提取技術(shù)對(duì)粗毛纖孔菌三萜類化合物制備及體外降血脂作用的影響

李德海，杜令娟，康 寧，顧嘉林，王占斌*

（東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

據(jù)統(tǒng)計(jì)，高血脂癥導(dǎo)致冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化等心腦血管疾病患者的死亡率大幅度升高[1]。目前臨床上治療高血脂癥主要以辛伐他汀為主，但長(zhǎng)期服用會(huì)有損害肝腎等副作用[2]。因此，開發(fā)有效調(diào)節(jié)血脂的天然功能性成分成為關(guān)注熱點(diǎn)。研究表明三萜類化合物有較好的降血脂作用，是一類重要的天然產(chǎn)物化學(xué)成分，符合多種天然產(chǎn)物的特點(diǎn)，具有廣泛的開發(fā)和應(yīng)用前景[3]。

粗毛纖孔菌（Inonotus hispidus）又名粗毛黃褐孔菌，屬于繡革孔菌科，纖毛孔菌屬，主要分布于遼寧、吉林、黑龍江、內(nèi)蒙古、北京、山東、寧夏和新疆等北溫帶地區(qū)[4]。粗毛纖孔菌作為藥用真菌，在民間主要用于治療消化不良引起的胃病、高血壓、高血脂、各種癌癥、糖尿病、便秘、痛風(fēng)和關(guān)節(jié)炎等疾病[5]。三萜類化合物是粗毛纖孔菌中一類重要的活性物質(zhì)，具有抗病毒、抗炎、抗菌、抗癌、溶血、降低血糖血脂等多種生物學(xué)作用[6]，因此開發(fā)粗毛纖孔菌功能性成分尤其是三萜類化合物尤為重要。目前，關(guān)于粗毛纖孔菌三萜類化合物（triterpenoids from Inonotus hispidus，IHT）的提取技術(shù)主要以溶劑回流法為主，此提取方法的耗時(shí)長(zhǎng)、效率低，超聲波、高剪切、半仿生和雙水相萃取是近年來備受關(guān)注的提取技術(shù)，不僅在一定程度上提高了IHT提取效率，還具有高效節(jié)能等優(yōu)點(diǎn)[7]。現(xiàn)如今，對(duì)于不同提取技術(shù)與三萜類化合物提取及功能性之間關(guān)系研究還鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以粗毛纖孔菌菌絲體為原料，體外模擬生物體內(nèi)環(huán)境，研究不同提取技術(shù)對(duì)IHT提取效果和降血脂活性的影響，以探尋最大程度保留IHT降血脂活性的處理手段，為選擇IHT高效提取技術(shù)及開發(fā)新型降血脂藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

粗毛纖孔菌由東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院森林保護(hù)實(shí)驗(yàn)室提供。

?；悄懰徕c、甘氨膽酸鈉、膽酸鈉 上海金穗生物科技有限公司；胰蛋白酶、胃蛋白酶 美國(guó)Biotopped公司；鹽酸、硫酸、無水乙醇等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-16G臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；722s紫外分光光度計(jì) 上海第三分析儀器廠；JA2003分析天平 上海良平儀器儀表有限公司；DK-8D電熱恒溫水槽 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限責(zé)任公司；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器公司；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；FLUKO高剪切乳化機(jī) 上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司；Nicolet 6700傅里葉變換紅外光譜儀 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；JSM-7500F掃描電鏡 日本電子株式會(huì)社。

1.3 方法

1.3.1 原料的預(yù)處理

根據(jù)徐云紅等[8]的方法，將活化后的菌絲塊接種到液體培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵條件為3 塊菌絲塊，pH值為6，裝液量為100 mL/250 mL三角瓶，轉(zhuǎn)速為100 r/min，25 ℃條件下培養(yǎng)7 d，過濾培養(yǎng)液，菌絲體烘干，粉碎，過篩，得粗毛纖孔菌菌絲體粉末，低溫保藏備用。

