基于miR- 21/Smad7探討芍藥苷在抗血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌肥大中的作用

張會(huì)超，徐里，芮浩淼，曹程浩，楊鳳鳴，袁彬

(1.河南省中醫(yī)院 心病科，河南 鄭州 450000； 2.河南中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450000；3.河南中醫(yī)藥大學(xué) 研究生院，河南 鄭州 450000)

心肌肥厚是指心臟在各種生理以及病理因素的刺激下，為適應(yīng)做功、維持心臟功能而表現(xiàn)出的體積與質(zhì)量的增加，持續(xù)性心肌肥厚是心力衰竭及突發(fā)心源性死亡的主要原因，預(yù)防及逆轉(zhuǎn)心肌細(xì)胞肥厚及心室重構(gòu)是治療心力衰竭的首要方法[1- 2]。芍藥苷(Pae)是從中藥毛莨科植物芍藥中分離獲得的一種單萜類(lèi)糖苷化合物，是芍藥的主要活性成分之一，具有抑制心室重塑、減輕缺血缺氧對(duì)心肌的損傷、改善心衰患者心功能等心臟保護(hù)作用[3- 4]，Pae對(duì)心肌細(xì)胞肥大的作用及其機(jī)制的研究目前尚不充分。微小RNA(microRNAs，miRs)是影響心臟發(fā)育及心臟疾病進(jìn)展的重要調(diào)節(jié)器，大量研究顯示miRs在心肌肥大的過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其中異常表達(dá)的microRNA- 21(miR- 21)與心肌肥厚、心肌細(xì)胞纖維化、心室重構(gòu)及心臟功能的改善密切相關(guān)[5- 6]。然而，miR- 21是否參與了Pae防治及逆轉(zhuǎn)心肌細(xì)胞肥大，發(fā)揮保護(hù)心肌細(xì)胞的作用及其潛在機(jī)制研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)模擬心肌細(xì)胞肥大模型，基于miR- 21調(diào)控探討Pae在抵抗血管緊張素Ⅱ(Ang- Ⅱ)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大過(guò)程中的作用及其潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)及分組

新生1～3日齡SD大鼠(購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)常規(guī)消毒后置于超凈工作臺(tái)開(kāi)胸迅速取出心臟，分離心室后使用預(yù)冷的D- Hanks液沖洗3次，剪成約1 mm3大小的碎塊后用0.2% 胰蛋白酶和0.1%膠原酶B 的混合消化液37 ℃水浴分次消化。采用差速貼壁原理分離去除非心肌細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為3×105L-1，使用含5% 胎牛血清的改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM) 置于二氧化碳培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)48 h后換用無(wú)血清培養(yǎng)基適應(yīng)性培養(yǎng)10 h。實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組(n=9)；Ang- Ⅱ組(Ang- Ⅱ, Sigma, USA，150 nmol·L-1，n=9)；Pae組(Pae，北京博奧森生物技術(shù)有限公司，25 μmol·L-1，n=9)；Pae+Ang Ⅱ組，(n=9)。藥物處理24 h后收集細(xì)胞進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定。

1.2 心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染

心肌細(xì)胞以3×105孔-1接種于6孔板，待細(xì)胞達(dá)到70%～80%融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，按照試劑盒(Cell signaling, USA)提供的說(shuō)明書(shū)指示，將Smad7 siRNA、Lipofectamine 2000稀釋于100 μl無(wú)血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基opti- MEM中，室溫放置5 min。隨后將稀釋的siRNA溶液加入脂質(zhì)體溶液中，輕緩混勻，室溫放置20 min；用基礎(chǔ)培養(yǎng)opti- MEM漂洗2次，加入無(wú)血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基opti- MEM 1 ml·孔-1；將siRNA- 脂質(zhì)體復(fù)合物加入細(xì)胞中，輕輕混勻，孵育6 h后換完全培養(yǎng)基,48 h后收集各組細(xì)胞待測(cè)。同法轉(zhuǎn)染miR- 21 模擬物(mimic)、miR- 陰性對(duì)照(NC)及siRNA- NC。

