干酪乳桿菌細菌素的抗菌機制分析

馬佳歌，于 微*，李佳君，周詩昊

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

在食品加工及貯運過程中，腐敗菌和致病微生物的生長繁殖會嚴重威脅食品安全。食品安全與人類健康息息相關(guān)，開發(fā)可靠、有效的天然防腐劑是目前亟待解決的問題。細菌素是細菌在代謝過程中通過核糖體產(chǎn)生的具有抗菌活性的多肽或蛋白質(zhì)類化合物，產(chǎn)生細菌素的細菌存在免疫特性，不會傷害菌株本身[1-3]。干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）被美國食品與藥品監(jiān)督管理局公認為安全的一種益生菌[4-6]，其所產(chǎn)的細菌素具有安全無毒等特性[7-8]。目前商業(yè)化的乳酸菌細菌素Nisin由于熱不穩(wěn)定、抑菌譜窄、pH值范圍窄、產(chǎn)量低等原因，在食品工業(yè)中的應(yīng)用受到限制[9-10]，因此，開發(fā)一種應(yīng)用范圍廣闊的新型生物防腐劑備受關(guān)注，干酪乳桿菌所產(chǎn)的細菌素作為一種新型乳酸菌細菌素受到廣泛重視[11-13]。

課題組前期從發(fā)酵乳制品中分離出具有抑菌活性的干酪乳桿菌KLDS 1.0338，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增出class IIb細菌素編碼基因lacA和lacB，利用重疊延伸PCR技術(shù)擴增兩端帶有酶切位點的重組細菌素基因，從而構(gòu)建克隆質(zhì)粒pGEX-4T-1-lacAB。本研究運用生物信息學(xué)方法分析干酪乳桿菌細菌素基因及其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)及特征功能，采用氨基酸定點突變技術(shù)構(gòu)建重組細菌素突變載體，分析細菌素突變體抗菌活性，推測干酪乳桿菌細菌素發(fā)揮抑菌活性的關(guān)鍵氨基酸位點，為進一步探索干酪乳桿菌細菌素抗菌機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

干酪乳桿菌KLDS1.0338由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點實驗室工業(yè)微生物菌種保藏中心提供；重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-lacAB由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點實驗室構(gòu)建；大腸桿菌（Escherichia coli BL21）感受態(tài)細胞購自寶生物（大連）有限公司。

1.1.2 試劑

溶菌酶、凝血酶、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、Tris-base上海陽光生物科技有限公司；Triton-X 上海索寶生物科技有限公司；溴酚藍 北京百奧萊博科技有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG） 上海寶曼生物技術(shù)有限公司；蛋白Marker寶生物（大連）有限公司；GST融合蛋白純化試劑盒美國Axygen公司；QuikChange Site-Directed Mutagenesis試劑盒 美國Stratagene公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-IFD超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；ULT1386-3-V30超低溫冰箱 日本Sanyo公司；DH4000A電熱恒溫培養(yǎng)箱 天津市泰斯特儀器有限公司；GDS-8000凝膠成像系統(tǒng) 美國UVP公司；T-Gradient 96 Thermoblock Modul PCR儀 德國Biometra公司；WH-851旋渦混合器 上海科達測試儀器廠；CHB-100恒溫金屬浴 杭州博日公司；Z300-K冷凍離心機德國Hermle公司。

1.3 方法

1.3.1 生物信息學(xué)分析

根據(jù)獲得的編碼干酪乳桿菌細菌素class IIb類型的相關(guān)基因序列，應(yīng)用DNAMAN軟件分別將細菌素lacA和lacB的核酸序列翻譯成氨基酸序列，獲得蛋白質(zhì)的基本信息。利用瑞士生物信息學(xué)研究所的蛋白組學(xué)分析平臺（ExPASy）ProtParam tool在線程序（http://web.expasy.org/protparam/）進行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析[14]；使用ProtScale 軟件（http://web.expasy.org/cgibin/protscale/protscale.pl）預(yù)測蛋白質(zhì)的疏水性和親水性[15]；利用網(wǎng)址http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/進行蛋白質(zhì)磷酸化分析；利用TMHMM Server v.2.0軟件（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）預(yù)測蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域；利用SOPMA程序（http://npsapbil.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html）預(yù)測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)；采用CBS中的SignalP 4.1 Server軟件（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測蛋白質(zhì)的信號肽[16]；蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測采用http://swissmodel.expasy.org/分析。