1.3.2 IHT的制備

準(zhǔn)確稱取粗毛纖孔菌菌絲體干粉，分別通過用95%乙醇溶液提取的溶劑回流技術(shù)[9]、超聲波輔助技術(shù)[10]、雙水相萃取技術(shù)[11]、半仿生技術(shù)[12]、高剪切輔助技術(shù)[13]，制備粗毛纖孔菌提取物，即為IHT粗提液，抽濾，減壓濃縮，50 ℃烘干，得IHT干粉，低溫保藏備用。

1.3.3 IHT提取率的測(cè)定

1.3.3.1 香草醛-冰乙酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)參考文獻(xiàn)[14]，略作修改。分別取100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL，置于5 mL容量瓶中，100 ℃水浴蒸干，加入0.20 mL新制的5%香草醛-冰乙酸溶液和0.80 mL高氯酸，搖勻，70 ℃水浴反應(yīng)15 min，常溫放置3 min，乙酸乙酯定容，551 nm波長(zhǎng)處比色測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=0.012 58X＋0.010 36（R2=0.999 2）。

1.3.3.2 提取率的測(cè)定

分別稱取1.3.2節(jié)中不同提取技術(shù)IHT干粉各50 mg，以體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液復(fù)溶于100 mL的容量瓶?jī)?nèi)，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法測(cè)定吸光度，并以如下公式計(jì)算IHT的提取率：

式中：C為提取液中IHT質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V為提取液定容體積/mL；N為提取液的稀釋倍數(shù)；m為粗毛纖孔菌菌絲體質(zhì)量/mg。

1.3.4 粗毛纖孔菌提取物中活性成分含量的測(cè)定

1.3.4.1 IHT含量的測(cè)定

參照1.3.3節(jié)方法測(cè)定。

1.3.4.2 多糖含量的測(cè)定

參照Dubois等[15]的苯酚-硫酸法，配制質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的多糖溶液，60 ℃溶解待用。溶液中加入5%苯酚溶液后旋渦振蕩，加入濃硫酸溶液，充分旋渦振蕩，室溫反應(yīng)20 min后在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。選擇葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，將樣品吸光度帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中多糖含量。

1.3.4.3 多酚含量的測(cè)定

參照董彩文等[16]福林-酚法，吸取1 mL樣液于10 mL容量瓶中，分別加入福林-酚試劑5 mL，充分振蕩后靜置4 min，加入75%碳酸鈉溶液4 mL，蒸餾水定容，搖勻，室溫避光放置1 h，測(cè)定765 nm處的吸光度，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，測(cè)定粗毛纖孔菌提取物中多酚成分的含量。

1.3.4.4 黃酮含量的測(cè)定

參照王宇等[17]硝酸鋁法，吸取0.5 mL樣液，加入2 mL離心管中，加5%亞硝酸鈉溶液0.1 mL，搖勻放置5 min，再加10%硝酸鋁溶液0.1 mL，搖勻放置6 min，加4%氫氧化鈉溶液1 mL，搖勻放置5 min，60%乙醇溶液定容，510 nm波長(zhǎng)處比色測(cè)定。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，測(cè)定粗毛纖孔菌提取物中黃酮成分的含量。

1.3.4.5 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

參照Lowry法（福林-酚法）[18]，使用蛋白質(zhì)定量試劑盒，樣液配制成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL溶液，60 ℃溶解待用。溶液加入試劑A，充分旋渦振蕩，室溫反應(yīng)10 min。加入試劑B，充分旋渦振蕩，室溫反應(yīng)15 min后在750 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。選擇牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，將樣品吸光度帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中蛋白質(zhì)含量。