1.3 雙熒光素酶報(bào)告檢測(cè)

PCR擴(kuò)增Smad7 mRNA 3′- UTR,將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pMD18- T載體構(gòu)建含野生型Smad7基因載體(Smad7- WT)。根據(jù)miRBase預(yù)測(cè)并利用點(diǎn)突變方法構(gòu)建Smad7- 3′UTR 突變載體(Smad7- Mut)，PsiCHECKTM- 2 載體(Promega，美國(guó)) 含螢火蟲(chóng)和海腎雙熒光素酶。將構(gòu)建的載體Smad7- WT UTR、Smad7- Mut進(jìn)行XhoⅠ和NotⅠ雙酶切，將野生型及含有突變位點(diǎn)的ROCK2- 3′UTR 克隆置于psiCHECKTM- 2 載體的海腎熒光素酶開(kāi)放讀碼框架的下游，構(gòu)建含該野生及突變載體的雙熒光素酶報(bào)告載體。將所構(gòu)建的熒光素酶報(bào)告載體與miR- 21(miR- 21 mimic)表達(dá)載體或者陰性對(duì)照(miR- NC)載體共轉(zhuǎn)染至HEK- 293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后24 h收集細(xì)胞進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定。計(jì)算公式：相對(duì)熒光值=螢火蟲(chóng)熒光素酶熒光值/海腎熒光素酶熒光值。

1.4 心肌細(xì)胞表面積大小的檢測(cè)

心肌細(xì)胞經(jīng)Ang Ⅱ處理24 h后，根據(jù)試劑盒(Santa Cruze，USA)提供的操作說(shuō)明，攜帶熒光基團(tuán)的染料鬼筆環(huán)肽(fluorescent phallotoxins)染心肌細(xì)胞骨架蛋白F- actinin，4′,6- 二脒基- 2- 苯基吲哚(DAPI)染核，Zeiss (AX10) 倒置熒光顯微鏡進(jìn)行拍照，隨機(jī)選取10個(gè)視野，測(cè)量100個(gè)細(xì)胞進(jìn)而計(jì)算細(xì)胞的表面積，取平均值。每組重復(fù)測(cè)量3次。

1.5 Western blotting檢測(cè)

將培養(yǎng)的各組心肌細(xì)胞用0.05%胰蛋白酶消化，PBS洗滌3次；加入450 μl蛋白裂解液常規(guī)方法裂解細(xì)胞，BCA 法測(cè)定蛋白濃度，樣品經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠(SDS)電泳后轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，封閉后兔抗小鼠一抗GAPDH (1∶2 000，Cell Signaling，美國(guó))、兔抗鼠心房利尿鈉肽(ANP)(1∶1 000, Santa Cruz, 美國(guó))及腦利尿鈉肽(BNP)(1∶1 000,Santa Cruz,美國(guó)) 4 ℃孵育過(guò)夜，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔二抗，Western blotting檢測(cè)ANP及BNP蛋白表達(dá)， FluorChem Q凝膠成像系統(tǒng)(Alpha Innotech，美國(guó))顯影，Scion Image圖像分析系統(tǒng)對(duì)條帶進(jìn)行分析，目的蛋白的相對(duì)含量以目的蛋白與GAPDH條帶光密度的比值表示，每組重復(fù)檢測(cè)3次。

1.6 SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR

Trizol(Invitrogen, 美國(guó))抽提法提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)吸光度值確定RNA的濃度和純度。Quantscript RT kit反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用SYBR Green Ⅰ(Invitrogen, 美國(guó))熒光染料嵌合法20 μl反應(yīng)體系，即10 μl SYBR Green實(shí)時(shí)PCR Master Mix、1 μl 0.2 μmol·L-1引物、2 μl cDNA及7 μl無(wú)菌雙蒸水。避光置于熒光定量PCR儀(ABI 7 500 Fast PCR)采集熒光信號(hào)檢測(cè)miR- 21及ANP、BNP mRNA表達(dá)，U6 (Mus musculus U6 small nuclear RNA)及GAPDH分別作為miR- 21及mRNA內(nèi)參，ABI7500配套軟件采用2- ΔΔCт法處理數(shù)據(jù)。PCR擴(kuò)增引物采用Oligo 6.0設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程有限公司合成，引物及其序列見(jiàn)表1。