1.3.2 細菌素突變表達載體構(gòu)建

依據(jù)細菌素LacA和LacB的生物信息學(xué)分析結(jié)果和細菌素第2類型（class IIb）抑菌結(jié)構(gòu)GxxxG，選擇LacA蛋白中40位V和57位I為突變位點進行定點突變，并設(shè)計突變引物，分別是P1/P2和P3/P4。將實驗室保存的重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-lacAB作為氨基酸定點突變的DNA模板，氨基酸定點突變PCR擴增體系（50.0 μL）：ddH2O 35.5 μL，10×Taq DNA polymerase buffer 5.0 μL，2.5 mmol/L dNTP 4.0 μL，DNA模板1.0 μL，10 μmol/L上游引物2.0 μL，10 μmol/L下游引物2.0 μL，2.5 U/μL Taq DNA polymerase 0.5 μL。PCR條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性30 s，55 ℃退火1 min，68 ℃延伸2 min/kb，30 個循環(huán)。按照QuikChange Site-Directed Mutagenesis試劑盒的實驗操作方法，稍作改動[17]。

酶切鑒定：PCR產(chǎn)物冰上孵育5 min，使其溫度降至37 ℃以下，用1 μL Dpn I酶單酶切，37 ℃過夜反應(yīng)，酶切產(chǎn)物用1%瓊脂凝膠電泳檢測。

引物如下（下劃線位點為堿基突變處）：

P1：5-CGATCGGGGGAGCGGCAGCAGGCGCAGCTGG-3

P2：5-CCAGCTGCGCCTGCTGCCGCTCCCCCGATCG-3

P3：5-GTTGCAGGCGCTGCAGCAGGATTATCCTTGTG-3

P4：5-CACAAGGATAATCCTGCTGCAGCGCCTGCAAC-3

1.3.3 細菌素突變體的表達及純化

經(jīng)鑒定構(gòu)建正確的突變載體涂布于LB固體平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜，按1∶50的比例（200 μL）接種于10 mL LB培養(yǎng)基中擴培，使菌液OD600nm達0.8（使大腸桿菌處于最適合表達外源蛋白的生長狀態(tài)）。加入IPTG后，37 ℃誘導(dǎo)表達3 h。5 000 r/min、4 ℃離心10 min收集菌體，充分洗滌數(shù)次并以8 000 r/min離心2 min。向收集到的菌體中加入細菌裂解液，于4 ℃裂解10 min。

將重組蛋白與GSH-Sepharose 4B懸液混合，于室溫作用10 min離心，將懸液全部加入離心柱上，經(jīng)漂洗和重復(fù)洗脫，得到純化的重組蛋白。采用凝血酶切割重組融合蛋白后，用GST純化試劑盒純化去除標(biāo)簽，從而獲得單一的目的蛋白LacAB。通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測純化效果。

1.3.4 細菌素突變體抑菌活性檢測

牛津杯瓊脂擴散法[18-19]：選擇金黃色葡萄球菌ATCC25923和大腸桿菌ATCC25922為指示菌種，將過夜培養(yǎng)的指示菌懸液均勻涂于NB平板上，無菌條件下干燥30 min后，將內(nèi)徑為6 mm的牛津杯均勻放置在NB平板上，牛津杯孔內(nèi)滴入200 μL上清液，37 ℃培養(yǎng)24 h，以抑菌圈直徑大小表示抑菌活性強弱[20]。

血球計數(shù)板計數(shù)法：將指示菌37 ℃培養(yǎng)至菌落數(shù)達到106CFU/mL，取1 mL指示菌懸液，加入適量含重組細菌素溶液，至細菌素終質(zhì)量濃度為1 mg/mL，37 ℃共同培養(yǎng)6 h后，用生理鹽水適當(dāng)稀釋菌液，并用血球計數(shù)板計算活菌數(shù)，實驗均重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌素生物信息學(xué)分析

2.1.1 一級結(jié)構(gòu)分析

利用Primer 5.0軟件推測lacA開放閱讀框編碼的蛋白如下：MISKEVGITLKQHDLVLIQRGAKRRNKPSGCIVS TIGGAVAGAAGLNPFTTVAGAAIGLSLCLSTNYIHPA。由蛋白質(zhì)一級序列分析可知：氨基酸殘基數(shù)為71，其中包含有8 個堿性氨基酸R 、K、H，1個酸性氨基酸D，26 個親水性氨基酸 D、E、H、K、Q、R、S、T、N，34 個疏水性氨基酸A、F、I、L、M、P、V、W、Y。