1.3.5 IHT體外降血脂作用的測(cè)定

降血脂藥物的降血脂原理之一是能夠與膽酸鹽和膽固醇結(jié)合，從而阻止膽酸或膽固醇被腸道吸收影響其肝腸循環(huán)，使膽酸鹽排出體外，促使肝臟中膽固醇不斷轉(zhuǎn)化為膽酸鹽，從而降低體內(nèi)膽固醇含量，起到降血脂作用。因此體外降血脂作用原理是通過體外模擬人體內(nèi)腸道環(huán)境，待測(cè)藥物與膽酸鹽相結(jié)合產(chǎn)生沉淀，根據(jù)結(jié)合量的多少初步衡量待測(cè)藥物的降血脂能力。

1.3.5.1 膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參照文獻(xiàn)[19]方法測(cè)定，略作修改。分別取不同質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)樣液2 mL于具塞試管中，加入6 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%的硫酸溶液，70 ℃水浴20 min，冰浴5 min，在波長(zhǎng)387 nm處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5.2 膽酸鹽結(jié)合能力的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[20]，略作修改。分別移取1 mL不同提取技術(shù)IHT提取液于100 mL具塞三角瓶中，加入1 mL 10 mg/mL胃蛋白酶（以pH 6.3的0.1 mol/L磷酸緩沖液配制）、3 mL 0.01 mol/L的HCl溶液，模擬胃環(huán)境，在37 ℃恒溫振蕩消化1 h；以0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.3，隨后加入4 mL 10 mg/mL胰蛋白酶（以pH 6.3的0.1 mol/L磷酸緩沖液配制），在37 ℃恒溫振蕩消化1 h，模擬腸道環(huán)境進(jìn)行消化。每個(gè)樣品分別加入4 mL 1 mmol/L甘氨膽酸鈉、牛磺膽酸鈉和膽酸鈉（以pH 6.3的0.1 mol/L磷酸緩沖液配制），在37 ℃恒溫振蕩1 h后混合物移至離心管中，4 000 r/min離心20 min，對(duì)上清液中的膽酸鹽進(jìn)行分析。

1.3.6 不同提取技術(shù)IHT的紅外光譜分析

采用KBr壓片法。取100 mg干燥KBr粉末研細(xì)，加入三萜樣品混合研細(xì)，壓成透明薄片。Vector22型紅外光譜儀在4 000～400 cm－1波數(shù)范圍內(nèi)進(jìn)行測(cè)定。紅外光譜儀測(cè)定參數(shù)：分辨率4.0 cm－1；背景掃描次數(shù)32 次；檢測(cè)器為氖化硫三肽。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)中的數(shù)據(jù)均平行測(cè)定3 次，以 ±s表示。數(shù)據(jù)均用Excel 2010、Origin 8.0和SPSS 17.0等軟件處理完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 粗毛纖孔菌提取物中活性成分分析

為明確粗毛纖孔菌提取物中活性成分種類和含量的差異，本實(shí)驗(yàn)測(cè)定不同提取技術(shù)粗毛纖孔菌提取物中活性成分含量，結(jié)果見表1。

表1 不同提取技術(shù)粗毛纖孔菌提取物中活性成分含量分析Table 1 Effect of different extraction techniques on the contents of bioactive compounds from I. hispidus%

由表1可知，不同提取技術(shù)得到粗毛纖孔菌提取物中各活性成分含量存在顯著性差異（P＜0.05），5種提取技術(shù)粗毛纖孔菌提取物中IHT含量均最高，其次是多糖、蛋白質(zhì)含量，而黃酮和多酚含量較低。其中高剪切技術(shù)IHT質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)（37.78±0.57）%，溶劑回流提取IHT含量最低，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（24.42±0.34）%。高剪切技術(shù)由于轉(zhuǎn)子和定子之間的高速運(yùn)轉(zhuǎn)，形成強(qiáng)烈的高剪切力使粗毛纖孔菌菌絲體組織細(xì)胞發(fā)生裂解，加速細(xì)胞內(nèi)IHT等活性成分的溶出[21]。由此可以看出，5種提取技術(shù)粗毛纖孔菌提取物中三萜、多糖及蛋白質(zhì)是主要的活性成分，為后續(xù)活性成分的降血脂作用的相關(guān)性分析提供依據(jù)。