表1實(shí)時(shí)PCR引物序列

基因名稱(chēng)正義鏈(5′?3′)反義鏈(5′?3′)GAPDHCCAATGTGTCCGTCGTGGATCTGTTGAAGTCGCAGGAGACAACCU6CTCGCTTCGGCAGCACAAACGCTTCACGAATTTGCGTANPGGAAGTCAACCCGTCTCAAGCCCTCAGTTTGCTTTTBNPTTTGGGCAGAAGATAGACCGAGAAGAGCCGCAGGCAGAGMiR?21TGTCGGGTAGCTTATCAGACTGTCAGACAGCCCATCGACT

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Pae能有效抑制Ang- Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥厚

結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，Ang- Ⅱ處理能顯著增加心肌細(xì)胞表面積約1.3倍(P<0.05)。Pae處理能顯著抑制Ang- Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞表面積增大，對(duì)心肌細(xì)胞表面積的抑制率約39%(P<0.05)(圖1A、B)。實(shí)時(shí)PCR及Western blotting結(jié)果顯示，與正常心肌細(xì)胞相比，Ang- Ⅱ組心肌細(xì)胞肥厚性標(biāo)志基因ANP及BNP表達(dá)顯著增加，Pae預(yù)處理對(duì)Ang- Ⅱ誘導(dǎo)的細(xì)胞表面積增加及ANP、BNP表達(dá)的上調(diào)均具有顯著的抑制作用(均P<0.05) (圖1C、D)。

2.2 Pae能顯著降低Ang- Ⅱ誘導(dǎo)的肥厚性心肌細(xì)胞miR- 21表達(dá)

實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，Ang- Ⅱ組心肌細(xì)胞miR- 21相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05)，Pae處理后能顯著抑制Ang- Ⅱ誘導(dǎo)的miR- 21表達(dá)的增加(P<0.05) (圖2)，提示Pae可能是通過(guò)抑制miR- 21表達(dá)的增加發(fā)揮抵抗心肌細(xì)胞肥大的作用。

A、B．各組心肌細(xì)胞表面積，Scale bar=20 μm；C.ANP、BNP mRNA相對(duì)表達(dá)量；D.ANP、BNP蛋白表達(dá) (*P<0.05)

圖1Pae對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大效應(yīng)的影響

*P<0.05

圖2各組心肌細(xì)胞miR-21相對(duì)表達(dá)量

2.3 miR- 21介導(dǎo)Pae抵抗心肌細(xì)胞肥大的作用

結(jié)果顯示，與Ang- Ⅱ組相比，Pae預(yù)處理能顯著抑制心肌細(xì)胞相對(duì)表面積的增加，下調(diào)肥厚性標(biāo)志基因ANF及BNP表達(dá) (P<0.05) (圖3A、B、C)，miR- 21 mimic 轉(zhuǎn)染后顯著削弱了Pae對(duì)Ang- Ⅱ誘導(dǎo)的細(xì)胞表面積及ANP、BNP表達(dá)增加的抑制作用(P<0.05) (圖3D)，提示miR- 21介導(dǎo)了Pae對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。

2.4 miR- 21直接靶向Smad7介導(dǎo)Pae對(duì)心肌細(xì)胞肥大的抵抗作用

生物信息學(xué)(http://www.targetscan.org)預(yù)測(cè)分析顯示，Smad7 mRNA的3′- UTR存在miRNA- 21的結(jié)合序列(圖4A)。熒光素酶檢測(cè)顯示與miR- NC陰性對(duì)照相比，miRNA- 21過(guò)表達(dá)抑制Smad7 mRNA的3′- UTR載體的相對(duì)熒光素酶活性。而對(duì)Smad7的該序列進(jìn)行突變(Mut)后這種抑制作用消失，證實(shí)miR- 21能靶向作用于Smad7 (圖4B)。