利用Primer 5.0軟件推測lacB開放閱讀框編碼的蛋白如下：MSYNYRQGLDDFQLSGVSGGKKKFDCAATFY TGITDGIGSGTITGLAGGPFGIIGGAVVGGNLGAVGSA IKCLGDGMQ。由蛋白質(zhì)一級序列分析可知：氨基酸殘基數(shù)為77，其中包含有5 個堿性氨基酸R、K、H，5 個酸性氨基酸D，23 個親水性氨基酸D、E、H、K、Q、R、S、T、N，31 個疏水性氨基酸A、F、I、L、M、P、V、W、Y。

2.1.2 理化性質(zhì)分析

通過ProtParam分析干酪乳桿菌細菌素（class IIb）中LacA和LacB兩段氨基酸序列（表1）。依據(jù)穩(wěn)定指數(shù)小于40，親水性平均系數(shù)為正值且脂肪指數(shù)較高，推測LacA和LacB屬于穩(wěn)定、耐熱、疏水性蛋白[21]。

表1 干酪乳桿菌細菌素氨基酸序列分析結(jié)果Table 1 Amino acid sequence analysis of bacteriocin from Lactobacillus casei

2.1.3 跨膜結(jié)構(gòu)分析

應(yīng)用TMHMM2.0預(yù)測干酪乳桿菌細菌素的跨膜結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖1所示，LacA、LacB蛋白具有跨膜結(jié)構(gòu)特點，符合細菌素跨過細胞膜分泌蛋白的作用，同時這也與細菌素與靶細胞膜上的特殊位點相互作用相一致，這種作用可以提高細菌素的有效活性。

圖1 LacA（A）和LacB（B）的跨膜區(qū)分析Fig. 1 Analysis of transmembrane area

2.1.4 磷酸化位點分析

應(yīng)用NetPhos2.0 Server預(yù)測細菌素蛋白序列中Ser、Thr和Tyr三種氨基酸殘基可能成為的磷酸化位點，如圖2所示，分析結(jié)果表明LacA中有1 個Thr氨基酸殘基磷酸化位點，LacB中無磷酸化位點。由此說明，LacA翻譯后進行修飾，推測出該蛋白序列的修飾使結(jié)構(gòu)發(fā)生改變有利于提高抗菌肽活性。

圖2 LacA（A）和LacB（B）的磷酸化位點分析Fig. 2 Analysis of phosphorylation sites

2.1.5 信號肽預(yù)測結(jié)果

信號肽是引導(dǎo)新合成的蛋白質(zhì)向分泌通路轉(zhuǎn)移的短肽鏈，其長度約5～30 個氨基酸，這類肽段通常不能存在于成熟蛋白中。如圖3所示，LacA的C值、Y值和S值分別在52、33、30位點，分別為0.362、0.508、0.911，預(yù)測含有信號肽，切割位點位于28～29氨基酸殘基之間。LacB的C值、Y值和S值分別在29、29、19位點，分別為0.415、0.610、0.933，預(yù)測含有信號肽，切割位點位于32～33氨基酸殘基之間。

圖3 LacA（A）和LacB（B）的信號肽預(yù)測Fig. 3 Prediction of signal peptide

2.1.6 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果

二級結(jié)構(gòu)中LacA以無規(guī)則卷曲為主，α-螺旋、β-折疊、無規(guī)則卷曲分別占23.94%、19.72%、56.34%；LacB以無規(guī)則卷曲為主，β-折疊和無規(guī)則卷曲的比例分別為37.66%、62.34%。結(jié)果顯示LacA和LacB具備抗菌肽二級結(jié)構(gòu)的特點[22]。

利用Espasy工具中的SWISS-MODLE軟件對干酪乳桿菌細菌素LacA和LacB蛋白的三維立體結(jié)構(gòu)進行在線預(yù)測，如圖4所示。LacA主要由兩端松散肽鏈和中間的α-螺旋構(gòu)成（圖4A），α-螺旋結(jié)構(gòu)中存在GxxxG結(jié)構(gòu)域[23-24]，LacB有兩個反向的β-折疊和一個α-螺旋，并且兩個β-折疊由一段松散肽鏈組成的鉸鏈區(qū)連接（圖4B）。

圖4 LacA（A） 和LacB（B）的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig. 4 Predicted tertiary structure of bacteriocin