2.2 不同提取技術(shù)IHT紅外光譜分析

圖1 不同提取技術(shù)下IHT紅外光譜分析Fig. 1 Infrared spectroscopic analysis of triterpenoids from I. hispidus obtained by different extraction techniques

對(duì)比白樺酯醇三萜標(biāo)準(zhǔn)品分析高剪切、雙水相、超聲波、半仿生、溶劑回流5 種方法提取IHT紅外圖譜，如圖1所示，不同技術(shù)提取的IHT在化學(xué)結(jié)構(gòu)上存在一定差異，對(duì)比三萜標(biāo)準(zhǔn)品紅外圖譜進(jìn)行對(duì)比分析，5 種不同方法提取的IHT在3 500～3 300 cm－1之間有較寬的吸收峰（3 374.87、3 415.37、3 415.37、3 409.58、3 415.37 cm－1），說明5種IHT有O—H鍵伸縮振動(dòng)且可能是分子內(nèi)締合，其中以雙水相提取的IHT峰形最寬，締合程度最強(qiáng)；在1 655～1 590 cm－1之間（1627.65、1 635.36、1 635.36、1 619.94、1 608.01 cm－1）存在吸收峰，且雙水相提取的IHT的吸收峰最強(qiáng)，這是由于發(fā)生N－H變形振動(dòng)相當(dāng)于CH2的剪式振動(dòng)，說明雙水相提取的IHT含有更多的N－H基團(tuán)；在1 465～1 340 cm－1之間（1 409.73、1 403.94、1 411.66、1 413.59、1 456.01 cm－1）吸收峰較密集，為C－H基團(tuán)的彎曲振動(dòng)；5種IHT在1 300～1 000 cm－1之間（1 049.10、991.24、1 078.03、1 033.67、1 049.10 cm－1），也出現(xiàn)特征吸收峰，為C—O的伸縮振動(dòng)，其中高剪切的吸收峰最強(qiáng)；在3 000～2 800 cm－1之間存在C—H伸縮振動(dòng)，且以高剪切IHT的吸收峰最強(qiáng)，以上C—O、C—H、O—H及N—H基團(tuán)與三萜標(biāo)準(zhǔn)品所含官能團(tuán)相一致。說明5種提取技術(shù)提取的IHT初步符合三萜類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征。

2.3 活性成分對(duì)膽酸鹽降血脂作用的相關(guān)性分析

表2 不同活性成分降血脂作用的相關(guān)系數(shù)Table 2 Correlation analysis between IHT as well as other bioactive compounds and cholate binding capacity

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)手段，對(duì)不同活性成分的降血脂效果進(jìn)行相關(guān)性分析。由表2可知，粗毛纖孔菌提取物中不同活性成分與降血脂作用相關(guān)性各不相同，不存在顯著性差異（P＞0.05）。IHT與降血脂作用之間的相關(guān)性相對(duì)較好（r=0.910，P=0.254），其次是多酚、黃酮及多糖，而蛋白質(zhì)相關(guān)性較差（r=0.218，P=0.426）。此統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果進(jìn)一步證明三萜類化合物、多酚、黃酮及多糖都對(duì)膽酸鹽有結(jié)合能力，具有降血脂效果，而蛋白質(zhì)的降血脂效果不明顯，粗毛纖孔菌提取物中IHT起主要降血脂效果。Yuan等[22]研究表明三萜類物質(zhì)與降血脂作用具有相關(guān)性，因此本研究選用IHT為研究對(duì)象，討論不同提取技術(shù)的制備及對(duì)其降血脂作用的影響。

2.4 不同提取技術(shù)對(duì)IHT提取率的影響

圖2 不同提取技術(shù)對(duì)IHT提取率的影響Fig. 2 Effect of different extraction techniques on the extraction efficiency of triterpenoids

