDACI的進一步開發(fā)，這方面研究目前還不多，僅僅在實體瘤如前列腺癌、胃癌、結腸癌和乳腺癌的研究中有少量報道[8- 10]，而且HDAC的表達與臨床病理特征及預后的關系各研究不盡一致[11]。

在皮膚T細胞性淋巴瘤檢測到腫瘤細胞HDAC1高表達, HDAC2、HDAC6呈中等強度表達，HDAC1及HDAC2與臨床預后無明顯相關性，而HDAC6與預后有明顯相關性；瑞士研究人員研究了283例cHL中的HDAC表達，發(fā)現(xiàn)cHL HDAC1、2和3表達特征性增高，HDAC1表達低與較差的預后相關[6]，這和我們前期研究結果相一致；有研究人員對cHL組織標本系統(tǒng)地進行HDAC1～11的研究，結果顯示22例中HDAC 1、2、3、8和10陽性率為100%,4例中HDAC11均為陰性，但蛋白印跡研究提示HDAC11呈中等強度表達，該研究沒有涉及HDAC表達與預后的關系[12]。有必要進行較大樣本的HDAC11表達的研究，首先明確HDAC11在cHL中的表達特征，為進一步探討HDAC11在cHL惡性表型維持的機制和研究新的選擇性HDAC抑制劑打下基礎。本研究通過免疫組化檢測HDAC11在cHL組織中的表達，并分析其臨床病理意義及其與預后可能存在的關系。我們的研究顯示，HDAC11高表達率為25%，弱陽性為50%，陰性表達為25%，其表達與性別、年齡、腫瘤分期、大腫塊及B癥狀的關系不明顯，與是否有結外累犯有明顯關聯(lián)；HDAC11的表達在結節(jié)硬化型cHL和混合細胞型cHL之間無差異，富于淋巴細胞型和淋巴細胞消減型由于病例數(shù)很少沒有進行統(tǒng)計分析。HDAC11表達高與PFS及OS相關，這和其他Ⅰ類HDAC對生存的影響是一致的。

對復發(fā)難治的cHL患者進行的Ⅱ期臨床研究也說明選擇性HDACI1、2、3和11抑制劑MGCD0103獲得25%的客觀有效率，中位PFS達到9個月，毒副作用相對輕微。目前還沒有超選擇性針對HDAC11的抑制劑，進一步研究HDAC11在cHL中的功能機制將是一個有價值的研究方向。最近研究顯示，HDAC11在cHL中能調控OX40配體的表達，促進HRS細胞凋亡，同時用小RNA干擾技術沉默HDAC11可促進微環(huán)境中干擾素gamma的分泌，有助于打破HRS細胞對周圍效應性CD4+T細胞的免疫耐受[13]，說明HDAC11的功能具有一定的復雜性。

我們的研究顯示，測定HDAC 11對疾病的診斷及預后可能有一定的提示作用，有利于進行個體化治療，值得進一步研究。和HDAC 1～3一樣，HDAC11的表達場所為細胞核，其表達增高有助于DNA及組蛋白去乙?；?，不利于有關基因表達。從腫瘤治療的角度，HDACIs有利于DNA復制、轉錄以及化療藥物發(fā)揮作用。ABVD是cHL標準一線誘導治療方案，其中阿霉素可以和DNA結合，破壞DNA的轉錄復制所需的正常結構，研究表明加入HDACIs可大大提高阿霉素的療效[14]。HDACIs和化療的聯(lián)合用藥也是今后臨床研究的熱點之一，和HDAC1～3相比，HDAC11表達強度比較低，HDAC11高表達的患者更適合在化療的基礎上聯(lián)合使用HDACIs的治療。我們目前的研究病例數(shù)還比較少，需要擴大檢測樣本量，同時HDAC11的表達調控機制是我們進一步研究的課題之一。

cHL腫瘤組織微環(huán)境中HRS細胞數(shù)量很少，而周圍反應性增生的淋巴細胞占絕大多數(shù)，形成cHL特殊的病理形態(tài)學特征，要做到精準殺滅腫瘤細胞而降低毒副作用需要研究HRS的HDAC表達特征, 才能進一步研究各種HDAC在cHL中的作用和其分子生物學機制，有利于進一步制定最佳的聯(lián)合用藥策略和高效地進行臨床試驗的設計，為根本解決霍奇金淋巴瘤的治療問題奠定基礎。

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