2.2 氨基酸定點突變

2.2.1 突變載體的PCR擴增

圖5 細菌素突變載體PCR擴增結(jié)果Fig. 5 Results of PCR amplification of mutant bacteriocin

圖6 細菌素突變載體1（A）和突變載體2（B）測序結(jié)果Fig. 6 Sequence of mutant plasmid vectors

分別以P1/P2、P3/P4為引物，用實驗已構(gòu)建好的細菌素表達載體為模板，進行細菌素突變載體的PCR擴增，如圖5所示。將突變載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中，挑選陽性克隆進行測序、比對，如圖6所示，結(jié)果表明目的蛋白突變位點發(fā)生改變，其余各點均未發(fā)生改變，說明突變載體構(gòu)建成功。

2.2.2 細菌素突變體的誘導(dǎo)表達

圖7 細菌素突變體1誘導(dǎo)表達Fig. 7 SDS-PAGE analysis of induced expression of mutant bacteriocin 1

以突變體1為代表，如圖7所示，表明已成功誘導(dǎo)表達出突變體細菌素蛋白，氨基酸定點突變沒有改變其表達條件與特性。經(jīng)SDS-PAGE鑒定，誘導(dǎo)的重組蛋白增加一條47 ku的蛋白條帶，正好是空載體和目的蛋白之和，說明重組蛋白能在大腸桿菌BL21中成功表達，氨基酸定點突變沒有改變其表達條件與特性。

2.2.3 細菌素突變體的純化

圖8 突變體1細菌素純化SDS-PAGEFig. 8 SDS-PAGE analysis of purified recombinant mutant bacteriocin 1

將誘導(dǎo)表達出的突變體細菌素按1.3.3節(jié)方法進行純化，加入凝血酶切除GST標(biāo)簽，通過洗脫液將目的蛋白從純化柱上洗脫下來，如圖8所示。泳道2與未突變的重組細菌素基本一致，凝血酶切掉了大部分GST標(biāo)簽，但仍有部分帶標(biāo)簽的突變體細菌素沒有被完全切開。經(jīng)牛血清白蛋白濃度測定，突變體1和2的質(zhì)量濃度分別為1.78 mg/mL和1.82 mg/mL，與未突變重組細菌素質(zhì)量濃度很接近，說明氨基酸定點突變未影響突變體細菌素的表達。

2.2.4 細菌素突變體的抑菌活性

表2 牛津杯瓊脂擴散法檢測突變體細菌素抑菌活性Table 2 Antimicrobial spectrum and activity of mutant bacteriocins

采用牛津杯瓊脂擴散法檢測突變體細菌素抑菌活性，結(jié)果如表2所示。正常未突變的細菌素對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有明顯的抑菌活性，而突變體1和2對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均無明顯的抑菌圈。結(jié)果表明，兩個突變體均因為氨基酸的定點突變而失去了抑菌活性。

表3 血球計數(shù)板計數(shù)法檢測突變體細菌素抑菌活性Table 3 Antibacterial activity of mutant bacteriocins

采用血球計數(shù)板計數(shù)法檢測突變體細菌素對抑菌活性的影響，以不加細菌素作為陰性對照，如表3所示。結(jié)果表明，突變體1和2這兩組的活菌數(shù)顯著大于正常細菌素組，與陰性對照組活菌數(shù)無顯著性差異，這說明本實驗所突變的兩個氨基酸均對重組細菌素的抗菌活性有關(guān)鍵性的作用，且這兩個氨基酸突變?nèi)我庖粋€均會導(dǎo)致重組細菌素失活。

3 結(jié) 論

利用生物信息學(xué)方法對基因和蛋白序列進行預(yù)測、分析，建立理論模型，尋找新型細菌素成為可能[25-27]。分析獲得干酪乳桿菌細菌素LacA蛋白具有松散-螺旋-松散的結(jié)構(gòu)，LacB蛋白具有折疊-鉸鏈區(qū)-折疊的結(jié)構(gòu)，以及明顯的跨膜區(qū)域，符合class II細菌素的結(jié)構(gòu)特征，穩(wěn)定、耐熱和疏水的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)特征是細菌素發(fā)揮抑菌作用所必需的。

通過干酪乳桿菌細菌素結(jié)構(gòu)分析，細菌素存在GxxxG結(jié)構(gòu)域，這種結(jié)構(gòu)代表跨膜螺旋[28-29]，在LacA中α-螺旋涉及GxxxG結(jié)構(gòu)，推測LacA中第38～42位氨基酸的GAVAG序列和第54～58位氨基酸的GAAIG序列均對細菌素的抑菌活性有關(guān)鍵作用。