由圖2可見，5 種提取技術(shù)對(duì)IHT化合物提取率影響顯著（P＜0.05），其中高剪切提取技術(shù)提取率最大，其值為（3.33±0.02）%，其次是雙水相技術(shù)、超聲波技術(shù)和半仿生技術(shù)，而溶劑回流技術(shù)提取率最低，其值僅為（1.26±0.05）%。可以看出不同提取技術(shù)對(duì)IHT的提取因原理不同效果存在顯著性差異（P＜0.05），高剪切技術(shù)由于轉(zhuǎn)子高速旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生強(qiáng)烈的剪切力和離心擠壓力等機(jī)械作用，使粗毛纖孔菌菌絲體組織細(xì)胞發(fā)生變形，細(xì)胞壁破裂，加速細(xì)胞內(nèi)IHT溶出，顯著提高了提取效果[23]。而雙水相萃取技術(shù)也因菌絲體受分子間氫鍵、電荷相互作用、界面性質(zhì)等多種作用的影響下，使IHT能快速從濃度差異較大的兩相間分離出來，實(shí)現(xiàn)增大提取率的目的[24]。

2.5 提取技術(shù)對(duì)IHT與苷氨膽酸鈉結(jié)合能力的影響

人體肝臟會(huì)合成膽酸類物質(zhì)，若其在腸道內(nèi)被其他成分相結(jié)合，會(huì)加快膽固醇轉(zhuǎn)化膽酸，降低體內(nèi)膽固醇含量，在體外通過模擬人體胃腸環(huán)境進(jìn)行膽酸結(jié)合實(shí)驗(yàn)可以初步分析有效成分的降血脂效果。由圖3可見，5 種技術(shù)提取的IHT結(jié)合苷氨膽酸鈉的能力呈質(zhì)量濃度依賴性且具有顯著差異性（P＜0.05），在質(zhì)量濃度低于40 mg/mL時(shí)，其結(jié)合苷氨膽酸鈉的能力隨著質(zhì)量濃度的增加而不斷增強(qiáng)，在質(zhì)量濃度為40 mg/mL時(shí)，其對(duì)甘氨膽酸鈉的結(jié)合量均達(dá)到最高值，后期結(jié)合能力變化不顯著。當(dāng)質(zhì)量濃度為40 mg/mL時(shí)，高剪切技術(shù)提取的IHT結(jié)合苷氨膽酸鈉的能力最強(qiáng)（結(jié)合量為（0.668±0.03）μmol/100 mg），降血脂功能最顯著，其次分別為雙水相、超聲波、半仿生、溶劑回流技術(shù)。說明高剪切技術(shù)能促進(jìn)IHT的溶出，增強(qiáng)在腸道內(nèi)與苷氨膽酸鈉結(jié)合效率，促進(jìn)苷氨膽酸鈉在腸肝中的循環(huán)，使肝臟中膽固醇快速轉(zhuǎn)化為苷氨膽酸鈉，降低體內(nèi)膽固醇含量，降血脂效果快速顯著[25]。

圖3 不同提取技術(shù)IHT與苷氨膽酸鈉結(jié)合能力分析Fig. 3 Sodium glycocholate binding ability of triterpenoids obtained by different extraction techniques

2.6 提取技術(shù)對(duì)IHT與?；悄懰徕c結(jié)合能力的影響

圖4 不同提取技術(shù)IHT結(jié)合?；悄懰徕c能力分析Fig. 4 Sodium taurocholate binding ability of triterpenoids obtained by different extraction techniques