進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，Ang- Ⅱ作用下伴隨著miR- 21表達(dá)的升高，心肌細(xì)胞Smad7 mRNA及蛋白表達(dá)顯著下降，Pae預(yù)處理可部分抵消該效應(yīng)，而miR- 21 mimic轉(zhuǎn)染則削弱了Pae對(duì)Smad7表達(dá)的調(diào)控作用，提示Pae對(duì)Ang- Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的抵抗作用可能是通過(guò)調(diào)控miR- 21表達(dá)，影響靶分子Smad7表達(dá)水平實(shí)現(xiàn)的(圖4C)。

2.5 Smad7調(diào)控Pae對(duì)心肌細(xì)胞肥大的抵抗作用

進(jìn)一步分析Smad7在Pae抵抗Ang- Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大中的作用，結(jié)果如圖5所示，Pae能顯著增加Smad7蛋白表達(dá)(P<0.05)(圖5A)，Smad7 siRNA轉(zhuǎn)染后顯著減弱了Pae對(duì)Ang- Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞表面積及ANP、BNP mRNA及蛋白表達(dá)的降低，逆轉(zhuǎn)了Pae對(duì)Ang- Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥厚的抵抗性保護(hù)作用(P<0.05) (圖5B、C、D)，提示Smad7在Pae對(duì)抗心肌細(xì)胞肥厚中具有一定的調(diào)控作用。

A.各組心肌細(xì)胞相對(duì)表面積；B.ANP、BNP蛋白相對(duì)表達(dá)量；C.ANP、BNP mRNA相對(duì)表達(dá)量；D.miR- 21相對(duì)表達(dá)量(*P<0.05)

圖3miR-21介導(dǎo)Pae抵抗心肌細(xì)胞肥大的作用

A、B.miR- 21與Smad7靶向關(guān)系；C.心肌細(xì)胞Smad7蛋白表達(dá)的變化(*P<0.05)

圖4miR-21靶向Smad7介導(dǎo)Pae對(duì)心肌細(xì)胞肥大的抵抗作用

A.各組心肌細(xì)胞Smad7蛋白表達(dá)的變化；B.各組心肌細(xì)胞相對(duì)表面積；C、D.ANP、BNP 蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)量(*P<0.05)

圖5Smad7調(diào)控Pae對(duì)心肌細(xì)胞肥大的抵抗作用

3 討 論

心肌肥大是心臟在各種病理因素刺激下通過(guò)增加室壁厚度來(lái)增加室壁張力的代償性反應(yīng)，早期心肌肥厚有利于維持心臟的正常功能，然而持續(xù)性心肌肥厚會(huì)導(dǎo)致心力衰竭及突發(fā)性死亡。臨床數(shù)據(jù)顯示約1/3確診的心衰病人會(huì)在1年內(nèi)死亡，心衰往往由心肌肥厚發(fā)展而來(lái)，因此對(duì)心肌肥厚機(jī)制的研究以及尋找預(yù)防和治療心肌肥厚的藥物具有重要意義[7]。Pae是從中草藥毛莨科植物芍藥的根莖中提取的一種單萜類(lèi)糖苷化合物，具有抗氧化、抗炎、抗凝血、解痙鎮(zhèn)痛及免疫調(diào)節(jié)等作用[8]。對(duì)心血管疾病的預(yù)防與治療發(fā)揮著重要作用，能夠減輕缺血缺氧造成的心肌損傷，抑制梗死后心室重塑，通過(guò)抑制還原型輔酶Ⅱ(NAPDH)氧化酶的活性抑制心肌細(xì)胞凋亡[9]。此外，Pae還能夠抑制持續(xù)性壓力負(fù)荷下心臟病大鼠心肌收縮功能的下降和心肌壁厚度的增加[10]。本次研究顯示，Pae能有效逆轉(zhuǎn)Ang- Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞表面積的增加以及心肌肥厚標(biāo)志物ANP、BNP的表達(dá)，通過(guò)負(fù)性調(diào)控miR- 21解除對(duì)Smad7表達(dá)的抑制而發(fā)揮對(duì)心肌的保護(hù)作用。