體外定點突變技術(shù)是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的相互作用的主要方法[30]，同時也是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的基礎(chǔ)。采用氨基酸定點突變技術(shù)，選擇LacA蛋白氨基酸序列中的第40位的V和第57位的I，結(jié)果表明突變重組細菌素失去抑菌活性，無明顯抑菌效果，推測V40和I57是重組細菌素發(fā)揮抑菌活性的關(guān)鍵氨基酸位點。說明這兩個位點及其構(gòu)成的結(jié)構(gòu)域?qū)毦匕l(fā)揮抗菌活性的必要性，需要兩個關(guān)鍵位點和結(jié)構(gòu)域同時正確，細菌素才能發(fā)揮抑菌活性。

參考文獻：

[1]BOWDISH D M, DAVIDSON D J, HANCOCK R E. A re-evaluation of the role of host defence peptides in mammalian immunity[J]. Current Protein &Peptide Science, 2005, 6(1)： 35-51. DOI：10.2174/1389203053027494.

[2]DEEGAN L H, COTTER P D, HILL C. Bacteriocins： biological tools for bio-preservation and shelf-life extension[J]. International Dairy Journal, 2006, 16(9)： 1058-1071. DOI：10.1016/j.idairyj.2005.10.026.

[3]MESSAOUDI S, KERGOURLAY G, DALGALARRONDO M,et al. Purification and characterization of a new bacteriocin active against Campylobacter produced by Lactobacillus salivarius SMXD51[J]. Food Microbiology, 2012, 32(1)： 129-134. DOI：10.1016/j.fm.2012.05.002.

[4]VALENZUELA J F, PINUER L A, CANCINO A G, et al. Metabolic fluxes in lactic acid bacteria： a review[J]. Food Biotechnology, 2015,29(2)： 185-217. DOI：10.1080/08905436.2015.1027913.

[5]REVILLAGUARINOS A, GEBHARD S, ALCáNTARA C, et al. Characterization of a regulatory network of peptide antibiotic detoxification modules in Lactobacillus casei BL23[J]. Applied &Environmental Microbiology, 2013, 79(10)： 3160-3170. DOI：10.1128/AEM.00178-13.

[6]JOVANOVI? J N, NIKOLI? B, ?EATOVI? S, et al. Characterization of some potentially probiotic Lactobacillus, strains of human origin[J]. Food Science and Biotechnology, 2015, 24(5)： 1781-1788.DOI：10.1007/s10068-015-0232-7.

[7]AWAISHEH S S, ALNABULSI A A, OSAILI T M, et al. Inhibition of Cronobacter sakazakii by heat labile bacteriocins produced by probiotic LAB isolated from healthy infants[J]. Journal of Food Science, 2013, 78(9): 1416-1420. DOI:10.1111/1750-3841.12209.

[8]MILLETTE M, LUQUET F M, LACROIX M. In vitro growth control of selected pathogens by Lactobacillus acidophilus- and Lactobacillus casei-fermented milk[J]. Letters in Applied Microbiology, 2007, 44(3):314-319. DOI:10.1111/j.1472-765X.2006.02060.x.

[9]丹彤, 張和平. 乳酸菌細菌素的分類、生物合成及其應(yīng)用[J]. 中國乳品工業(yè), 2013, 41(3): 29-32. DOI:10.3969/j.issn.1001-2230.2013.03.007.

[10]SOBRINOLóPEZ A, MARTíNBELLOSO O. Use of nisin and other bacteriocins for preservation of dairy products[J]. International Dairy Journal,2008, 18(4): 329-343. DOI:10.3969/j.issn.1001-2230.2013.03.007.

[11]YANG E, FAN L, JIANG Y, et al. Antimicrobial activity of bacteriocinproducing lactic acid bacteria isolated from cheeses and yogurts[J]. AMB Express, 2012, 2(1): 1-12. DOI:10.1186/2191-0855-2-48.

[12]ZAVISIC G, PETRICEVIC S, RADULOVIC Z, et al. Probiotic features of two oral Lactobacillus isolates[J]. Brazilian Journal of Microbiology,2012, 43(1): 418-428. DOI:10.1590/S1517-83822012000100050.

[13]YANG E, FAN L, JIANG Y, et al. Antimicrobial activity of bacteriocinproducing lactic acid bacteria isolated from cheeses and yogurts[J]. AMB Express, 2012, 2(1): 1-12. DOI:10.1186/2191-0855-2-48.

[14]ROY S, MAHESHWARI N, CHAUHAN R, et al. Structure prediction and functional characterization of secondary metabolite proteins of Ocimum[J]. Bioinformation, 2011, 6(8): 315-319.DOI:10.6026/97320630006315.