?；悄懰徕c是肝內(nèi)膽固醇衍生而來的物質(zhì)，其生物合成在保持膽固醇體內(nèi)平衡的過程中起著重要的作用，同時(shí)可在盲腸末端被重吸收從而進(jìn)入腸肝循環(huán)，導(dǎo)致肝臟大量降解膽固醇，起到降血脂作用。由圖4可見，5 種技術(shù)提取的IHT對(duì)?；悄懰徕c具有一定的結(jié)合能力，其結(jié)合量和質(zhì)量濃度之間呈明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，隨著質(zhì)量濃度的增加其結(jié)合量逐漸上升。不同提取技術(shù)IHT對(duì)?；悄懰徕c結(jié)合量的影響具有顯著性差異（P＜0.05），高剪切技術(shù)明顯優(yōu)于其他幾種提取技術(shù)，其對(duì)牛磺膽酸鈉的結(jié)合量在IHT粗提液質(zhì)量濃度為50 mg/mL時(shí)達(dá)到最高，為（0.994±0.02）μmol/100 mg，主要是因?yàn)榕；悄懰徕c中磺酸基的酸性比膽酸鈉和甘氨膽酸鈉的羧基更強(qiáng)，在高濃度下更容易離子化，且由于高剪切技術(shù)使細(xì)胞被迅速破碎，大大減小了有效成分的擴(kuò)散阻力，IHT被快速釋放，結(jié)合量明顯增強(qiáng)，降血脂效果明顯[26]。而溶劑回流技術(shù)是利用有機(jī)溶劑通過加熱回流使菌絲體中的IHT被釋放，提取時(shí)間越長(zhǎng)，IHT含量損失越大，大大降低提取效率，與?；悄懰徕c的結(jié)合量明顯降低，降血脂功能明顯低于其他幾種技術(shù)[27]。

2.7 提取技術(shù)對(duì)IHT與膽酸鈉結(jié)合能力的影響

圖5 不同提取技術(shù)IHT結(jié)合膽酸鈉能力分析Fig. 5 Sodium cholate binding ability of triterpenoids obtained by different extraction techniques

膽酸鈉具有較強(qiáng)的界面活性,能降低油水兩相間的表面張力,促進(jìn)脂類乳化,同時(shí)擴(kuò)大脂肪和脂肪酶的接觸面,加速脂類的消化，起到降血脂作用。由圖5可見，隨著IHT粗提液質(zhì)量濃度的不同其對(duì)膽酸鈉的結(jié)合能力亦不同，結(jié)合量隨著IHT粗提液質(zhì)量濃度增加先增加后下降。5 種技術(shù)提取的IHT在質(zhì)量濃度為40 mg/mL時(shí)，均達(dá)到最大結(jié)合量，當(dāng)IHT粗提液質(zhì)量濃度繼續(xù)升高至50 mg/mL時(shí)，結(jié)合量呈下降趨勢(shì)，說明雖然提取方法原理各不相同，但當(dāng)IHT粗提液質(zhì)量濃度過高時(shí)，都會(huì)抑制自身降血脂活性[28]。由圖5還可以看出，不同提取技術(shù)下提取IHT對(duì)膽酸鈉結(jié)合量的影響具有顯著性差異（P＜0.05）。其中高剪切技術(shù)提取的IHT對(duì)膽酸鈉的結(jié)合量最大，達(dá)（0.899±0.02）μmol/100 mg?？赡苁怯捎诟呒羟凶饔么龠M(jìn)了IHT內(nèi)部結(jié)構(gòu)側(cè)鏈的斷裂和官能團(tuán)的釋放，增大結(jié)合效果，有利于膽酸鈉結(jié)合，降血脂效果明顯[29]。而超聲波技術(shù)由于強(qiáng)烈震動(dòng)和粉碎作用增強(qiáng)了細(xì)胞膜的通透性，使菌絲體中的IHT更易釋放到溶劑中，增大與膽酸鈉的結(jié)合量，降血脂作用有一定的提升效果[30]。

2.8 不同提取技術(shù)IHT對(duì)降血脂作用的影響

以辛伐他汀片為陽性對(duì)照，調(diào)整經(jīng)過樹脂初步純化的IHT質(zhì)量濃度均為40 mg/mL時(shí)，對(duì)不同提取技術(shù)IHT的降血脂活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果見表3。

從表3可以看出，在相同干物質(zhì)含量的基礎(chǔ)上，作為一種降血脂藥物的主要成分，辛伐他汀結(jié)合?；悄懰徕c、膽酸鈉、甘氨膽酸鈉的能力顯著高于其他5 種技術(shù)提取的IHT（P＜0.05）。