MiR- 21是一種在進(jìn)化上高度保守的單基因編碼的miRNA，廣泛表達(dá)于心臟、脾臟、小腸等器官，在心肌細(xì)胞的分化生長(zhǎng)及心肌肥厚中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[11]。既往研究證實(shí)miR- 21 抑制不僅能夠減緩心肌肥厚的進(jìn)展，同時(shí)可以逆轉(zhuǎn)壓力負(fù)荷下的心室重構(gòu)[12]。此外，miR- 21過(guò)表達(dá)能夠靶向作用于信號(hào)通路特異性抑制蛋白(Spry)2,誘導(dǎo)心肌細(xì)胞間特異性細(xì)絲狀縫隙連接的生成，參與促進(jìn)心肌細(xì)胞肥厚及心室重構(gòu)過(guò)程的進(jìn)展[13]。與上述研究一致，本次研究發(fā)現(xiàn)Ang- Ⅱ誘導(dǎo)的心肌肥厚細(xì)胞miR- 21表達(dá)顯著增加，Pae可以通過(guò)降低miR- 21表達(dá)發(fā)揮一定的抗心肌細(xì)胞肥大的作用。心肌肥厚的進(jìn)行性加重可導(dǎo)致心肌纖維化，繼而促進(jìn)心肌肥厚進(jìn)展，內(nèi)皮—間葉組織轉(zhuǎn)化是心臟纖維化的主要來(lái)源，研究指出miR- 21通過(guò)PTEN/AKT通路參與TGF- β1介導(dǎo)的上皮間質(zhì)化(EMT)過(guò)程[14]。這些研究進(jìn)一步佐證miR- 21可增強(qiáng)EMT過(guò)程，增加心臟成纖維細(xì)胞數(shù)量，加重心肌細(xì)胞肥厚、心臟重塑及心力衰竭。

Smad7是Smad家族的一個(gè)重要的抑制性成員，不僅能直接與活化的TGF- β1受體結(jié)合，抑制Smad3的磷酸化，還能在細(xì)胞內(nèi)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Smad3，阻斷TGF- β1信號(hào)通路傳導(dǎo)，報(bào)道指出Pae能通過(guò)調(diào)節(jié)心臟、肺臟及腎臟TGF- β1/Smad信號(hào)通路發(fā)揮一定的抗炎、抗氧化、抗纖維化的保護(hù)性作用[15]。本次研究顯示，心肌細(xì)胞經(jīng)Ang- Ⅱ處理后，miR- 21表達(dá)增加，伴隨Smad7表達(dá)的降低。Pae處理能逆轉(zhuǎn)Ang- Ⅱ處理后心肌細(xì)胞miR- 21表達(dá)的增加，增加Smad7表達(dá)，通過(guò)減弱miR- 21對(duì)Smad7的抑制，降低心肌肥厚細(xì)胞表面積及肥厚性標(biāo)志ANP、BNP的表達(dá)，對(duì)心肌細(xì)胞肥厚的進(jìn)展發(fā)揮明顯的抑制作用。

本次研究發(fā)現(xiàn)，Ang- Ⅱ誘導(dǎo)的肥厚性心肌細(xì)胞中miR- 21表達(dá)顯著增加，Pae能夠通過(guò)抑制miR- 21表達(dá)進(jìn)而降低其對(duì)靶蛋白Smad7的抑制作用，降低心肌細(xì)胞表面積及心肌肥厚性標(biāo)志物ANP、BNP的相對(duì)表達(dá)量，發(fā)揮對(duì)心肌的保護(hù)性作用。本研究明確了miR- 21/Smad7在Pae抵抗心肌細(xì)胞肥大過(guò)程中的作用，加深了對(duì)Pae在抵抗心肌肥厚研究方面的認(rèn)識(shí)，同時(shí)為中醫(yī)藥在治療心血管疾病方面對(duì)miRs調(diào)控機(jī)制的深入研究提供了新的方向和理論支持。

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