[15]SALAHUDDIN P, KHAN A U. Structure function studies on different structural domains of nucleoprotein of H1N1 subtype[J].Bioinformation, 2010, 5(1): 28-30. DOI:10.6026/97320630005025.

[16]CALL E K, GOH Y J, SELLE K, et al. Sortase-deficient lactobacilli:effect on immunomodulation and gut retention[J]. Microbiology, 2015,161(2): 311-321. DOI:10.1099/mic.0.000007.

[17]XIA Y, CHU W, QI Q, et al. New insights into the quik change TM process guide the use of phusion DNA polymerase for sitedirected mutagenesis[J]. Nucleic Acids Research, 2014, 43(2): e12.DOI:10.1093/nar/gku1189.

[18]劉友華. 新型瓊脂擴散法檢測食品中天然防腐劑ε-聚賴氨酸含量[J].食品科學(xué), 2015, 36(8): 225-230. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201508042.

[19]李南薇, 李寧. 乳酸菌代謝產(chǎn)物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑制作用的研究[J]. 中國釀造, 2009, 28(5): 49-52. DOI:10.3969/j.issn.0254-5071.2009.05.015.

[20]ROJOBEZARES B, SáENZ Y, NAVARRO L, et al. Cocultureinducible bacteriocin activity of Lactobacillus plantarum strain J23 isolated from grape must[J]. Food Microbiology, 2007, 24(5): 482-491. DOI:10.1016/j.fm.2006.09.003.

[21]李芬, 孫大慶, 張麗萍. 植物乳桿菌LY-78乳酸脫氫酶基因的生物信息學(xué)分析[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(8): 102-106. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201708017.

[22]PEREA M, LUGTENBURG I, MAYOL E, et al. TMalphaDB and TMbetaDB: web servers to study the structural role of sequence motifs in α-helix and β-barrel domains of membrane proteins[J]. BMC Bioinformatics, 2015, 16(1): 266. DOI:10.1186/s12859-015-0699-5.

[23]NISSENMEYER J, OPPEGARD C, ROGNE P, et al. Structure and modeof-action of the two-peptide (class-IIb) bacteriocins[J]. Probiotics and Antimicrobial Proteins, 2010, 2(1): 52-60. DOI:10.1007/s12602-009-9021-z.

[24]OPPEGARD C, SCHMIDT J, KRISTIANSEN P E, et al. Mutational analysis of putative helix-helix Interacting GxxxG-motifs and tryptophan residues in the two-peptide bacteriocin lactococcin G[J].Biochemistry, 2008, 47(18): 5242-5249. DOI:10.1021/bi800289w.

[25]WIECKOWICZ M, SCHMIDT M, SIP A, et al. Development of a PCR-based assay for rapid detection of class IIa bacteriocin genes[J].Letters in Applied Microbiology, 2011, 52(3)： 281-289. DOI：10.1111/j.1472-765X.2010.02999.x.

[26]MACWANA S J, MURIANA P M. A ‘bacteriocin PCR array’ for identification of bacteriocin-related structural genes in lactic acid bacteria[J]. Journal of Microbiological Methods, 2012, 88(2)： 197-204.DOI：10.1016/j.mimet.2011.11.008.

[27]BORRERO J, JIMéNEZ J J, GúTIEZ L, et al. Protein expression vector and secretion signal peptide optimization to drive the production, secretion, and functional expression of the bacteriocin enterocin A in lactic acid bacteria[J]. Journal of Biotechnology, 2011,156(1)： 76-86. DOI：10.1016/j.jbiotec.2011.07.038.

[28]OPPEGARD C, ROGNE P, KRISTIANSEN P E, et al. Structure analysis of the two-peptide bacteriocin lactococcin G by introducing D-amino acid residues[J]. Microbiology, 2010, 156(6)： 1883-1889.DOI：10.1099/mic.0.038430-0.

[29]NISSENMEYER J, ROGNE P, OPPEGARD C, et al. Structurefunction relationships of the non-lanthionine-containing peptide(class II) bacteriocins produced by gram-positive bacteria[J].Current Pharmaceutical Biotechnology, 2009, 10(1)： 19-37.DOI：10.2174/138920109787048661.

[30]雒麗娜, 王盛, 王玉炯. 利用重疊延伸PCR技術(shù)進行定點突變研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 40(10): 719-722. DOI:10.3969/j.issn.1009-4229-B.2012.04.009.