表3 不同提取技術(shù)IHT降血脂作用Table 3 Effects of different extraction techniques on the hypolipidemic activity of triterpenoids

高剪切、雙水相、超聲波技術(shù)提取的IHT對(duì)膽酸鈉結(jié)合能力無顯著性差異（P＞0.05），但是顯著高于半仿生和溶劑回流法（P＜0.05），其中高剪切提取的IHT結(jié)合膽酸鈉能力相對(duì)辛伐他汀的吸附率為（27.92±2.47）%。但與其他兩種膽酸鹽的結(jié)合量相比，此法結(jié)合量?jī)H為（0.47±0.04）μmol/100 mg。Kim等[31]認(rèn)為這是由于在羥基含量相同時(shí)，膽酸鈉比其他兩種鈉鹽疏水性要弱，從而不能更好地通過疏水作用力吸附于其他羥基中，導(dǎo)致5 種提取技術(shù)IHT降血脂作用均不明顯。

半仿生、溶劑回流、超聲波技術(shù)提取的IHT對(duì)苷氨膽酸鈉的結(jié)合能力無顯著性差異（P＞0.05），但是顯著低于高剪切、雙水相技術(shù)提取的IHT對(duì)苷氨膽酸鈉的結(jié)合能力（P＜0.05），其中高剪切提取的IHT結(jié)合苷氨膽酸鈉能力相對(duì)辛伐他汀的吸附率為（36.53±4.93）%。結(jié)合量越高，說明其降膽固醇效果越好，降血脂活性越強(qiáng)，因?yàn)榻Y(jié)合膽酸鹽結(jié)合能力越強(qiáng)，膽固醇在肝臟中轉(zhuǎn)化膽汁酸越快，從而達(dá)到降低膽固醇、降脂的目的[32]。 這也證明了高剪切提取技術(shù)提取的IHT可以通過結(jié)合苷氨膽酸鈉達(dá)到降血脂的作用。

超聲波、雙水相、溶劑回流技術(shù)提取的IH-TR結(jié)合?；悄懰徕c的能力無顯著性差異（P＞0.05）。高剪切提取的IHT結(jié)合?；悄懰徕c的能力又顯著的高于其他提取技術(shù)（P＜0.05），其相對(duì)辛伐他汀的吸附率為（46.33±3.74）%。這可能是由于高剪切力的作用導(dǎo)致IHT結(jié)合?；悄懰徕c的官能團(tuán)充分暴露出來，增大與?；悄懰徕c結(jié)合機(jī)會(huì)，從而使結(jié)合速度加快，結(jié)合能力增強(qiáng)[33]，降血脂作用明顯。這也初步明了高剪切提取技術(shù)提取的IHT結(jié)合?；悄懰徕c能力最強(qiáng)，降血脂的作用最好。

3 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明IHT提取及降血脂效果與不同提取技術(shù)有關(guān)。5 種技術(shù)提取IHT均具有體外降血脂作用，但存在顯著性差異，這與IHT含量和結(jié)構(gòu)有關(guān)。高剪切技術(shù)提取的IHT體外降血脂效果最好，其次是雙水相、超聲波、溶劑回流、半仿生技術(shù)。其中高剪切技術(shù)IHT提取率最高，為（3.33±0.02）%；粗毛纖孔菌提取物中IHT質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為（37.78±0.57）%。當(dāng)IHT質(zhì)量濃度為40 mg/mL時(shí)，與牛磺膽酸鈉的結(jié)合量最高，為（1.31±0.09）μmol/100 mg。高剪切技術(shù)提取的IHT特征吸收峰最強(qiáng)，使IHT對(duì)降血脂活性相關(guān)性高，降血脂效果好。可見高剪切技術(shù)可以用于IHT的制備及天然新型降血藥物的開發(fā)。但關(guān)于不同提取技術(shù)對(duì)三萜類化合物結(jié)構(gòu)的影響而導(dǎo)致其體外降血脂效果不同的具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

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